Short interfering RNA(siRNA)는 특별한 gene의 발현을 막는데 사용될 수 있고 그 gene의 기능과 치료의 적용에 많은 가능성을 가지고 있지만, 효과적인 siRNA를 디자인하는 방법은 아직까지 명확하지 않다. 효과적인 siRNA는 서열적인 경향을 가지고 있는데 낮은 G/C content, Sense strand의 3' 끝에 적은 안정성과 1번 위치에는 G/C, 19번 위치에는 A/U의 존재 여부를 들 수 있다. 이러한 특성 말고도 최근에는 mRNA의 2차구조가 RNAi 작용에 중요한 역할을 하게 되는데 복잡한 구조(hairpin, multi loop)를 가지고 수소결합을 많이 하여 안정한 상태에 있는 부분은 siRNA의 기능을 크게 줄어들게 한다. 또한, siRNA가 특정한 mRNA에 작동하도록 BLAST 검색을 하여 부작용의 가능성을 배제한다.
Short interfering RNA(siRNA)는 특별한 gene의 발현을 막는데 사용될 수 있고 그 gene의 기능과 치료의 적용에 많은 가능성을 가지고 있지만, 효과적인 siRNA를 디자인하는 방법은 아직까지 명확하지 않다. 효과적인 siRNA는 서열적인 경향을 가지고 있는데 낮은 G/C content, Sense strand의 3' 끝에 적은 안정성과 1번 위치에는 G/C, 19번 위치에는 A/U의 존재 여부를 들 수 있다. 이러한 특성 말고도 최근에는 mRNA의 2차구조가 RNAi 작용에 중요한 역할을 하게 되는데 복잡한 구조(hairpin, multi loop)를 가지고 수소결합을 많이 하여 안정한 상태에 있는 부분은 siRNA의 기능을 크게 줄어들게 한다. 또한, siRNA가 특정한 mRNA에 작동하도록 BLAST 검색을 하여 부작용의 가능성을 배제한다.
Shot interfering RNA (siRNA) can be used to silence specific gene expression and have many potential therapeutic applications. However, how to design an effective siRNA is still not clear. Highly effective siRNA has sequence-specific properties which are low G/C content, low internal stability at th...
Shot interfering RNA (siRNA) can be used to silence specific gene expression and have many potential therapeutic applications. However, how to design an effective siRNA is still not clear. Highly effective siRNA has sequence-specific properties which are low G/C content, low internal stability at the sense strand 3'-terminus, sense strand base bias(position 1 is G/C, position 19 is /AU). Recently, mRNA secondary structure playsan important role in RNAi. Target site of siRNA in high-ordered structure (i.e hairpin loop, multi loop) or base pair of many hydrogen bonds dramatically reduce function of siRNA mediated gene silencing. Possible off-target effects of siRNA is detecting from BLAST search.
Shot interfering RNA (siRNA) can be used to silence specific gene expression and have many potential therapeutic applications. However, how to design an effective siRNA is still not clear. Highly effective siRNA has sequence-specific properties which are low G/C content, low internal stability at the sense strand 3'-terminus, sense strand base bias(position 1 is G/C, position 19 is /AU). Recently, mRNA secondary structure playsan important role in RNAi. Target site of siRNA in high-ordered structure (i.e hairpin loop, multi loop) or base pair of many hydrogen bonds dramatically reduce function of siRNA mediated gene silencing. Possible off-target effects of siRNA is detecting from BLAST search.
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제안 방법
우선 디자인할 gene 의 mRNA 2차 구조를 ZukerFs Mfold software를 틍하여 예측한다. [15] 예측한 결과를 틍해 3가지를 고려하였는데 opened base pair의 수, local free energy, mRNA가 가진 2 차 구조를 도입하였다. Opened base pair의 수는 base가 서로 수소결합 했는지를 판단하고 Vienna RNA 표시법 [그림 3] 을 이용하여 siRNA가 될 부분에 base.
보았다. [표2] 그래서 나온 siRNA 후보들 중에서 밝혀진: siRNA/} 결과에서 나오는지를 확인하고 다른 웹에서 제공 하주고 있는 siRNA 디자인 도구들과 비교하였다. [1 기
이들은 다양한 개수를 가지고 있기 때문에 19개의 길이만을 가진 것들로 추려서 모았는데 21개의 길이는 Tuschl et. el 규칙을 따라서 처옴이 AA로 시작하거나 끝이 TT로 끝나는 부분을 잘라서 모았고 23개 길이는 처옴이 AA로 시작하고 끝이 IT로 끝나거나 끝이 TITT로 끝나는 부분을 잘라서 462개의 siRNA libraiy를 완성하였다. 그리고 나서 증명된 siRNA의 서열이 어떤 특성 을 갖는지 서열의 위치별로 pattem을 분석하였다.
mRNA의 길이가 약1000개 정도 되고 밝혀진 siRNA가 2 개 이상인 것을 선택해서 만들어진 프로그램을 등해 디자인해 보았다. [표2] 그래서 나온 siRNA 후보들 중에서 밝혀진: siRNA/} 결과에서 나오는지를 확인하고 다른 웹에서 제공 하주고 있는 siRNA 디자인 도구들과 비교하였다.
al.가 효과적인 siRNA를 선택하는 규칙을 제시하였다.[2] 이 규칙은 mRNA 서열 중에서 AA로 시작하여 TT로 끝나는 부분 을 골라 19개의 nucleotide 길이를 가진 곳을 선정하고 선택된 부분이 30%~70%의 GC- content범위 안에 있어야 siRNA가 효과적인 기능을 할 수 있다고 맡한다.
[4] 이들은 2개의 서로 다른 gene의 mRNA를 목표로 하는 180%의 siRNA를 관찰하여 효과적인 기능을 가진 siRNA 의 특징 을 발견했다. 그 특징을 바탕으로 low G/C content, sense strand의 3, 끝의 low internal 안정성, inverted 서열의 반복 결함, sense strand의 위치(3, 10, 13, 19)별 선호도라는 8가지의 기준 을 마련하였다. 이러한 연구들은 단지 siRNA 자체만의 특징에 초점을 맞추었지만 다른 연구자들은 mRNA의 구조에 관심 을 갖고 siRNA에 의한 gene의 발현을 억제하는 실험을 하였다.
규칙에 잘 맞지 않는 결과를 보였다. 그래서 siRNA library를 바탕으로 서로 다른 규칙들을 융합하고 수정하여 새로운 함수를 마련하였다. 이것을 바탕으로 siRNA에 점수를 주는 방법은 표1과 같다.
이 후보들 중 가창 낮은 energy 값을 가진 5개롤 뽑아서 그 부분이 가진local free energy의평균값을 계산하였다. 그리고 가상 작은 free energy를 가진 구조에서 형성되는 RNA secondary structure의 정보를 모아각 base가 어떤 loop롤 형성하는지 찾는 알그리즘을 적용하였다. [그림 4]그 결과를 토대로 위에서 말한 siRNA의 효과에 큰 영향을 주는 Hairpin 구조와 repelling loop가 될 여지가 있는 Multi-loop 구조를 형성하는 부분은 제거하였다.
el 규칙을 따라서 처옴이 AA로 시작하거나 끝이 TT로 끝나는 부분을 잘라서 모았고 23개 길이는 처옴이 AA로 시작하고 끝이 IT로 끝나거나 끝이 TITT로 끝나는 부분을 잘라서 462개의 siRNA libraiy를 완성하였다. 그리고 나서 증명된 siRNA의 서열이 어떤 특성 을 갖는지 서열의 위치별로 pattem을 분석하였다. 그 결과 첫 번째 위치에 Guanosine으로 시작되는 siRNA가 반 이상을 차지하였고 A/U는 다른 위치에 비해 적게 분포하는 것을 보였다.
대상 데이터
www.mainternce.org 에서 증명된 siRNA 를 수집하여 siRNA library를 구축하였다. 이들은 다양한 개수를 가지고 있기 때문에 19개의 길이만을 가진 것들로 추려서 모았는데 21개의 길이는 Tuschl et.
데이터처리
Mfold에 의해 예측되는 구조는 서열의 길이마다 다르긴 하지 만 fis energy 값에 따라 서로 다른 구조를 가진 후보들이 평균 20개정도가 나온다. 이 후보들 중 가창 낮은 energy 값을 가진 5개롤 뽑아서 그 부분이 가진local free energy의평균값을 계산하였다. 그리고 가상 작은 free energy를 가진 구조에서 형성되는 RNA secondary structure의 정보를 모아각 base가 어떤 loop롤 형성하는지 찾는 알그리즘을 적용하였다.
이론/모형
[15] 예측한 결과를 틍해 3가지를 고려하였는데 opened base pair의 수, local free energy, mRNA가 가진 2 차 구조를 도입하였다. Opened base pair의 수는 base가 서로 수소결합 했는지를 판단하고 Vienna RNA 표시법 [그림 3] 을 이용하여 siRNA가 될 부분에 base.pair를 이루지 않는 base의 개수를 계산하였다.[16]
성능/효과
mRNA 의 2차 구조가 siRNA서열의 흑성보다 siRNA 의 활성에 중요한 역할을 한다는 사실이 많은 연구들에 의해 지지되고 있는데 Luo 와 Change 목표가 되는 mRNA 부분 마다 수소결합의 확률을 계산하여 그것을 바탕으로 수소결합을 하지 않아 unpaired nucleotide 의 수가 많을수록 siRNA의 효과가 커진다는 것을 제시하였다. [13] 앞의 관계를 더 발전시켜 base.
그리고 나서 증명된 siRNA의 서열이 어떤 특성 을 갖는지 서열의 위치별로 pattem을 분석하였다. 그 결과 첫 번째 위치에 Guanosine으로 시작되는 siRNA가 반 이상을 차지하였고 A/U는 다른 위치에 비해 적게 분포하는 것을 보였다. 다른 위치에서는 첫 번째 위치처 럼 눈에 띄는 pattem을 보이지는 않았지만 상대적으로 base마다 약간의 차이를 보였다.
첫 번째, 낮eG/C content는 예전부터 효과적인 siRNA si- lencing에 필수적인 조건이 되어왔다. 높은 G/C content의 siRNA duplex는 서로 강한 결합을 갖고 있기 때문에 한 strand로 분리되기에 열역학적으로 뷸리하고 흑히, RNAi 과정에 관여하는 RISC와의 결합에 방해를 받는다.
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