[논문]Glucagon과 insulin이 glutathione 항상성에 미치는 영향: 세포신호전달체계 및 glutathione transport system의 역할

김봉희; 오정민; 윤강욱; 김충현; 김상겸

Glucagon과 insulin이 glutathione 항상성에 미치는 영향: 세포신호전달체계 및 glutathione transport system의 역할
Effects of Glucagon and Insulin on Glutathione Homeostasis: Role of Cellular Signaling Pathways and Glutathione Transport System 원문보기

환경독성학회지 = Journal of environmental toxicology, v.22 no.3, 2007년, pp.227 - 233

김봉희 (충남대학교 약학대학, 충남대학교 형질전환 복제돼지 센터) , 오정민 (충남대학교 약학대학, 충남대학교 형질전환 복제돼지 센터) , 윤강욱 (충남대학교 약학대학, 충남대학교 형질전환 복제돼지 센터) , 김충현 (충남대학교 약학대학, 충남대학교 형질전환 복제돼지 센터) , 김상겸 (충남대학교 약학대학, 충남대학교 형질전환 복제돼지 센터)

Abstract ▼ AI-Helper

It has been reported that hepatic glutathione (GSH) levels are decreased in diabetic patients, and glucagon increases hepatic efflux of GSH into blood. The signaling pathways responsible for mediating the glucagon effects on GSH efflux, however, are unknown. The signaling pathways involved in the regulation of GSH efflux in response to glucagon and insulin were examined in primary cultured rat hepatocytes. The GSH concentrations in the culture medium were markedly increased by the addition of glucagon, although cellular GSH levels are significantly decreased by glucagon. Insulin was also increased the GSH concentrations in the culture medium, but which is reflected in elevations of both cellular GSH and protein. Treatment of cells with 8-bromo-cAMP or dibutyryl-cAMP also resulted in elevation of the GSH concentrations in the culture medium. Pretreatment with H89, a selective inhibitor of protein kinase A, before glucagon addition markedly attenuated the glucagon effect. These results suggest that glucagon changes GSH homeostasis via elevation of GSH efflux, which may be responsible for decrease in hepatic GSH levels observed in diabetic condition. Furthermore, the present study implicates cAMP and protein kinase A in mediating the effect of glucagon on GSH efflux in primary cultured rat hepatocytes.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

그러나 글루카곤의 영향을 매개하는 세포 신호전달체계는 현재까지 연구되지 않았다. 본 연구의 목표는 일차 배양 랫트 간세포 실험계에서 글루카곤과 인슐린이 GSH의 efflux에 미치는 영향과 이를 매개하는 세포신호전달체계를 규명하는 것이다.
또한 본 연구실의 예비실험결과 MRP 의 억제제인 MK-5기의 전처리는 글루카곤에 의한 GSH의 배출을 유의적으로 억제하였다(data not shown). 이 결과는 글루카곤에 의한 GSH 배출의 증가가 MRP의 발현 또는 세포 내 분포의 변화와 관련이 있을 가능성을 시사하며 이를 입증하기 위한 연구가 본 연구실에서 진행 중이다.

제안 방법

Protein kinase A (PKA) 의억제제인 KT5720과 H₈₉는 DMSO에 녹여 -20℃ 에서 보관하였다. PKA 억제제는 글루카곤을 처리하기 1.5시간 전에 전처리하였다. 세포의 생존을 확인하기 위해 MTT assaye LDH (lactate dehydrogenase) assay를 수행하였다.
글루카곤에 의한 GSH 배출의 증가가 PKA에 의해 매개되는 가를 확인하기 위해 PKA의 선택적인 억제제인 H₈₉와 KT5720을 전처리하였다. H₈₉는 25μM까지 MTT나 LDH의 활성에 변화를 유발하지 못하였으나 KT5720의 전처리는 1 UM에서 14 시간부터 유의적인 MTT 의 감소와 LDH 의 증가를 유발하였다(data not shown).
글루카곤에 의한 GSH 배출의 증가가 cAMP에의해 매개되는 가를 확인하기 위해 세포 투과성 cAMP 유도체 인 DB-cAMP와 Br-cAMP를 1, 5, 10 및 25 |1M로 세포배양액에 처리하였다 (Fig. 2). DB- cAMP 와 Br-cAMP는 100|iM까지 MTT 및 LDH로평가된 세포독성에 유의적인 변화를 유발하지 않았다(data not shown).
0065 nmol/min/106 cells로 J보고하였다. 이실험에서 정상적인 세포의 GSH 값은 100-150 nmol/106 cells로 GSH efflux에서 GSH의 Km 값과유사하였다. 이 결과는 세포에서 GSH의 배출이 세포의 GSH 양에 의존적임을 시사한다.
간세포를 60mm 배양접시에 3 X It* cells로 가하고 IpiM의 인슐린이 첨가된 배지에서 4시간 동안 배양하여 간세포를 배양접시에 부착시켰다. 인슐린이 없는 배지로 2회 세척하여 미부착된 세포와 인슐린을 제거하고 2시간 동안 안정시킨 후 인슐린, 글루카곤, Br-cAMP 또는 DB-cAMP를 처리하였다. Protein kinase A (PKA) 의억제제인 KT5720과 H₈₉는 DMSO에 녹여 -20℃ 에서 보관하였다.
일차 배양 랫트 간세포 실험계에서 글루카곤과 인슐린이 GSH의 efflux에 미치는 영향을 세포배양 배지에서 GSH의 농도를 시간별로 측정하여 평가하였다(Fig. 1). 배양에 사용하지 않은 세포배양 배지인 Chee's medium에서는 GSH가 검출되지 않았다(data not shown).

대상 데이터

(Princeton, NJ)에서 구입하였다. Collagenase (type I)은 Worthington Biochemicals (Freehold, NJ)에서, vitrogen (95 — 98% type I collagen, 2 — 5% type Ⅲ collagen)은 Cohesion Technologies Inc. (Palo Alto, CA)에서 구입하였다. H₈₉와 KT5720은 Calbiochem (La Jolla, CA)에서 Glucagon, 8-bromo-cAMP (Br-cAMP), dibutyryl- cAMP (DB-cAMP)과 기타 시 약은 Sigma-Aldrich (St.
(Palo Alto, CA)에서 구입하였다. H₈₉와 KT5720은 Calbiochem (La Jolla, CA)에서 Glucagon, 8-bromo-cAMP (Br-cAMP), dibutyryl- cAMP (DB-cAMP)과 기타 시 약은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)에서 구입하였다.
Modified Chee's medium과 L-glutaminee Invit- rogen (Carlsbad, CA)에서 인슐린은 Novo Nordisk Pharmaceuticals Inc. (Princeton, NJ)에서 구입하였다. Collagenase (type I)은 Worthington Biochemicals (Freehold, NJ)에서, vitrogen (95 — 98% type I collagen, 2 — 5% type Ⅲ collagen)은 Cohesion Technologies Inc.

데이터처리

실험결과의 재현성은 2~4 회의 간세포 분리를 통하여 확인하였다. 모든 실험 결과는 평균土표준편차로 표시하였다.
실험군 사이의 통계적 차이는 analysis of variance-^ Newman-Keuls multiple comparison test (P <0.05)로 검사하였다. 실험결과의 재현성은 2~4 회의 간세포 분리를 통하여 확인하였다.

이론/모형

GSH는 O-phthalaldehyde로유도체화하고 형광검출기와 C₁₈ 컬럼을 장착한 HPLC를 사용하여 분리 및 정량하였다. 단백질 함량은 bovine serum albumin을 표준물질로 사용하여 BCA (bicinchoninic acid) 방법으로 정량하였다.
세포의 GSH 함량은 전에 보고된 방법을 사용하였다(Kim et al., 2005; Kim et al., 2006b). 세포를 6% perchloric acid에서 긁어 1.
5시간 전에 전처리하였다. 세포의 생존을 확인하기 위해 MTT assaye LDH (lactate dehydrogenase) assay를 수행하였다.

성능/효과

IB). GSH의 배출속도를 계산하면 대조군의 값은 0.51 ±0.03 nmol /hr/mg protein 이었으며 이 값은 글루카곤을 1, 10, 25 그리고 100 nM로 증가시켰을 경우 각각 0.58 ± 0.04, 0.74 ±0.07, 0.79±0.05 그리고 0.94土 0.05 nmol/hr/mg protein로 증가하였다. 반면 세포에서 GSH의 농도는 대조군에서 31.
, 2003b, 2006a). PKA의 선택적인 억제제인 H₈₉와 cAMP 의 세포 투과성 유사체인 DB-cAMP와 Br-cAMP 를 이용한 본 연구에서 글루카곤에 의한 GSH의배출 증가 역시 cAMP와 PKA에 의해 매개되는것으로 관찰되었다. GSH의 배출증가는 세포에서 GSH의 함량을 감소시키며 결과적으로 산화적 손상에 세포가 민감하게 반응하게 한다.
01 nmol/ hr/mg protein로 감소하였다. 간세포에서 GSH의 함량은 대조군과 100 nM 글루카곤 처 리군에서 각각 32.1 ±0.6과 26.7 ±0.5 nmol/mg protein 이 었으며 H₈₉를 1, 10 또는 25|1M로 전처리하고 100 nM의글루카곤을 처리하였을 때 28.2±1.8, 30.8 ±0.7과 32.1 ±0.9 nmol/mg protein로 증가하였다. KT5720은 0.
04 nmol/hr/mg protein로 유의적인 차이가 없었다. 간세포에서 측정된 GSH의 농도는 대조군에서 30.7 ±1.9 nmol/mg protein 이 었으며 이 값은 인슐린의 농도가 0.1, 1, 10 그리고 100 nM로 증가함에 따라 각각 30.4±2.2, 33.4±0.3, 38.9±0.6 그리고 38.3±2.8 nmol/mg protein으로 인슐린의 농도에 의존적인 증가가 관찰되었다. 따라서 인슐린에 의한 세포배양배지에서 GSH의 증가는 단백질 함량의 증가와 세포에서 GSH 합성 증가의 반영으로 보인다.
, 2005). 또한 본 연구실의 예비실험결과 MRP 의 억제제인 MK-5기의 전처리는 글루카곤에 의한 GSH의 배출을 유의적으로 억제하였다(data not shown). 이 결과는 글루카곤에 의한 GSH 배출의 증가가 MRP의 발현 또는 세포 내 분포의 변화와 관련이 있을 가능성을 시사하며 이를 입증하기 위한 연구가 본 연구실에서 진행 중이다.
06 nmol/hr/mg protein로증가하였다. 반면 간세포에서 GSH의 함량은 대조군에서 3L7 ±0.6 nmol/mg protein이었으며 이 값은 Br-cAMP의 농도가 1, 5, 10 그리고 25|1M로 증가함에 따라 31.7±1.6, 30.2±0.7, 26.1 ±1.2 그리고 26.0±0.7 nmol/mg protein으로 감소하였다. 이 결과는 글루카곤에 의한 GSH의 배출 증가 및 세포에서 GSH의 감소가 cAMP에 의해 매개됨을 시사한다.
05 nmol/hr/mg protein로 증가하였다. 반면 세포에서 GSH의 농도는 대조군에서 31.7±0.6 nmol/mg protein 이었으며 글루카곤의 농도가 1, 10, 25 그리고 100nM로 증가함에 따라 31.0±2.3, 27.7±1.2, 27.6±1.6 그리고 26.5±1.0 nmol/mg protein으로 감소하였다. 이 결과는 글루카곤이 세포배양 배지에서 GSH의 농도를 증가시키며 반면 세포에서는 감소시킴을 보인다.
이 결과는 세포에서 GSH의 배출이 세포의 GSH 양에 의존적임을 시사한다. 이 결과는본 연구에서 관찰된 인슐린 처리 후 24시간에 세포 배양배지에서 증가한 GSH는 세포에서 GSH 농도증가와 단백질의 증가를 반영한 것으로 보인다. 반면 글루카곤은 배지에서와는 달리 세포에서 GSH 농도를 감소시 켰다.
이 결과는 글루카곤이 세포배양 배지에서 GSH의 농도를 증가시키며 반면 세포에서는 감소시킴을 보인다. 종합적으로 인슐린과 글루카곤은 세포에서 상반된 방향으로 GSH의 농도를 변동시키며 글루카곤은 간세포에서 세포배양액으로 GSH 의 배출을 증가시켰다.

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