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문제 정의
- 따라서 물리화학적 처리에 의하여 우모를 처리하고 있으나 이 방법은 환경오염을 유발한다. 따라서 본 연구에서는 환경친화적 우모 분해 공정을 개발하고, 우모 분해산물의 식물 성장을 위한 비료로서의 가치를 평가하기 위하여 퇴비화 볏짚에서 케라틴 분해효소 생성능이 우수한 균주인 RS7을 분리하였다. RS7의 생화학적 특성과 16S rDNA의 염기 서열을 분석하여 동정한 결과, Bacillus pumilus RS7로 동정되었다.
- 따라서 본 연구에서는 환경친화적인 미생물 기원의 비료 제제 개발을 위하여 중온 환경에서 높은 우모분해 활성을 가지는 미생물을 국내 자연환경으로부터 분리 및 동정함으로서 새로운 토착 생물자원을 확보하고자 하였으며, 물리화학적 방법에 의한 우모 분해산물과 미생물에 의한 우모 분해 산물의 식물 성장효과를 비교함으로서 미생물 비료로서의 적용 가능성을 타진하였다.
제안 방법
- 최종 선정된 실험균주의 분류학적인 위치를 검토하기 위하여 형태학적, 배양적, 생화학적인 특성을 조사하였다"). API kit (Biomerieux, France)를 이용하여 얻어진 생화학적 특성들을 APILAB 데이터베이스에 있는 분류군들의 생화학적 특성과 비교하여 1차적으로 분류학적 유사성을 검토하였다.
- 02%, MgCb . 6H2O 0.01% 및 yeast ex tract 0.01% (pH 7.5)이었으며, 케라틴 공급원으로 닭의 우모를 첨가하였다©;
- API kit (Biomerieux, France)를 이용하여 얻어진 생화학적 특성들을 APILAB 데이터베이스에 있는 분류군들의 생화학적 특성과 비교하여 1차적으로 분류학적 유사성을 검토하였다. 또한, 16S rDNA 분석을 통하여 염기 서열을 결정(2)한 후, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 GenBank 데이터베이스와 비교하였다.
- API kit (Biomerieux, France)를 이용하여 얻어진 생화학적 특성들을 APILAB 데이터베이스에 있는 분류군들의 생화학적 특성과 비교하여 1차적으로 분류학적 유사성을 검토하였다. 또한, 16S rDNA 분석을 통하여 염기 서열을 결정(2)한 후, National Center for Biotechnology Information (NCBI)의 GenBank 데이터베이스와 비교하였다.
- 온도는 22+1℃ (명 조건)과 18±1℃ (암 조건)로, 습도는 70±7%로 각각 조절하였다. 매일 충분히 관수한 후, 각 우모 분해산물을 25%로 희석하여 1일 1회, 각 pot 당 5 ml씩 뿌리를 향해 분주하였다. 우모가 첨가되지 않은 무기염 배지 또는 물을 분주한 것을 대조군으로 하였다.
- 정기적으로 우모의 분해유무를 육안으로 관찰하여 분해정도가 큰 실험구로부터 일정량의 배양액을 채취하여 skim milk agar plate에서 배양하면서 균체 생육속도가 빠르고, 직경이 큰 투명 환을 생성하는 콜로니들을 1차적으로 우모 분해 미생물로 선정하였다. 선정균주들을 각각 분리용 무기염 배지에 배양한 후, 원심분리에 의하여 균체를 제거한 배양 상등액의 keratinolytic protease 활성을 측정하여 효소활성이 가장 높은 균주를 실험 균주로 최종 선정하였다.
- 우모가 첨가되지 않은 무기염 배지 또는 물을 분주한 것을 대조군으로 하였다. 식물 성장에 미치는 영향은 생장률(성장 길이), 잎 수의 증가량, 개화율 및 잎의 건조 생체량을 측정하여 평가하였다.
- 이후 원심분리 (18, 000 rpm, 30분, 4℃)하여 상등액을 회수하였다. 실험균주에 의한 우모 분해산물은 무기염 배지에 0.1%의 우모를 첨가하여 배양하면서 실험균주에 의하여 분해가 완료된 배양액을 원심분리한 후, 상등액을 회수함으로서 조제하였다.
- 매일 충분히 관수한 후, 각 우모 분해산물을 25%로 희석하여 1일 1회, 각 pot 당 5 ml씩 뿌리를 향해 분주하였다. 우모가 첨가되지 않은 무기염 배지 또는 물을 분주한 것을 대조군으로 하였다. 식물 성장에 미치는 영향은 생장률(성장 길이), 잎 수의 증가량, 개화율 및 잎의 건조 생체량을 측정하여 평가하였다.
- 1%가 첨가된 무기염 배지에 각각 접종한 후 37℃, 200 rpm에서 회전 진탕 배양하였다. 정기적으로 우모의 분해유무를 육안으로 관찰하여 분해정도가 큰 실험구로부터 일정량의 배양액을 채취하여 skim milk agar plate에서 배양하면서 균체 생육속도가 빠르고, 직경이 큰 투명 환을 생성하는 콜로니들을 1차적으로 우모 분해 미생물로 선정하였다. 선정균주들을 각각 분리용 무기염 배지에 배양한 후, 원심분리에 의하여 균체를 제거한 배양 상등액의 keratinolytic protease 활성을 측정하여 효소활성이 가장 높은 균주를 실험 균주로 최종 선정하였다.
대상 데이터
- 경남 일대의 닭 가공 공장과 양계장 주변의 토양, 양계분뇨 및 분뇨 속에 떨어진 우모 그리고 퇴비화 중인 볏짚 등으로부터 일정량의 시료를 채취하였다. 시료 각 1 g씩을 닭 우모 0.
- 공시 식물로는 생장기간이 비교적 짧고, 개화 여부 확인이 가능한 해바라기 (Helianthus sannuus L.)를 선정하였다. 실험에 사용된 토양은 펄라이트, 버미큘라이트와 피트모스를 건조 상태에서 1 : 1 : 1 (w/w/w)로 혼합한 것이었다.
- 사용된 skim milk agar 배지의 조성은 tryptone 1%, yeast extract 0.5%, skim milk 5%, NaCl 0.5% 및 agar 2% (pH 7.5)이었다. 분리용 무기염 배지의 조성은 NHQ 0.
- )를 선정하였다. 실험에 사용된 토양은 펄라이트, 버미큘라이트와 피트모스를 건조 상태에서 1 : 1 : 1 (w/w/w)로 혼합한 것이었다. 이것은 영양물질이 전혀 포함하고 있지 않는 인공토양으로서, 가볍고 뿌리를 적당하게 지지하면서도 공기유통, 배수성, 흡습성 등을 골고루 갖추고 있다0 혼합된 토양을 각 플라스틱 pot에 일정량을 첨가하여 충분히 관수하였다.
이론/모형
- 효소반응을 위한 기질인 soluble keratine Wawrzkiewicz et al.甘)의 방법을 이용하여 조제하였다. Soluble keratin을 이용한 효소 활성 측정 방법은 다음과 같다.
성능/효과
- 무기염 배지에서 형성된 colony는 불투명한 pale yellow를 나타내었다. API kit 50CHB와 20E를 이용하여 동정한 결과, 실험균주는 Bacillus pumilus와 가장 유사하였다 (data not shown). 보다 정확한 동정을 위하여 실험균주의 16S rDNA 염기 서열을 분석한 후 NCBI GenBank에 등록된 유사 균주들과 유전자간의 상관성을 알아본 결과, Bacillus pumilus와 100%의 상동성을 가지고 있었다 (Fig.
- 건조 생체량은 잎의 넓이와 두께를 포함하는 값이다. B. pumilus RS7에 의한 우모 분해 산물을 분주한 실험군의 총 건조 생체량은 2.6 g으로서, 화학적 방법에 의한 분해산물을 분주한 실험군 (2.2 g)보다 1.2배 정도 높았다. 또한 물을 분주한 대조군 (0.
- B. pumilus RS7에 의한 우모 분해산물을 분주한 실험군의 잎 수 총 증가량은 6.7개로서, 화학적 방법에 의한 분해산물을 분주한 경우 (5.6개)보다 약 1.2배 높게 나타났으며, 물을 분주한 대조군 (2.3개)보다 3배 정도 높았다 (Fig. 5).
- 따라서 본 연구에서는 환경친화적 우모 분해 공정을 개발하고, 우모 분해산물의 식물 성장을 위한 비료로서의 가치를 평가하기 위하여 퇴비화 볏짚에서 케라틴 분해효소 생성능이 우수한 균주인 RS7을 분리하였다. RS7의 생화학적 특성과 16S rDNA의 염기 서열을 분석하여 동정한 결과, Bacillus pumilus RS7로 동정되었다. B.
- 3). 따라서 실험균주를 B. pumilus RS7이라고 명명하였다.
- Bacillus licheniformis PWD-1은 50℃에서 10일 만에 우모를 완전히 분해'"하며, Streptomyces pactum DSM40530은 50 ℃ 에서 부분적으로 우모를 분해하는 것⑸으로 보고되어 있다. 따라서, RS7 균주의 우모 분해능이 보다 우수하며, 또한 30℃ 에서 우모를 완전히 분해할 수 있었으므로 우모 가공 시 고온성 우모 분해균주들보다 에너지를 절약할 수 있을 것으로 판단되었다.
- 추정되었다. 또한 본 균주에 의한 우모 분해 산물은 화학적 방법에 의한 우모 분해산물보다 식물 성장 촉진을 위한 비료로서의 역할을 보다 효율적으로 수행할 수 있었음을 알 수 있었다. 앞으로 우모분해산물의 실제적 비료로서의 가능성을 평가하기 위하여 다양한 작물에 대한 우모 분해산물의 성장촉진 효과를 검토할 필요가 있었다.
- 6에서 보는 바와 같이 각 실험군에서 그 차이가 뚜렷이 나타났다. 물만 주었던 대조군 및 화학적 방법에 의한 우모 분해산물을 분주한 실험군에서는 배양 35일 후에도 개화되지 않았으며, 무기염 배지에서는 10%의 낮은 개화율을 보였다. 그러나 B.
- 2에서 보는 바와 같다. 배양 시간 경과에 효소 활성은 완만하게 증가하다가 배양 6일경 최대 활성 (41 U/ml)을 나타내었으며, 그 후 급격하게 효소 활성이 감소하였다. 예비실험을 통하여 확립된 최적 무기염 배지에서 배양 18시간 경 가장 높은 keratinolytic activity를 보였고, 36시간 만에 우모가 완전히 분해되었다 (data not shown).
- 배양 시작 시점에서 종료 시점까지의 총 생장률 (total increasing hight) 의 경우, B. pumilus RS7에 의한 우모 분해산물을 분주한 실험군이 화학적 방법에 의한 분해산물을 분주한 실험군보다 1.7 cm 정도 길었으며, 대조군에 비해 3.5 cm 정도 길었다(Fig. 4).
- API kit 50CHB와 20E를 이용하여 동정한 결과, 실험균주는 Bacillus pumilus와 가장 유사하였다 (data not shown). 보다 정확한 동정을 위하여 실험균주의 16S rDNA 염기 서열을 분석한 후 NCBI GenBank에 등록된 유사 균주들과 유전자간의 상관성을 알아본 결과, Bacillus pumilus와 100%의 상동성을 가지고 있었다 (Fig. 3). 따라서 실험균주를 B.
- 배양 시간 경과에 효소 활성은 완만하게 증가하다가 배양 6일경 최대 활성 (41 U/ml)을 나타내었으며, 그 후 급격하게 효소 활성이 감소하였다. 예비실험을 통하여 확립된 최적 무기염 배지에서 배양 18시간 경 가장 높은 keratinolytic activity를 보였고, 36시간 만에 우모가 완전히 분해되었다 (data not shown).
- 본 균주에 의한 우모 분해산물은 Helianthus sannuus L.의 생장율, 잎 수 증가량, 개화율, 건조 생체량에 있어 대조군과 화학적 우모 분해 산물보다 우수하였다. Bacillus pumilus RS7에 의한 우모 분해산물은 식물 성장 촉진을 위한 미생물 기원 비료로써의 역할을 수행할 수 있었으며, 이에 따라 양계산업에서 배출되는 우모 폐기물이 환경에 주는 악영향을 감소시킬 수 있을 것으로 예측된다.
- 지금까지 우모 분해산물의 비료로서의 가능성을 검토한 연구 결과들이 거의 없었으므로 다른 연구 결과들과 비교할 수 없었지만 본 실험의 결과를 종합해 본건더L 우모 분해산물은 식물의 성장을 위한 영양원으로 충분히 활용될 수 있었음을 확인하였다.
후속연구
- 의 생장율, 잎 수 증가량, 개화율, 건조 생체량에 있어 대조군과 화학적 우모 분해 산물보다 우수하였다. Bacillus pumilus RS7에 의한 우모 분해산물은 식물 성장 촉진을 위한 미생물 기원 비료로써의 역할을 수행할 수 있었으며, 이에 따라 양계산업에서 배출되는 우모 폐기물이 환경에 주는 악영향을 감소시킬 수 있을 것으로 예측된다.
- 또한 본 균주에 의한 우모 분해 산물은 화학적 방법에 의한 우모 분해산물보다 식물 성장 촉진을 위한 비료로서의 역할을 보다 효율적으로 수행할 수 있었음을 알 수 있었다. 앞으로 우모분해산물의 실제적 비료로서의 가능성을 평가하기 위하여 다양한 작물에 대한 우모 분해산물의 성장촉진 효과를 검토할 필요가 있었다.
- 그러나 물리화학적 처리 공정 중 폐수 및 악취가 대량 발생함으로써 환경오염이 유발되며, 처리비용이 높아 경제성이 낮은 것으로 알려져 있다施. 이러한 우모 처리공정의 비효율성을 고려해 볼 때, 효소 및 미생물과 같은 생물 촉매를 이용한 보다 효율적이고 환경친화적인 우모처리기술에 대한 연구가 필요함을 알 수 있다.
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