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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 유전자치료에 많이 이용되는 복제능력이 결여된 아데노바이러스를 매개로 하여 tumor suppressor 유전자인 p53을 삽입한 아데노바이러스 벡터를 제조하여 이를 투여시 생식장기를 포함한 주요 장기조직에서의 분포, 지속성, 삽입외부유전자 변화량(clearance) 및 germ cell 등을 통한 차세대로의 전달 가능성 등에 대해 조사하였다.
제안 방법
- 1.8 kbp의 human p53 cDNA를 pShuttle-CMVpA의 multiple cloning region의 BgHI site에 삽입시켜 pShuttle-CMV-p53을 만들었다. pShuttle-CMV-p53 (혹은 pShuttle-CMV-B-gal)와 아데노바이러스 벡터 pJM17을 바이러스 생산 세포주인 293 cell에 calcium phosphate method로 co-transfection시켜 plaques0] 형성되면 그 배지를 1x10L1x10'3까지 단계별로 희석하여 293 cell 이 배양중인 96 well plate에 각각 1 μ1 씩 감염시켰다.
- Digoxigenin이 표지 된 증폭 PCR 산물은 alkaline phosphate anti- digoxigenin (1:200)으로 37, C에서 2시간 반응시키고 nitroblue tetra- zolium과 5-bromo-4-chloro-3-indophosphatase (NBT/BCIP, Boeringer Manheim, Germany)로 발색시켜 확인하였다. 음성대조로 Taq polymerase 또는 probe가 결여된 것을 사용하였다.
- Germ-line transmission study를 위해서 Balb/c 암 , 수 마우스를 마리당 IxlO9 PFUe] 농도로 각각 5마리의 마우스 등쪽 및 복강 부위를 절개하여 ovary 및 rete testis내에 직접 주사한 후 다시 봉합한 후 암컷은 21일째, 수컷은 25일째 되는 날 교배시켜 다음날 아침 질전(vaginal pkig)이 확인된 암컷을 임신 0일로 하였다. 임신 12일째에 마우스의 자궁을 적출하여 멸균한 PBS가 담긴 petri dish에 옮긴 후, 배자를 꺼내어 eppendorf tube에 담아 homogenization 시킨 후, DNeasy tissue kit (Qiagen, USA)을 이용하여 DNA를 분리하였다.
- 최종적으로 CsCl density gradient ultracentrifuga- tion을 통해 농축 후 dialysis하여 바이러스를 정제하고 20% 이ycerol를 첨가하여 -7(TC에 보관하였다. PCR방법으로 replication- competent adenovirus (RCA) assay를 실시하여 RCA-negative clone을 재확인하였다.
- Plaque-formation assay를 실시하여 Ad-CMV-p53 및 Ad-CMV- 에 대해 각각 1.31X109 PFU/gl, 6.78x109 PFU/|뇌의 titer# 결정하였다.
- Real-time PCR로 투여 후 장기 내에 잔류하는 p53 및 0・gal의 cDNA양은 각 copy number에서 exponential하게 PCR 산물을 형성하는 threshold cycle number (Ct)를 기준으로 한 standard c나rve를 만들어 측정하였다.
- pShuttle-CMV-p53 (혹은 pShuttle-CMV-B-gal)와 아데노바이러스 벡터 pJM17을 바이러스 생산 세포주인 293 cell에 calcium phosphate method로 co-transfection시켜 plaques0] 형성되면 그 배지를 1x10L1x10'3까지 단계별로 희석하여 293 cell 이 배양중인 96 well plate에 각각 1 μ1 씩 감염시켰다. Replication- competent adenovirus (RCA)가 없는 바이러스를 선택하기 위하여 single plague가 형성된 well의 배지에 대하여 RCA assay (replication-competent adenovirus assay)를 실시한 후 선택된 well의 배지를 150 mm culture dish에 배양중인 293 cell에 감염 시켜 아데노바이러스를 증식하여 Ad-CMV-p53과 Ad-CMV-B-gal 을 생산하였다. 최종적으로 CsCl density gradient ultracentrifuga- tion을 통해 농축 후 dialysis하여 바이러스를 정제하고 20% 이ycerol를 첨가하여 -7(TC에 보관하였다.
- 8 kbp의 human p53 cDNA를 pShuttle-CMVpA의 multiple cloning region의 BgHI site에 삽입시켜 pShuttle-CMV-p53을 만들었다. pShuttle-CMV-p53 (혹은 pShuttle-CMV-B-gal)와 아데노바이러스 벡터 pJM17을 바이러스 생산 세포주인 293 cell에 calcium phosphate method로 co-transfection시켜 plaques0] 형성되면 그 배지를 1x10L1x10'3까지 단계별로 희석하여 293 cell 이 배양중인 96 well plate에 각각 1 μ1 씩 감염시켰다. Replication- competent adenovirus (RCA)가 없는 바이러스를 선택하기 위하여 single plague가 형성된 well의 배지에 대하여 RCA assay (replication-competent adenovirus assay)를 실시한 후 선택된 well의 배지를 150 mm culture dish에 배양중인 293 cell에 감염 시켜 아데노바이러스를 증식하여 Ad-CMV-p53과 Ad-CMV-B-gal 을 생산하였다.
- 각 장기에 시간대 별로 잔류하는 Ad-CMV-p53의 양은 정제한재조합 아데노바이러스로부터 p53이 함유된 genomic DNA을 분리하여 표준곡선을 만들어 절대정량 방법으로 측정하였다. 마우스의 diploid genome size는 약 50억 bp (약 62.
- 임신 12일째의 배자에서 DNA를 분리하여 p53 및 P-gal DNA의발현 여부를 조사하였다. 교배시키기 전 투여 시기는 마우스 암컷의 난자형성과 수컷의 정자형성 기간을 고려하여 결정하였다. 그 결과, Fig.
- 마우스의 diploid genome size는 약 50억 bp (약 62.5 ng)이고, 이것을마우스의 diploid당 약 36, 000 bp인 Ad-CMV-p53(약 36, 000 bp) 의 1 copy가 약 0.448 pg에 해당되는 것을 기준으로 정하였다. 아데노바이러스를 투여하지 않은 마우스의 비장으로 분리한 genomic DNA를 diluent로 사용하여 각 100부터 0.
- Probe는 5' end에 형광 reporter dye인 FAM(6-carboxyfluorescein), 3' end에 quencher dye인 nonfluorescein을 사용하였다. 반응 조건은 50℃ 에서 2분간 UNG (Urasil-N-Glycosilase)를 활성화시키고 95T에서 10분간 방치하여 최초의 Taq activation 및 UNG을 deactivation한 후, 95℃에서 15초간 denaturation, 6CFC에서 1분간 annealing을 1회로 하여 40회 증폭시켰다.
- 한편 독성학적 관점에서 바이러스 벡터의 입자의 양이나 반감기에 대한정보는 생체내 분포에서 의도되지 않은 조직이나 부작용을 예상하는데 있어 중요한 지표로 활용할 수 있다. 본 연구에서는 IxlO5 세포 중 삽입유전자로 p53을 포함하고 있는 1개의 아데노바이러스 정도가 있어도 감지할 수 있는 감도를 가진 정량적 real-time PCR로 시간이 경과됨에 따라 조직 속에 잔류흐}는 아데노바이러스 벡터를 측정하였다. 생식장기 보다는 일반적으로 대사 및 면역 장기인 간이나 비장에 많은 양이 잔류하는 것으로관찰되었으며 7일 이후부터는 점진적으로 양이 급감하고 있음을관찰되었고 PCR 결과와도 양호한 상관성을 보여주고 있으나 시간 경과 시 잔류되는 벡터의 양을 측정하기에는 본 실험에서 사용한 real-time PCR이 정확한 정보를 제공하고 방법임을 보여주고 있다.
- 그러나 난소암이나 전립선암 치료시 투여 방법으로 직접 조직 내로 투여하는 경우 정자나 난자에 비의도적으로 오염될 가능성은 높다. 본 연구자의 선행 연구에서 1x108 역가의 아데노바이러스 벡터를 대상으로 복강 투여 후 다음 세대로의 전달가능성을 조사한 결과 13일째의 어떤 태자에서도 아데노바이러스에 삽입된 P53 유전자는 관찰되지 않아 이번 시험에서는 IxlO'pFu 농도를 직접 각각의 고환과 난소에 투여하였다. 이 경우 교미시기에 생식기관에서 바이러스 벡터는 존재하고 있으나, 생식선 전달은 되지 않는 것으로 미루어 아데노바이러스에 의한 정자의 감염은 일어나지 않음을 시사하고 있다.
- 이 기간 중 아데노바이러스를 주사한 어떠한 동물에서도 뚜렷한 임상적인 독성 증상은 관찰되지 않았다. 생식장기를 포함한 주요 장기에서 아데노바이러스 유래의 DNA 검출 및 RNA 발현 여부를 PCR과 RT-PCR로각각 확인하였다. Ad-CMV-p53을 투여한 경우, 암 .
- 암 . 수 Balb/c 마우스에 IxlO’PFU의 농도로 Ad-CMV-p- gal 혹은 Ad-CMV-p53을 복강 내에 주사한 후 1, 4, 7, 15, 30 및 60일째에 각 장기를 적출하였다. 이 기간 중 아데노바이러스를 주사한 어떠한 동물에서도 뚜렷한 임상적인 독성 증상은 관찰되지 않았다.
- 수 Balb/c 마우스에 마리당 IxlO9 PFU의 농도로 복강 내에 주사한후 1, 4, 7, 15, 30 및 60일째에 부검하여 생식장기를 포함한 주요 장기를 적출하여 DNeasy tissue kit (Qiagen, USA)을 이용하여 DNA를 분리하였으며, RNeasy mini kit (Qiagen, US A)을 이용하여 RNA를 분리하였다.
- 암세포에 대한 성장 억제 효과가 있는 것으로 알려진 p53을발현하는 아데노바이러스를 만들기 위하여 pShuttle-CMV-p53< 아데노바이러스 벡터 pJM17과 동시에 바이러스 생산 세포주인 293 cell에 co-transfbction시켜 multiple virus clone을 얻었다. 제조한 아데노바이러스를 바이러스의 replication이 가능한 packaging cell line인 293 cell에 transfection시켜 in vivo 실험을 위한 충분한 양의 바이러스를 생산하였다.
- 2 uM의 각각의 primert- 포함하는 PCR mixture를 만들었으며, 반응 조건은 95℃에서 15분간 방치하여 최초의 heat activation을 일으킨 후, 94℃에서 1분간 denaturation, 55℃에서 1분간 annealing, 721에서 1분간 extension-fir 1회로 하여, 35회 증폭시킨 후 반응 산물을 확인하기 위하여 2% agarose gel에서 전기영동 후 Uvipro (Uvutec, Cambridge, UK)를 이용하여 결과를 분석하였다. 외부유전자로 삽입한 p53 및 |3-gal을 확인하기 위해 primer sequence는 각각 5'-ATGCTGTCCCCGGACGAT-3' (forward)와 5'-GATGGG CCTCCGGTTCAT-3' (reverse), 5'-CTGCACCATTCGCGTTACG-3 (forward)와5, -GGAAGGCCAGACGCGAAT-3, (reverse)를, 외부유전자가 삽입된 부위 밖의 아데노바이러스 벡터를 확인하기 위해 5'-TCGTTTCTCAGCAGCTGrTG-3' (forward), 5'-CATCTGAAC- TCAAAAGCGTGG-3' (reverse)를 사용하였다. 한편 RCA assay 에 사용한 p-gal primer는 5'-CTGTATGAACGGrCTGGrCT-3' (forward) 와 5'-AGTCCGAAAGTGCTA-3' (reverse) 이고, RCA assay 의 El a primer로는 5'-AGCTGATCGAAGAGGTACTG-3' (forward)와 5'-GAGTCACAGCTATCCGTAC-3' (reverse)를 사용하였다.
- 임신 12일째에 마우스의 자궁을 적출하여 멸균한 PBS가 담긴 petri dish에 옮긴 후, 배자를 꺼내어 eppendorf tube에 담아 homogenization 시킨 후, DNeasy tissue kit (Qiagen, USA)을 이용하여 DNA를 분리하였다.
- 수 각각 5마리의 고환 및 난소 내로 직접주사한 후 암컷은 21일째, 수컷은 25일째 되는 날 교배시켰다. 임신 12일째의 배자에서 DNA를 분리하여 p53 및 P-gal DNA의발현 여부를 조사하였다. 교배시키기 전 투여 시기는 마우스 암컷의 난자형성과 수컷의 정자형성 기간을 고려하여 결정하였다.
- 제조한 아데노바이러스를 바이러스의 replication이 가능한 packaging cell line인 293 cell에 transfection시켜 in vivo 실험을 위한 충분한 양의 바이러스를 생산하였다. 복제 가능 바이러스 존재유무를 조사하기 위하여 replication-competent adenovirus (RCA) assay를 실시한 결과 Ad-CMV-p53 및 Ad・CMV书-gal에 대하여 replication 관련 유전자인 E"가 검출되지 않음을 확인하였다 (Fig.
- 조직에서 추출한 100 ng의 genomic DNA와 0.2 uM의 각각의 primert- 포함하는 PCR mixture를 만들었으며, 반응 조건은 95℃에서 15분간 방치하여 최초의 heat activation을 일으킨 후, 94℃에서 1분간 denaturation, 55℃에서 1분간 annealing, 721에서 1분간 extension-fir 1회로 하여, 35회 증폭시킨 후 반응 산물을 확인하기 위하여 2% agarose gel에서 전기영동 후 Uvipro (Uvutec, Cambridge, UK)를 이용하여 결과를 분석하였다. 외부유전자로 삽입한 p53 및 |3-gal을 확인하기 위해 primer sequence는 각각 5'-ATGCTGTCCCCGGACGAT-3' (forward)와 5'-GATGGG CCTCCGGTTCAT-3' (reverse), 5'-CTGCACCATTCGCGTTACG-3 (forward)와5, -GGAAGGCCAGACGCGAAT-3, (reverse)를, 외부유전자가 삽입된 부위 밖의 아데노바이러스 벡터를 확인하기 위해 5'-TCGTTTCTCAGCAGCTGrTG-3' (forward), 5'-CATCTGAAC- TCAAAAGCGTGG-3' (reverse)를 사용하였다.
- Replication- competent adenovirus (RCA)가 없는 바이러스를 선택하기 위하여 single plague가 형성된 well의 배지에 대하여 RCA assay (replication-competent adenovirus assay)를 실시한 후 선택된 well의 배지를 150 mm culture dish에 배양중인 293 cell에 감염 시켜 아데노바이러스를 증식하여 Ad-CMV-p53과 Ad-CMV-B-gal 을 생산하였다. 최종적으로 CsCl density gradient ultracentrifuga- tion을 통해 농축 후 dialysis하여 바이러스를 정제하고 20% 이ycerol를 첨가하여 -7(TC에 보관하였다. PCR방법으로 replication- competent adenovirus (RCA) assay를 실시하여 RCA-negative clone을 재확인하였다.
- 아데노바이러스를 투여하지 않은 마우스의 비장으로 분리한 genomic DNA를 diluent로 사용하여 각 100부터 0.0001 copy number (serial 10 dilution) solution을 준비하고 exponentia?하게 PCR plot이 시작되는 cycle number (Ct)를 기준으로 한 표준곡선을 작성하였다.
대상 데이터
- 6주령의 Balb/c 암 . 수 마우스를 바이오제노믹스사에서 공급받아 식품의약품안전청 동물사육시설 내에서 일정 기간 동안 순화 시켜 실험에 사용하였으며, 온도 23±3℃, 습도 55+5%, 12시간 명암주기의 사육조건을 유지하였다.
- Human embryonic kidney cell line 인 293 celle 10% fetal bovine serum을 포함하는 DMEM media를 이용하여 CO2 배양기에서 배양하여 바이러스를 증식시키는데 사용하였다.
- 6 pM template를 혼합하여 반응시켰다. Probe는 5' end에 형광 reporter dye인 FAM(6-carboxyfluorescein), 3' end에 quencher dye인 nonfluorescein을 사용하였다. 반응 조건은 50℃ 에서 2분간 UNG (Urasil-N-Glycosilase)를 활성화시키고 95T에서 10분간 방치하여 최초의 Taq activation 및 UNG을 deactivation한 후, 95℃에서 15초간 denaturation, 6CFC에서 1분간 annealing을 1회로 하여 40회 증폭시켰다.
- 6주령의 Balb/c 암 . 수 마우스를 바이오제노믹스사에서 공급받아 식품의약품안전청 동물사육시설 내에서 일정 기간 동안 순화 시켜 실험에 사용하였으며, 온도 23±3℃, 습도 55+5%, 12시간 명암주기의 사육조건을 유지하였다.
- Germany)로 발색시켜 확인하였다. 음성대조로 Taq polymerase 또는 probe가 결여된 것을 사용하였다.
이론/모형
- 본 실험에서는 생식세포(spermatocyte and oocyte), Sertoli cell, Leydig cell을 각각 분리하여 분석하고자 시도하였으나 기술적으로 분리한 세포의 purity 등의 문제점이 있어 가장 민감한 분석 방법 중의 하나인 in-situ PCR을 이용하였다. 생식장기에서의 p53 DNA의 분포위치를 분석한 결과, 고환에서 정세관 tubule 내에는 아데노바이러스 벡터가 전달되지 않으며 주로 간질 조직에서 PCR 양성 반응이 관찰되었다.
성능/효과
- 제조한 아데노바이러스를 바이러스의 replication이 가능한 packaging cell line인 293 cell에 transfection시켜 in vivo 실험을 위한 충분한 양의 바이러스를 생산하였다. 복제 가능 바이러스 존재유무를 조사하기 위하여 replication-competent adenovirus (RCA) assay를 실시한 결과 Ad-CMV-p53 및 Ad・CMV书-gal에 대하여 replication 관련 유전자인 E"가 검출되지 않음을 확인하였다 (Fig. 1).
- 교배시키기 전 투여 시기는 마우스 암컷의 난자형성과 수컷의 정자형성 기간을 고려하여 결정하였다. 그 결과, Fig. 7에 나타난 것처럼 어떠한 배자에서도 부모세대에투여한 Ad-CMV-P-gal 혹은 Ad-CMV-p53에 대한 DNA는 검출되지 않았다.
- 대조군으로 사용한 Ad-CMV-B-gal의 경우, 수컷 마우스의 생식 장기인 고환 및 부고환의 약한 signal을 제외하고는 p53의 PCR 결과와 동일한 결과를 보였다(Fig. 4). 반면, PBS를 주사한대조군 동물에서는 어떤 장기에서도 signal이 나타나지 않았다(자 료 미제시).
- 삽입한 유전자와 벡터와의 조직내 발현의 관련성을 조사하고자 아데노바이러스 벡터의 primer로 PCR한 결과 투여 후, 단시간에서는 모든 장기에서 발현되는 것으로 관찰되었으며 전립선, 간, 비장을 제외한 모든 조직에서 30일째 이후에는 발현되지 않는 것으로 확인되었다(Fig. 3).
- 본 연구에서는 IxlO5 세포 중 삽입유전자로 p53을 포함하고 있는 1개의 아데노바이러스 정도가 있어도 감지할 수 있는 감도를 가진 정량적 real-time PCR로 시간이 경과됨에 따라 조직 속에 잔류흐}는 아데노바이러스 벡터를 측정하였다. 생식장기 보다는 일반적으로 대사 및 면역 장기인 간이나 비장에 많은 양이 잔류하는 것으로관찰되었으며 7일 이후부터는 점진적으로 양이 급감하고 있음을관찰되었고 PCR 결과와도 양호한 상관성을 보여주고 있으나 시간 경과 시 잔류되는 벡터의 양을 측정하기에는 본 실험에서 사용한 real-time PCR이 정확한 정보를 제공하고 방법임을 보여주고 있다.
- 생식장기에서의 p53 DNA의 분포위치를 분석한 결과, 고환에서 정세관 tubule 내에는 아데노바이러스 벡터가 전달되지 않으며 주로 간질 조직에서 PCR 양성 반응이 관찰되었다. Ovaiy게서도 아데노바이러스 벡터는 fbllicle내의 oocyte에 전달되지 않고 stromal tissue에 존재하는 것으로 확인하였다(Fig.
- Ad-CMV-p53을 투여한 경우, 암 . 수 마우스 모두 투여 후 1일에서 4일까지는 testis, epididymis, ovary 및 uterus 등 생식장기를 포함하여 주요 장기에서 p53 DNA가 검출되었다. 30일째에는 liver, spleen을 제외한 생식장기에서는 PCR signal이 점차 감소하며 60일째에는 signal이 주요 장기에서도 나타나지 않았다(Fig.
- 위의 결과로 미루어 아데노바이러스 벡터를 복강 투여하면 간, 비장 및 폐와 같은 일반 장기에서도 주입한 외부유전자가 검출혹은 발현되며, 고환, 부고환, 정낭, 전립선, 난소 및 자궁 등의생식장기에서도 일정 기간 동안 외부유전자가 발현되는 것으로보아 다음 세대로 전달될 가능성이 있을 것으로 예상된다.
- 본 연구 결과에서도 생식장기를 포함한 주요장기에서 PCR 및 RT-PCR 결과모두 양성적인 시그널이 관찰되고 있다. 이론적으로 벡터의 프로모터가 세포내에서 활성화 되어 전달유전자를 발현하기 때문에시간 경과에 따라 동일한 발현 시그널로 나타날 것으로 예상되었지만 본 연구에서 전달유전자 발현 기간과 transduction된 벡터의 시그널 기간과는 일치되지 않고 있음을 보여주고 있다(Fig. 3). 이들 유전자 발현의 단축은 숙주 세포의 면역세포의 작용보다는 viral genome0] episomal하게 위치하고 있는 세포 내 endonuclease에 의한 영향과 관련이 있는 것으로 알려져 있다.
- 반면, PBS를 주사한대조군 동물에서는 어떤 장기에서도 signal이 나타나지 않았다(자 료 미제시). 한편, RT-PCR 결과는 시간대 별로 나타난 PCR 결과와 동일하게 8-gal의 RNA 발현이 확인되었다.
후속연구
- 이들 유전자 발현의 단축은 숙주 세포의 면역세포의 작용보다는 viral genome0] episomal하게 위치하고 있는 세포 내 endonuclease에 의한 영향과 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 약물학적 치료 역할을 상실한 벡터가 불필요하게 생체 내에 잔류한다는 것은 독성학적 영향을 유발할 수 있다는 가능성 때문에 안전성 측면에서 더 많은 연구가 진행되어야 한다. 한편 독성학적 관점에서 바이러스 벡터의 입자의 양이나 반감기에 대한정보는 생체내 분포에서 의도되지 않은 조직이나 부작용을 예상하는데 있어 중요한 지표로 활용할 수 있다.
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