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문제 정의
- 본 연구에서는 2009년 1월부터 2011년 10월까지 경기도내 급성호흡기감염증 의심환자에서 분리한 호흡기아데노바이러스의 유행양상 및 혈청형 분포양상을 조사하여 지역사회에서의 아데노바이러스의 감염 및 예방대책 수립을 위한 기초 역학 자료로 제공하고자 하였다.
- 아데노바이러스는 다양한 급성호흡기감염증을 유발하며, 대부분 영유아나 어린이, 면역기능이 저하된 환자에게서 주로 나타나는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 2009년부터 2011년까지 경기지역 소아청소년과 및 내과에 내원한 급성호흡기 감염증 의심환자를 대상으로 호흡기아데노바이러스의 유행양상 및 혈청형 분포양상을 분석하였다. 총 1,622명의 급성상기도 감염증이 의심되는 환자의 검체를 분석한 결과 102건(6.
제안 방법
- 3%)에서 아데노바이러스를 검출하였다. 102건의 아데노바이러스 양성 검체에서 세포배양법으로 76주의 아데노바이러스를 분리하였고, 혈청형별 특이유전자인 헥손 유전자의 염기서열 분석을 통하여 혈청형을 확인하였다. 최근 3년간 경기도내에서 아데노바이러스 1형부터 6형까지 6개의 다른 혈청형이 분리되었고, 이 중 3형 (n=40, 52.
- 2009년 1월부터 2011년 10월까지 검사된 검체 중 PCR 또는 real-time PCR에서 아데노바이러스로 확인된 102건에 대하여 세포배양법으로 바이러스를 분리하였다. 검체의 전처리를 위하여 검체에 penicillin (1,000 units/ml)/streptomycin (1,000 μg/ml) (Gibco, USA) 및 nystatin (1,000 units/ml) (Sigma, USA)을 첨가한 후 4℃에서 15분 간격으로 흔들어주면서 1시간 동안 방치하였다.
- 2009년 1월부터 2011년 10월까지 검사된 검체 중 PCR에서 아데노바이러스로 확인된 102건에 대하여 세포배양법으로 바이러스를 분리하고, 혈청형별 유전적 변이가 가장 많은 헥손 유전자 부위를 분석하여 혈청형을 확인하였다. 세포배양법으로 아데노바이러스를 분리한 결과, 102건의 아데노바이러스 양성 검체중 76건만이 전형적인 아데노바이러스의 세포병변을 나타내었고, 헥손 유전자 부위의 유전자 증폭이 가능했다.
- 76주의 경기도내 아데노바이러스 분리주로부터 핵산을 추출하고 헥손 유전자를 증폭, 염기서열 분석 및 BLAST 프로그램으로 가장 높은 상동성을 나타낸 혈청형을 확인하였다(Table 2). 그 결과, 아데노바이러스 1형, 2형, 3형, 4형, 5형, 6형이 확인되었으며, 그 중 3형이 40주(52.
- A549 세포는 10% FBS (Fetal bovine serum, Gibco)가 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified eagle's medium, Welgen, Korea) 배지를 사용하여 배양하였으며, 세포를 24 well 배양용기에 단층 배양한 후, 세포의 밀도가 약 70%정도 되었을 때 세포배양액을 제거하고, phosphate buffered saline buffer를 이용하여 2회 세척한 다음 전처리된 각 검체를 200 μl씩 접종하고, 2% FBS가 포함된 배양액을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 7일간 배양하며 세포병변효과(cytopathic effect; CPE)를 관찰하였다.
- PCR 산물은 1.5% agarose gel (0.5× TBE buffer)에서 전기영동하여 확인하였다.
- PCR 산물은 4% agarose gel (0.5× TBE buffer)에서 전기영동하여 확인하였고, QIAquick PCR purification kit 및 Gel extraction kit (QIAGEN)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 정제하였다.
- 검체에서 QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 핵산을 추출하였다. 아데노바이러스 분리를 위해 아데노바이러스 검출 PCR 진단키트(Solgent, Korea) 또는 real-time PCR 진단키트(Kogenebiotech, Korea)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 추출된 핵산을 첨가한 후, 유전자 증폭기(Verti 96 well Thermal Cycler, Applied Biosystems, USA) 또는 실시간 유전자 증폭기(7500 Fast Real-Time PCR System, Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다.
- 얻어진 PCR 산물을 이용하여 ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit와 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer Cetus, USA)를 이용하여 염기서열 분석을 실시하였다. 분석된 경기도내 분리주의 헥손부위 염기서열은 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)을 이용하여 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) database에 등록되어 있는 기존의 표준주 염기서열과 비교분석을 통해 가장 높은 상동성을 나타낸 혈청형을 확인하였다.
- 세포배양액에서 QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN)를 사용 하여 제조사의 방법에 따라 핵산을 추출하였고, 혈청형별 특이 유전자인 헥손 유전자의 염기서열을 분석하기 위해, 헥손 부위에 특이적인 primer인 ADV-5L (5′-CGG TGG TGI TTI AAI GGI TTI ACI TTG TCC AT-3′)과 ADV-3R(5′-ATG TGG AAI CAG GCI GTI GAC AG-3′) primer쌍을 사용하여 PCR을 실시하였다(Seo, 2008).
- 검체에서 QIAamp DNA Mini kit (QIAGEN, Germany)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 핵산을 추출하였다. 아데노바이러스 분리를 위해 아데노바이러스 검출 PCR 진단키트(Solgent, Korea) 또는 real-time PCR 진단키트(Kogenebiotech, Korea)를 사용하여 제조사의 방법에 따라 추출된 핵산을 첨가한 후, 유전자 증폭기(Verti 96 well Thermal Cycler, Applied Biosystems, USA) 또는 실시간 유전자 증폭기(7500 Fast Real-Time PCR System, Applied Biosystems)를 사용하여 분석하였다. PCR 반응조건은 95℃에서 15분간 변성시킨 후, 95℃에서 20초, 54℃에서 40초, 72℃에서 1분씩 35회 반복하고, 마지막에는 72℃에서 5분간 처리한 후 반응을 중단시켰다.
- 5× TBE buffer)에서 전기영동하여 확인하였고, QIAquick PCR purification kit 및 Gel extraction kit (QIAGEN)를 이용하여 제조사의 방법에 따라 정제하였다. 얻어진 PCR 산물을 이용하여 ABI Prism BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit와 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer Cetus, USA)를 이용하여 염기서열 분석을 실시하였다. 분석된 경기도내 분리주의 헥손부위 염기서열은 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, http://blast.
- 2009년 1월부터 2011년 10월까지 경기지역 소아청소년과 및 내과에 내원한 환자 중 인플루엔자의심환자를 포함한 급성상기도 감염증이 의심되는 환자들로부터 채취한 총 1,622건의 인후 도찰물을 대상으로 연구를 실시하였다. 환자들로부터 채취된 인후도찰물은 바이러스 수송용배지(Becton, Dickinson and Company, USA)에 넣고 냉장 상태를 유지하면서 실험실로 운반하여 바이러스 분리를 위한 검체로 사용하였다.
대상 데이터
- 2009년 1월부터 2011년 10월까지 2년 10개월간 경기도내 소아청소년과 및 내과에 내원한 환자 중 급성호흡기 감염증이 의심되는 환자로부터 총 1,622건의 인후도찰물을 채취하여 핵산을 추출한 후, 아데노바이러스에 대하여 PCR 검사를 수행한 결과 102건(6.3%)에서 아데노바이러스를 검출하였다(Table 1).
- 2009년 1월부터 2011년 10월까지 경기지역 소아청소년과 및 내과에 내원한 환자 중 인플루엔자의심환자를 포함한 급성상기도 감염증이 의심되는 환자들로부터 채취한 총 1,622건의 인후 도찰물을 대상으로 연구를 실시하였다. 환자들로부터 채취된 인후도찰물은 바이러스 수송용배지(Becton, Dickinson and Company, USA)에 넣고 냉장 상태를 유지하면서 실험실로 운반하여 바이러스 분리를 위한 검체로 사용하였다.
- 이를 원심분리(1,000×g, 20분, 4℃)하여 얻어진 상층액을 바이러스 접종용 검체로 사용하였다. 아데노바이러스의 분리를 위해 질병관리본부 호흡기바이러스과로부터 분양 받은 A549세포를 사용하였다. A549 세포는 10% FBS (Fetal bovine serum, Gibco)가 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified eagle's medium, Welgen, Korea) 배지를 사용하여 배양하였으며, 세포를 24 well 배양용기에 단층 배양한 후, 세포의 밀도가 약 70%정도 되었을 때 세포배양액을 제거하고, phosphate buffered saline buffer를 이용하여 2회 세척한 다음 전처리된 각 검체를 200 μl씩 접종하고, 2% FBS가 포함된 배양액을 첨가하여 37℃, 5% CO2 조건에서 7일간 배양하며 세포병변효과(cytopathic effect; CPE)를 관찰하였다.
성능/효과
- 2009년에는 1형과 3형, 2010년에는 3형, 2011년에는 5형이 각각 우점하였다. 1, 2, 4, 5, 6형은 연중 산발적으로 확인되었으나, 3형은 산발적으로 발생하면서 2010년에는 큰 유행을 일으킨 것을 확인할 수 있었다. 본 연구결과를 통해 최근 3년동안 경기도내 아데노바이러스에 의한 outbreak의 주 원인 혈청형은 아데노바이러스 3형임을 알 수 있었고, 앞으로도 outbreak의 원인이 되는 특정 혈청형에 대한 지속적인 감시가 이루어져야 할 것이다.
- 9%)이 아데노바이러스 양성으로 나타났다. 2009년에 비해 2010년에 아데노바이러스의 검출율이 5배 이상 증가한 것을 확인 할 수 있었으며, 2010년과 2011년의 검출율은 차이가 거의 없었다. 하지만, 2011년에 검출율이 높게 나타난 것은 2011년 7월부터 아데노바이러스의 검출방법이 기존 방법(PCR)에 비해 더욱 민감한 real-time PCR 검사법으로 변경되었기 때문으로 2010년에 아데노바이러스가 다른 년도에 비해 크게 유행하였다는 것을 본 연구를 통해 확인할 수 있었다.
- 경기도내 분리주의 혈청형 확인 결과, 1형부터 6형까지 다양 하게 분리할 수 있었고, 2010년 8월과 9월에 크게 유행한 혈청형은 아데노바이러스 3형에 의한 것임을 확인할 수 있었다. 국내외 연구들에서도 역시 아데노바이러스 3형에 의한 outbreak가 다수 보고된 바 있다(Jiang et al.
- 계절별 혈청형 확인결과를 보면, 봄(3월–5월)에는 아데노바이러스 1형, 2형, 5형, 6형이 확인되었고, 2형이 5주(55.6%)로 많이 분리되었다(Table 3).
- 76주의 경기도내 아데노바이러스 분리주로부터 핵산을 추출하고 헥손 유전자를 증폭, 염기서열 분석 및 BLAST 프로그램으로 가장 높은 상동성을 나타낸 혈청형을 확인하였다(Table 2). 그 결과, 아데노바이러스 1형, 2형, 3형, 4형, 5형, 6형이 확인되었으며, 그 중 3형이 40주(52.6%)로 가장 많이 확인되었고, 2형이 15주(19.7%), 5형이 10주(13.2%), 1형이 6주(7.9%), 4형이 3주 (3.9%), 6형이 2주(2.6%) 순으로 분리되었다. 외국의 경우 4형과 7형이 아데노바이러스에 의한 호흡기 감염의 주류를 구성하는 것으로 보고되고 있으나, 국내의 경우 2형, 3형, 및 5형이 주류를 이룬다는 기존의 보고와도 일치하는 결과였다(Chung et al.
- 본 연구 결과, 경기도내 호흡기 아데노바이러스는 연중 산발적으로 검출되나, 주로 7월 이후에 검출율이 증가하고, 아데노바이러스 3형의 유행은 outbreak를 가져온다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 여름과 가을철에 아데노바이러스에 의한 호흡기 질환을 주의할 필요가 있으며, 특히 아데노바이러스 3형과 같은 특정 혈청형에 의한 outbreak를 대비하기 위하여 지속적인 감시가 필요하겠다.
- 1, 2, 4, 5, 6형은 연중 산발적으로 확인되었으나, 3형은 산발적으로 발생하면서 2010년에는 큰 유행을 일으킨 것을 확인할 수 있었다. 본 연구결과를 통해 최근 3년동안 경기도내 아데노바이러스에 의한 outbreak의 주 원인 혈청형은 아데노바이러스 3형임을 알 수 있었고, 앞으로도 outbreak의 원인이 되는 특정 혈청형에 대한 지속적인 감시가 이루어져야 할 것이다.
- , 2005)(결과 미제시). 성별 아데노바이러스 검출현황을 살펴보면, 아데노바이러스에 양성을 보인 환자는 남자 55명(7.1%), 여자 46명(5.7%), 성별을 알 수 없었던 검체 1건으로 남자가 여자보다 아데노바이러스에 의한 호흡기질환에 더 취약한 것으로 나타났다. 광주지역에서도 역시 남녀비가 4.
- 2009년 1월부터 2011년 10월까지 검사된 검체 중 PCR에서 아데노바이러스로 확인된 102건에 대하여 세포배양법으로 바이러스를 분리하고, 혈청형별 유전적 변이가 가장 많은 헥손 유전자 부위를 분석하여 혈청형을 확인하였다. 세포배양법으로 아데노바이러스를 분리한 결과, 102건의 아데노바이러스 양성 검체중 76건만이 전형적인 아데노바이러스의 세포병변을 나타내었고, 헥손 유전자 부위의 유전자 증폭이 가능했다.
- 하지만, 2011년에 검출율이 높게 나타난 것은 2011년 7월부터 아데노바이러스의 검출방법이 기존 방법(PCR)에 비해 더욱 민감한 real-time PCR 검사법으로 변경되었기 때문으로 2010년에 아데노바이러스가 다른 년도에 비해 크게 유행하였다는 것을 본 연구를 통해 확인할 수 있었다. 아데노바이러스의 월별 분포현황을 살펴보면, 연중 산발적으로 발생되나, 주로 7월 이후에 검출율이 증가하였으며, 특히, 2010년 8월과 9월은 검출율이 33.3%로 2010년 연 검출율(8.0%)보다 4배 이상 높게 나타나서, 2010년 여름과 가을에 아데노바이러스에 의한 급성호흡기감염증이 크게 유행하였음을알 수 있었다(Fig. 1).
- 연도별 혈청형 확인결과를 보면, 2009년에는 아데노바이러스 1형, 2형, 3형, 4형이 연중 산발적으로 확인되었으며, 2010년에는 1형부터 6형까지 다양하게 검출되었지만, 이중 3형이 36주 (70.6%), 2형이 9주(17.6%)로 가장 많이 검출되었다. 2011년에는 4형을 제외한 1형부터 6형까지 확인되었고, 이중 5형이 8주(42.
- 본 연구에서는 2009년부터 2011년까지 경기지역 소아청소년과 및 내과에 내원한 급성호흡기 감염증 의심환자를 대상으로 호흡기아데노바이러스의 유행양상 및 혈청형 분포양상을 분석하였다. 총 1,622명의 급성상기도 감염증이 의심되는 환자의 검체를 분석한 결과 102건(6.3%)에서 아데노바이러스를 검출하였다. 102건의 아데노바이러스 양성 검체에서 세포배양법으로 76주의 아데노바이러스를 분리하였고, 혈청형별 특이유전자인 헥손 유전자의 염기서열 분석을 통하여 혈청형을 확인하였다.
- 2009년에 비해 2010년에 아데노바이러스의 검출율이 5배 이상 증가한 것을 확인 할 수 있었으며, 2010년과 2011년의 검출율은 차이가 거의 없었다. 하지만, 2011년에 검출율이 높게 나타난 것은 2011년 7월부터 아데노바이러스의 검출방법이 기존 방법(PCR)에 비해 더욱 민감한 real-time PCR 검사법으로 변경되었기 때문으로 2010년에 아데노바이러스가 다른 년도에 비해 크게 유행하였다는 것을 본 연구를 통해 확인할 수 있었다. 아데노바이러스의 월별 분포현황을 살펴보면, 연중 산발적으로 발생되나, 주로 7월 이후에 검출율이 증가하였으며, 특히, 2010년 8월과 9월은 검출율이 33.
후속연구
- 본 연구는 경기지역에서 유행하는 호흡기 아데노바이러스의 유행양상 및 혈청형 분포 특성을 파악함으로써, 아데노바이러스의 유행을 조기에 탐지하고, 예방 및 관리방안을 모색하기 위한 기초 역학 자료로 활용될 것으로 기대된다.
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