선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- HCV IRES는 복잡한 2차 구조를 가지고 있기 때문에 (Fig. 1A), IRES의 어느 부위가 hammerhead 리보자임에 가장 접근성이 용이한 부위인지 찾고자 하였다. 195, 199, 326, 382번째 nt 를 표적하는 야생형의 hammerhead 리보자임을 제작하였다.
- 최근 리보자임의 기질 결합 부위 또는 catalytic core부위에 aptan血er와 같이 특정 ligand와 결합하는 부위를 join시 특정 ligand의 결합에 의해 리보자임 구조적 변이를 유발함으로써 리보자임 활성이 allosteric 하게 증가 또는 저해될 수 있는 allosteric 리보자임이 개발되고 있다(3, 26). 본 연구에서는 HCV의 비구조 단백질인 NS5B에 대한 aptamer를 hammerhead 리보자임의 catalytic core 부위에 결합함으로써 NS5B 단백질에 의해 활성이 조절되는 allosteric 리보자임을 개발하였다. 이러한 allosteric 리보자임은 aptame의 가역적인 표적 결합 능력과 hammerhead ribozyme의 비가역적인 표적 RNA에 대한 cleavage 활성이 더해진 새로운 개념의 항 HCV 억제제로서 사용 가능할 것이다.
- 본 연구에서는 aptamer의 가역적인 표적 분자 인지 능력 및 표적 분자의 활성 억제 능력을 hammerhead 리보자임의 비가역적인 표적 RNA 절단 능력과 결합하여 새로운 개념의 항 HCV 억제제를 개발하고자 하였다. 이러한 새로운 개념의 RNA 분자를 개발하기 위해 우선 HCV의 IRES 염기서열 중 어느 부위가 가장 hammerhead 리보자임에 의해 반응이 용이한 부위인지 탐색하였다.
제안 방법
- 효율성 검증을 위해 20 finole의 [a-32P] UTP로 표지된 리보자임을 다양한 농도의 BSA 혹은 NS5B 단백질과 반응시켰다. 반응이 끝난 RNA는 RNA loading dye를 섞은 후 95。(2에서 변성 시켜 7 M urea-10% polyacrylamide gel에서 180 V로 1시간 동안 전기영동하고 X-선 필름에 3~24시간 노출하여 현상하였으며 정량적 분석을 위해 typhoon 8600을 사용하여 image를 얻은 후 Imagequant TL v2500 program (GE healthcare, Piscataway, USA)을 사용하였다.
- 여기에 2x hammerhead 반응 완충용액(20 mM Tris-HCl; pH 7.5, 300 mM NaCl, 4 mM DTT, 10 mM MgCl?)과 bovine serum albumin (BSA)을 넣고 37。(3에서 6시간 동안 반응시킨 후 7 M urea-10% polyacrylamide gel 전기영동 및 EtBr 염색을 통해 self-cleavage 되지 않은 RNA들을 골라내었다. 사전 단계에서 골라진 RNA를 추출한 후 primer (5, -GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGGTG TCTGATGAG)# 이용한 역전사 반응과 primer set (51 primer, 5, -TTGGTGTCTGATGAGNNNNNCGCGCCATATTGTGAGGGG CGCG; 3' primer, 5, -GGTAATACGACTCACTATAGGGITGGT GTCTGATGAG)를 이용한 PCR 반응을 통하여 증폭시켰다.
- 3차 selection 후 획득한 리보자임 po이을 RT-PCR 방법을 통해 증폭한 후 cloning하여 염기 서열을 결정하였다. 그 결과 4종류의 리보자임이 선별되었다(Fig.
- 4종류의 리보자임의 효율성 검증을 위해 각각에 대해 단백질농도별 cleavage 산물을 확인하였다. 방사성 동위원소로 표지된 20 finole의 각 리보자임을 최소 5 nM에서 최대 1.
- HCV IRES의 +195 nt, +199 nt, +326 nt 및 +382 nt 부위를 표적 하는 hammerhead 리보자임들(각각 Ribl95, Rib 199, Rib326, Rib382로 명기)을 제작하기 위하여 다음과 같은 primer set를 이용하여 PCR을 수행 한 후 증폭된 DNA 기질과 T7 RNA 중합 효소를 37℃에서 3시간 동안 반응하여 in vitro 상에서 전사 반응을 수행하였다.
- NS5B 단백질에 의해서 활성이 조절되는 hammerhead 리보자임 발굴을 위해 NS5B에 대한 aptame와 hammerhead 리보자임 및 무작위 염기서열로 구성된 10 mer의 communication module 을 결합한 리보자임 라이브러리를 제작한 후 in vitro selection 방법으로 NS5B 의존성 allosteric 리보자임을 발굴 하였다.
- NS5B 의존성 allosteric 리보자임 선별을 위해 우선 비특이적으로 selfcleavage되는 RNA를 사전 제거한 후 NS5B에 의해 특이적으로 self-cleavage되는 RNA들을 발굴하였다. 사전 제거 단계로 리보자임 라이브러리 30 pmole을 95。(3에서 1분 30초 동안 변성시킨 후 3TC에서 15분간 구조를 재형성 시켰다.
- 이렇게 골라진 RNA들을 RT-PCR을 통해 증폭하고 in vitro 전사반응을 통해 RNA pool을 제작한 후 다음 selection 과정을 진행하였다. NS5B에 의해 조절될 수 있으며 fast reaction pool 선별을 위하여 획득한 RNA pool을 NS5B 단백질과 반응시킨 후 특이적으로 잘린 RNA만을 선별하여 다시 RT-PCR 과정을 거쳤다. 이러한 과정을 3회 수행한 후 리보자임 라이브러리와 2차 pool 및 3차 pool 리보자임을 이용하여 enrichment 정도를 확인한 결과 3차 pool 리보자임이 BSA와 반응 시켰을 때 잘리지 않고, NS5B protein과 반응 시켰을 때만 특이적으로 잘리는 것을 확인할 수 있었다(Fig.
- Louis USA)를 첨가한 후 37P에서 3시간을 키운 후 세포의 용해 과정과 초음파 분해 과정을 거친 세포 추출물을 Ni-NTA agarose bead (Qiagen, Valencia USA)와 결합 시킨 후 5시간 동안 4P에서 NS5B 단백질과 결합시켰다. Ni-NTA agarose bead에 결합되어진 NS5B를 추출하기 위해 imidazole의 농도를 조정해 가며 단백질을 용리 하였다. 농축 고정을 거쳐 Bradford 분석 방법으로 정량하였다.
- Primer set (S-TTGGrGTCTGATGAGNNNNNCGCGCCATATT GTGAGGGGCGCQ 5'-TACGTTTGGrTTCCCAAACGnTCGNN NNNCGCGCCCCTCACAAT; Ne G A, T, C가 각각 동량 포함) 를 넣고 EX taq 중합효소 (Takara, Otsu, Japan)를 사용하여 PCR 을 수행하였으며 여기서 얻어진 DNA 산물 20 ng을 primer set ◎-GGTAATACGACTCACTATAGGGITGGTGrCTGATGAG 5'-T tttttttttttttttggtgttacgtttggittcccaaa)를 넣고 EX taq 중합효소 (Takara, Otsu, Japan)를 사용하여 다시 한 번 더 PCR 하였다. 이렇게 얻어진 라이브러리 DNA를 기질로 하여 T7 RNA 중합효소(Takara, Otsu, Japan)와 3℃에서 3시간 동안 전사 반응을 수행함으로써 리보자 임 라이브러리를 제작하였다.
- 리보자임의 표적 RNA인 HCV IRES RNA를 제작하기 위하여 HCV IRES의 +18 nucleotide (nt) 부위부터 +402 nt 부위까지 포함되어 있는 DNA [pSK(-) 18-402 IRES CAT] plasmid# BaznHI으로 선향화한 후 T7 RNA 중합효소(Takara, Otsu, Japan) 와 37℃에서 3시간 동안 반응하여 in vitro 상에서 전사 반응을 수행하였다. 이때 [a-32P] UTP를 이용하여 제작된 R* NA 방사선 동위원소로 표지한 후 정제 및 정량하였다.
- 이를 위해 hammerhead 리보자임의 catalytic core 부위인 stem II부위에 communication module을 통해 NS5B aptamer를 결합시킴으로써, NS5B 단백질의 aptamer 결합이 리보자임의 catalytic 과정을 조절 할 수 있는 리보자임을 in vitro selection 방법을 통하여 발굴하였다. 무작위의 10 mer로 구성된 communication module을 NS5B와 hammerhead 리보사임의 사이에 삽입하여 NS5B 의존성 self-cleavage allosteric 리보자임 라이브러리를 제작하였다(Fig. 2A). 이렇게 제작된 random 라이브러리를 Fig.
- cleavage 산물을 확인하였다. 방사성 동위원소로 표지된 20 finole의 각 리보자임을 최소 5 nM에서 최대 1.28 mM까지의 NS5B 단백질과 반응 시켜 보았다. 그 결과, 모든 리보자임들이 단백질 농도가 증가되면서 self-cleavage 반응이 증가되었으며 NS5B 농도 증가에 따라 sigmoid curve 형태를 나타내었다(Fig.
- 5, 300 mM NaCl, 4 mM DTT, 10 mM MgCl?)과 bovine serum albumin (BSA)을 넣고 37。(3에서 6시간 동안 반응시킨 후 7 M urea-10% polyacrylamide gel 전기영동 및 EtBr 염색을 통해 self-cleavage 되지 않은 RNA들을 골라내었다. 사전 단계에서 골라진 RNA를 추출한 후 primer (5, -GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGGTG TCTGATGAG)# 이용한 역전사 반응과 primer set (51 primer, 5, -TTGGTGTCTGATGAGNNNNNCGCGCCATATTGTGAGGGG CGCG; 3' primer, 5, -GGTAATACGACTCACTATAGGGITGGT GTCTGATGAG)를 이용한 PCR 반응을 통하여 증폭시켰다. 증폭된 DNA를 in vitro 상에서 전사반응을 수행한 후 획득한 리보자임 p。이을 추출 및 정제하였다.
- 선별된 각각의 allosteric 리보자임의 특이성을 보기 위해, [a- 32P] UTP로 표지된 20 finole의 리보자임을 3.2 pmole의 BSA 단백질 혹은 NS5B 단백질을 첨가하여 반응시켰다. 20 finole의리보자임을 95℃에서 1분 30초 동안 변성시킨 후 37℃에서 15 분 동안 구조를 재형성시켰다.
- 선정된 4개의 리보자임이 과연 NS5B가 존재하는 경우에만 특이적으로 selScleavage 활성이 유도될 수 있는지 검증하기 위하여 방사성 동위원소로 표지된 각각의 리보자임을 BSA 혹은 NS5B 단백질과 반응시켰다. 그 결과 4개의 리보자임에서 모두 단백질이 없거나 BSA가 존재 시에는 아무런 반응이 유도되질 못하였으나 NS5B가 존재 시엔 특이적으로 self-cleavage 반응이유도 되었다(Fig.
- 2B의 전략으로 in vitro selection을 수행하였다. 우선 non-regulatable pool의 완벽한 제거를 위하여 리보자임 라이브러리를 BSA 단백질과 반응 시켜 cleavage 되지 않은 RNA들을 선별함으로써 비특이적으로 cleavage되는 RNA pool을 제거하였다. 이렇게 골라진 RNA들을 RT-PCR을 통해 증폭하고 in vitro 전사반응을 통해 RNA pool을 제작한 후 다음 selection 과정을 진행하였다.
- 이러한 새로운 개념의 RNA 분자를 개발하기 위해 우선 HCV의 IRES 염기서열 중 어느 부위가 가장 hammerhead 리보자임에 의해 반응이 용이한 부위인지 탐색하였다. 이러한 HCV IRES 표적 hammerhead 리보자'임을 HCV NS5B 단백질에 특이적으로 결합하는 NS5B aptamer와 결합하였으며,aptamer와 표적분자의 결합에 의해 allosteric하게 hammerhead 리보자임의 활성을 증진시킬 수 있는 communication module 염기서열을 in vitro selection 방법(19, 27, 31, 33)을통해 선별함으로써 NS5B 단백질이 존재할 시에만 그 활성이 증가되는 allosteric 리보자임들을 개발하였다. 선별된 리보자임들의 활성을 검정하기 위해 in vitro cleavage assay 실험을 하였으며 이러한 실험을 통해 선별된 리보자임들이 HCV NS5B 단백질 특이적이며 농도 의존적으로 allosteric하게 self-cleavage 반응을 유도한다는 것을 확인하였다.
- 이러한 allosteric 리보자임은 aptame의 가역적인 표적 결합 능력과 hammerhead ribozyme의 비가역적인 표적 RNA에 대한 cleavage 활성이 더해진 새로운 개념의 항 HCV 억제제로서 사용 가능할 것이다. 이러한 리보자임의 개발을 위하여 NS5B 단백질과 NS5B aptamer와의 binding eneigy를 hammerhead 리보자임의 cleavage 활성으로 전환해 줄 수 있는 communication module 염기서열을 무작위화 하였으며, 여기서 얻어진 pool을 이용하여 in vitro selection 방법을 3회 수행, NS5B에 의해서 특이적으로 활성을 가지는 리보자임을 개발하였다. 발굴된 리보자임들의 특이성을 검증해 본 결과, NS5B가 존재 시에만 특이적인 반응을 통해서 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 개발된 리보자임을 활용하여 HCV에 감염된 경우에만 HCV가 발현하는 NS5B에 의해 리보자임 활성이 유도됨으로써 HCV 증식을 특이적으로 억제할 수 있음을 시사한다.
- 개발하고자 하였다. 이러한 새로운 개념의 RNA 분자를 개발하기 위해 우선 HCV의 IRES 염기서열 중 어느 부위가 가장 hammerhead 리보자임에 의해 반응이 용이한 부위인지 탐색하였다. 이러한 HCV IRES 표적 hammerhead 리보자'임을 HCV NS5B 단백질에 특이적으로 결합하는 NS5B aptamer와 결합하였으며,aptamer와 표적분자의 결합에 의해 allosteric하게 hammerhead 리보자임의 활성을 증진시킬 수 있는 communication module 염기서열을 in vitro selection 방법(19, 27, 31, 33)을통해 선별함으로써 NS5B 단백질이 존재할 시에만 그 활성이 증가되는 allosteric 리보자임들을 개발하였다.
- 우선 non-regulatable pool의 완벽한 제거를 위하여 리보자임 라이브러리를 BSA 단백질과 반응 시켜 cleavage 되지 않은 RNA들을 선별함으로써 비특이적으로 cleavage되는 RNA pool을 제거하였다. 이렇게 골라진 RNA들을 RT-PCR을 통해 증폭하고 in vitro 전사반응을 통해 RNA pool을 제작한 후 다음 selection 과정을 진행하였다. NS5B에 의해 조절될 수 있으며 fast reaction pool 선별을 위하여 획득한 RNA pool을 NS5B 단백질과 반응시킨 후 특이적으로 잘린 RNA만을 선별하여 다시 RT-PCR 과정을 거쳤다.
- 증폭된 DNA를 in vitro 상에서 전사반응을 수행한 후 획득한 리보자임 p。이을 추출 및 정제하였다. 이렇게 얻어진 RNA 30 pmole을 BSA대신 NS5B를 넣고 사전 제거 단계와 동일한 방법으로 37也에서 1시간동안 반응시킨 후 7 M urea-10% polyacrylamide gel 상에서 전기 영동하였고, EtBr 염색을 통해 seBcleavage된 RNA들을 골라내어 RT-PCR 과정을 거쳐 두 번째 선별 과정을 거칠 리보자임 pool을 제작하였으며, 이 과정을 3번 반복하였다. 최종 획득한 리보자임 pool을 RT-PCR 수행한 후 그 DNA 산물을 pGEM T easy system (Promega, Madison, US A)을 이용하여결찰 반응을 시켰으며, E.
- PCR 하였다. 이렇게 얻어진 라이브러리 DNA를 기질로 하여 T7 RNA 중합효소(Takara, Otsu, Japan)와 3℃에서 3시간 동안 전사 반응을 수행함으로써 리보자 임 라이브러리를 제작하였다.
- 골격으로 한 allosteric 리보자임을 선별하였다. 이를 위해 hammerhead 리보자임의 catalytic core 부위인 stem II부위에 communication module을 통해 NS5B aptamer를 결합시킴으로써, NS5B 단백질의 aptamer 결합이 리보자임의 catalytic 과정을 조절 할 수 있는 리보자임을 in vitro selection 방법을 통하여 발굴하였다. 무작위의 10 mer로 구성된 communication module을 NS5B와 hammerhead 리보사임의 사이에 삽입하여 NS5B 의존성 self-cleavage allosteric 리보자임 라이브러리를 제작하였다(Fig.
- 형질 전환되어 agar plate에 자란 각각의 군체 중 수십 개를 선택하여 DNA 정제를 수행하였으며, EcoRI을 사용하여 삽입되어 들어간 clone들을 찾아내었다. 찾아내어진 clone DNA에 5x sequencing buffer, terminator ready reaction mixture, 3.2 pmole M13 forward primer 등을 넣은 후, 96℃ 10초, 50℃ 5초, 60℃ 4초의 조건으로 25 cycle의 PCR을 수행하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물에 template suppression reagent를 넣어주고, 변성 과정을 거쳐 염기 서열 분석 기계(ABI PRISM, Foster City, USA)에 넣어서 염기 서열을 결정하였다.
- Louis, USA) 항생제가 들어 있는 agar plate에서 37。(3에서 16시간 동안 배양했다. 형질 전환되어 agar plate에 자란 각각의 군체 중 수십 개를 선택하여 DNA 정제를 수행하였으며, EcoRI을 사용하여 삽입되어 들어간 clone들을 찾아내었다. 찾아내어진 clone DNA에 5x sequencing buffer, terminator ready reaction mixture, 3.
- 2 pmole의 단백질을 넣고 37>C에서 1시간 동안 반응시켰다. 효율성 검증을 위해 20 finole의 [a-32P] UTP로 표지된 리보자임을 다양한 농도의 BSA 혹은 NS5B 단백질과 반응시켰다. 반응이 끝난 RNA는 RNA loading dye를 섞은 후 95。(2에서 변성 시켜 7 M urea-10% polyacrylamide gel에서 180 V로 1시간 동안 전기영동하고 X-선 필름에 3~24시간 노출하여 현상하였으며 정량적 분석을 위해 typhoon 8600을 사용하여 image를 얻은 후 Imagequant TL v2500 program (GE healthcare, Piscataway, USA)을 사용하였다.
대상 데이터
- 1A), IRES의 어느 부위가 hammerhead 리보자임에 가장 접근성이 용이한 부위인지 찾고자 하였다. 195, 199, 326, 382번째 nt 를 표적하는 야생형의 hammerhead 리보자임을 제작하였다. 각 부위를 표적하는 hammerhead 리보자임과 방사성 동위원소로 표지된 IRES를 이용하여 in vitro a〃s-cleavage assay를 수행해본 결과 IRES의 382번째 nt 부위가 hammerhead 리보자임에 가장 접근성이 용이함을 알 수 있었다(Fig.
- HCV IRES의 382번째 nt를 인지하는 hammerhead 리보자임을 기본 골격으로 한 allosteric 리보자임을 선별하였다. 이를 위해 hammerhead 리보자임의 catalytic core 부위인 stem II부위에 communication module을 통해 NS5B aptamer를 결합시킴으로써, NS5B 단백질의 aptamer 결합이 리보자임의 catalytic 과정을 조절 할 수 있는 리보자임을 in vitro selection 방법을 통하여 발굴하였다.
이론/모형
- Ni-NTA agarose bead에 결합되어진 NS5B를 추출하기 위해 imidazole의 농도를 조정해 가며 단백질을 용리 하였다. 농축 고정을 거쳐 Bradford 분석 방법으로 정량하였다.
성능/효과
- 이는 혹 있을지 모르는 리보자임의 비특이적인 off-target 효과를 최소화할 수 있는 장치가 될 수 있을 것이다. Allosteric 리보자임 활성의 co-fhctor인 Mg2+를 제거했을 경우, NS5B 존재 시비 특이적 위치에서 cleavage가 일어나는 것을 확인하였다. 보고에 따르면, Mg2+는 hammerhead 리보자임의 stem I과 Ⅲ 구조가 형성된 후 이 두 stem과 stem II junction 부위에 결합하여 리보자임을 활성화 시키는 것으로 알려져 있다(10).
- 4B). NS5B 존재시 cleavage 효율이 최대 50~60%(clone 9의 경우)까지 증가하는 것을 관찰할 수 있었으나 BSA의 경우는 단백질 농도에 상관없이 cleavage가 전혀 일어나지 않았다(결과 미제시).
- 195, 199, 326, 382번째 nt 를 표적하는 야생형의 hammerhead 리보자임을 제작하였다. 각 부위를 표적하는 hammerhead 리보자임과 방사성 동위원소로 표지된 IRES를 이용하여 in vitro a〃s-cleavage assay를 수행해본 결과 IRES의 382번째 nt 부위가 hammerhead 리보자임에 가장 접근성이 용이함을 알 수 있었다(Fig. IB).
- 단백질과 반응시켰다. 그 결과 4개의 리보자임에서 모두 단백질이 없거나 BSA가 존재 시에는 아무런 반응이 유도되질 못하였으나 NS5B가 존재 시엔 특이적으로 self-cleavage 반응이유도 되었다(Fig. 4A). 이러한 반응이 NS5B 단백질에 의한 비특이적 분해가 아님을 검증하기 위해 동일한 반응을 hammerhead 리보자임 활성의 co-factor인 Mg2+가 없는 완충용액 조건에서 실행해 본 결과, NS5B만 존재할 경우 특이적 cleavage 부위가 아닌 비 특이적 부위에서 cleavage가 유도되었다(결과 미제시).
- 후 cloning하여 염기 서열을 결정하였다. 그 결과 4종류의 리보자임이 선별되었다(Fig. 3B). 흥미롭게도 clone 10, 11, 17의 경우 NS5B aptamer의 stem 부위에 돌연변이가 유발되었는데 이는 각 리보자임들의 aptamer에 NS5B가 결합흐]는 데에는 영향을 끼치지 않으면서 NS5B 결합에 의한 리보자임 활성 유도가 최적화되는 구조를 이루도록 염기서열에 변이가 일어났을 것으로 추정된다.
- 28 mM까지의 NS5B 단백질과 반응 시켜 보았다. 그 결과, 모든 리보자임들이 단백질 농도가 증가되면서 self-cleavage 반응이 증가되었으며 NS5B 농도 증가에 따라 sigmoid curve 형태를 나타내었다(Fig. 4B). NS5B 존재시 cleavage 효율이 최대 50~60%(clone 9의 경우)까지 증가하는 것을 관찰할 수 있었으나 BSA의 경우는 단백질 농도에 상관없이 cleavage가 전혀 일어나지 않았다(결과 미제시).
- 이러한 리보자임의 개발을 위하여 NS5B 단백질과 NS5B aptamer와의 binding eneigy를 hammerhead 리보자임의 cleavage 활성으로 전환해 줄 수 있는 communication module 염기서열을 무작위화 하였으며, 여기서 얻어진 pool을 이용하여 in vitro selection 방법을 3회 수행, NS5B에 의해서 특이적으로 활성을 가지는 리보자임을 개발하였다. 발굴된 리보자임들의 특이성을 검증해 본 결과, NS5B가 존재 시에만 특이적인 반응을 통해서 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 개발된 리보자임을 활용하여 HCV에 감염된 경우에만 HCV가 발현하는 NS5B에 의해 리보자임 활성이 유도됨으로써 HCV 증식을 특이적으로 억제할 수 있음을 시사한다. 이는 혹 있을지 모르는 리보자임의 비특이적인 off-target 효과를 최소화할 수 있는 장치가 될 수 있을 것이다.
- 이러한 HCV IRES 표적 hammerhead 리보자'임을 HCV NS5B 단백질에 특이적으로 결합하는 NS5B aptamer와 결합하였으며,aptamer와 표적분자의 결합에 의해 allosteric하게 hammerhead 리보자임의 활성을 증진시킬 수 있는 communication module 염기서열을 in vitro selection 방법(19, 27, 31, 33)을통해 선별함으로써 NS5B 단백질이 존재할 시에만 그 활성이 증가되는 allosteric 리보자임들을 개발하였다. 선별된 리보자임들의 활성을 검정하기 위해 in vitro cleavage assay 실험을 하였으며 이러한 실험을 통해 선별된 리보자임들이 HCV NS5B 단백질 특이적이며 농도 의존적으로 allosteric하게 self-cleavage 반응을 유도한다는 것을 확인하였다.
- NS5B에 의해 조절될 수 있으며 fast reaction pool 선별을 위하여 획득한 RNA pool을 NS5B 단백질과 반응시킨 후 특이적으로 잘린 RNA만을 선별하여 다시 RT-PCR 과정을 거쳤다. 이러한 과정을 3회 수행한 후 리보자임 라이브러리와 2차 pool 및 3차 pool 리보자임을 이용하여 enrichment 정도를 확인한 결과 3차 pool 리보자임이 BSA와 반응 시켰을 때 잘리지 않고, NS5B protein과 반응 시켰을 때만 특이적으로 잘리는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 3A).
- 4A). 이러한 반응이 NS5B 단백질에 의한 비특이적 분해가 아님을 검증하기 위해 동일한 반응을 hammerhead 리보자임 활성의 co-factor인 Mg2+가 없는 완충용액 조건에서 실행해 본 결과, NS5B만 존재할 경우 특이적 cleavage 부위가 아닌 비 특이적 부위에서 cleavage가 유도되었다(결과 미제시). 이는 allosteric 리보자임의 특이적 활성에 Mg2*와 NS5B 단백질이 모두 필요하며, NS5B가 선별된 리보자임의 정확한 구조 형성 및 활성유도에 중요함을 시사한다.
후속연구
- RNA는 구조적으로 dynamic한 특성을 함유하고 있으므로 항 H* CV 위한 RNA 기반 억제제들을 융합하여 새로운 구조적 특성, 나아가 새로운 기능을 가진 새로운 유전 산물을 개발함으로써 각각 단독으로만 존재시 갖고 있던 약점들을 극복할 수 있는새로운 항 HCV 제제를 개발할 수 있을 것이다. 최근 리보자임의 기질 결합 부위 또는 catalytic core부위에 aptan血er와 같이 특정 ligand와 결합하는 부위를 join시 특정 ligand의 결합에 의해 리보자임 구조적 변이를 유발함으로써 리보자임 활성이 allosteric 하게 증가 또는 저해될 수 있는 allosteric 리보자임이 개발되고 있다(3, 26).
- 또한 RNA는 화학적 합성 및 변형이 용이하고 또한 세포 내 과발현이 용이한 장점이 있다. 그러나 각각의 방법 단일만을 이용할 시에는 그 특이성과 효능에 있어 한계가 있기에 보다 특이적이며 효과적인항 HCV 제제를 발굴하기 위해선 HCV가 감염된 경우에서만 효과적으로 HCV 증식을 억제할 수 있도록 상기의 유전산물의 기능이 결합된 새로운 산물의 개발이 필요할 것이다.
- 검증하여야 할 것이다. 그러나 본 연구로부터 개발된 selfcleavage 리보자임은 HCV 감염을 진단 할 수 있는 리보 스위치 개념의 biosensor로서(5, 12, 32) 사용이 가능할 것이다. 또한 selEcleavage 리보자임을 NS5B 단백질에 의해 HCV 증식에 주요한 숙주인자인 miR-122에 대한 anti-sequence를 release하게 만든다면 HCV 복제를 저해 할 수 있을 뿐 아니라(17, 21), aptamer의 NS5B 단백질 결합에 의해서도 HCV 복제를 감소시킬 수 있어 하나의 분자를 사용한 치료법보다 더 뛰어난 효과를 보일 수 있을 것이라 전망된다.
- 그러나 본 연구로부터 개발된 selfcleavage 리보자임은 HCV 감염을 진단 할 수 있는 리보 스위치 개념의 biosensor로서(5, 12, 32) 사용이 가능할 것이다. 또한 selEcleavage 리보자임을 NS5B 단백질에 의해 HCV 증식에 주요한 숙주인자인 miR-122에 대한 anti-sequence를 release하게 만든다면 HCV 복제를 저해 할 수 있을 뿐 아니라(17, 21), aptamer의 NS5B 단백질 결합에 의해서도 HCV 복제를 감소시킬 수 있어 하나의 분자를 사용한 치료법보다 더 뛰어난 효과를 보일 수 있을 것이라 전망된다. 또한 이러한 allosteric ribozyme을 NS5B 단백질 의존적으로 면역 유도성 RNA들을 release하게 만든다면 HCV에 감염된 세포의 면역력을 높임으로써 HCV의 감염 역시 저해 할 수 있어 새로운 개념의 항 HCV 저해제로서 사용될 수 있을 것이며, 아직 많은 부분이 밝혀져 있지 않은 HCV 복제 과정을 연구할 수 있는 도구로서도 활용할 수 있을 것이라 사료된다.
- 또한 selEcleavage 리보자임을 NS5B 단백질에 의해 HCV 증식에 주요한 숙주인자인 miR-122에 대한 anti-sequence를 release하게 만든다면 HCV 복제를 저해 할 수 있을 뿐 아니라(17, 21), aptamer의 NS5B 단백질 결합에 의해서도 HCV 복제를 감소시킬 수 있어 하나의 분자를 사용한 치료법보다 더 뛰어난 효과를 보일 수 있을 것이라 전망된다. 또한 이러한 allosteric ribozyme을 NS5B 단백질 의존적으로 면역 유도성 RNA들을 release하게 만든다면 HCV에 감염된 세포의 면역력을 높임으로써 HCV의 감염 역시 저해 할 수 있어 새로운 개념의 항 HCV 저해제로서 사용될 수 있을 것이며, 아직 많은 부분이 밝혀져 있지 않은 HCV 복제 과정을 연구할 수 있는 도구로서도 활용할 수 있을 것이라 사료된다.
- 본 연구에서 개발한 NS5B 의존성 리보자임을 항 HCV 제제로서 활용하기 위해선 이러한 리보자임이 과연 기질 RNA와 trans 하게도 cleavage 반응을 NS5B 특이적으로 유도할 수 있는지 검증하여야 할 것이다. 그러나 본 연구로부터 개발된 selfcleavage 리보자임은 HCV 감염을 진단 할 수 있는 리보 스위치 개념의 biosensor로서(5, 12, 32) 사용이 가능할 것이다.
- 발굴된 리보자임들의 특이성을 검증해 본 결과, NS5B가 존재 시에만 특이적인 반응을 통해서 활성이 나타나는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 개발된 리보자임을 활용하여 HCV에 감염된 경우에만 HCV가 발현하는 NS5B에 의해 리보자임 활성이 유도됨으로써 HCV 증식을 특이적으로 억제할 수 있음을 시사한다. 이는 혹 있을지 모르는 리보자임의 비특이적인 off-target 효과를 최소화할 수 있는 장치가 될 수 있을 것이다. Allosteric 리보자임 활성의 co-fhctor인 Mg2+를 제거했을 경우, NS5B 존재 시비 특이적 위치에서 cleavage가 일어나는 것을 확인하였다.
- 본 연구에서는 HCV의 비구조 단백질인 NS5B에 대한 aptamer를 hammerhead 리보자임의 catalytic core 부위에 결합함으로써 NS5B 단백질에 의해 활성이 조절되는 allosteric 리보자임을 개발하였다. 이러한 allosteric 리보자임은 aptame의 가역적인 표적 결합 능력과 hammerhead ribozyme의 비가역적인 표적 RNA에 대한 cleavage 활성이 더해진 새로운 개념의 항 HCV 억제제로서 사용 가능할 것이다. 이러한 리보자임의 개발을 위하여 NS5B 단백질과 NS5B aptamer와의 binding eneigy를 hammerhead 리보자임의 cleavage 활성으로 전환해 줄 수 있는 communication module 염기서열을 무작위화 하였으며, 여기서 얻어진 pool을 이용하여 in vitro selection 방법을 3회 수행, NS5B에 의해서 특이적으로 활성을 가지는 리보자임을 개발하였다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.