[논문]DNA 직접추출법에 따른 산림토양 부식층 내 세균군집의 계통학적 다양성 비교

손희성; 한송이; 황경숙

DNA 직접추출법에 따른 산림토양 부식층 내 세균군집의 계통학적 다양성 비교
Comparison of the Phylogenetic Diversity of Humus Forest Soil Bacterial Populations via Different Direct DNA Extyaction Methods 원문보기

Korean journal of microbiology = 미생물학회지, v.43 no.3, 2007년, pp.210 - 216

손희성 (목원대학교 미생물생태자원연구소, 목원대학교 생명산업학부) , 한송이 (목원대학교 미생물생태자원연구소, 목원대학교 생명산업학부) , 황경숙 (목원대학교 미생물생태자원연구소, 목원대학교 생명산업학부)

초록
AI-Helper

개량된 manual법과 ISOIL kit를 이용하여 산림토양의 부식층 토양시료로부터 추출한 DNA를 대상으로 16S rDNA PCR 증폭산물을 cloning하고 구축된 clone에 대해 ARDRA cluster분식을 수행한 결과, 개량된 manual법에 의해 구축된 136 clones은 45개 ARDRA cluster로, ISOIL kit를 이용한 경우 충 76 clones은 44개 ARDRA cluster로 분류되었다. 각clone cluster로부터 대표 clone을 선발하여 16S rDNA염기서열을 결정한 결과, ISOIL kit의 경우 44개 대표clone은 ${\alpha}-,\;{\beta}-,\;{\gamma}-,\;{\delta}-Proteobacteria$, Acidobacteria 및 Actinobacteria의 3개 phylum계통군이 확인되었으며, 개량된 manual법에 의한 45개 대표 clone은 ${\alpha}-,\;{\beta}-,\;{\gamma}-,\;{\delta}-Proteobacteria$, Acidobacteria, Bacteroides, Verrucomicrobia, Planctomycetes, 그리고 Gemmatomonadetes의 충 6개 phylum의 다양한 계통군이 검출되었다. 이상의 결과로부터 개량된 manual법에 의래 추출된 DNA를 대상으로 계통학적 군집해석을 수행한 결과가 보다 더 다양한 계통군을 검출할 수 있음이 밝혀졌다. 한편, ISOIL kit를 이용하여 구축된 총clone중 약40%가${\alpha}-proteobacteria$ 계통군에 속하였으며, 약 30%가 ${\gamma}-Proteobacteria$ 계통군에 속하여 우점 계통군으로 확인된 반면, manual법에 의해 구축된 clone의 41%가 Acidobacteria 계통군에 속하였고 ${\alpha}-proteobacteria$(28%)가 우점 계통군으로 분포하는 계통학적 특징을 나타내어 DNA추출법에 따라 토양 세균군집 구조의 계통학적 특성 이 상이하게 나타나고 있음을 알 수 있었다.

Abstract ▼ AI-Helper

The principal objective of this study was to analyze 16S rDNA-ARDRA of the humus forest soil via an improved manual method and an ISOIL kit on the basis of the UPGMA clustering of the 16S rDNA combined profile, 44 ARDRA clusters of 76 clones via the ISOIL kit method and 45 ARDRA clusters of 136 clones via the improved manual method. On the basis of the 16S rDNA sequences, 44 clones from the ARDRA clusters by the ISOIL kit were classified into 3 phyla : ${\alpha}-,\;{\beta}-,\;{\gamma}-,\;{\delta}-Proteobacteria$, Acidobacteria and Actinobacteria. Using the improved manual method, the specimens were classified into 6 phyla : the ${\alpha}-,\;{\beta}-,\;{\gamma}-,\;{\delta}-Proteobacteria$, Acidobacteria, Bacteroides, Verrucomicrobia, Planctomycetes and Gemmatomonadetes. As a result, the modified manual method indicated greater phylogenetic diversity than was detected by the ISOIL kit. Approximately 40 percent of the total clones were identified as ${\alpha}-Proteobacteria$ and 30 percent of the total clones were ${\gamma}-Proteobacteria$ and assigned to dominant phylogenetic groups using the ISOIL kit. Using the modified manual method, 41 percent of the total clones were identified as Acidobacteria and 28 percent of total clones were identified as ${\alpha}-proteobacteria$ and assigned to dominant phylogenetic groups.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

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문제 정의

본 연구에서는 분자생태학 분야에서 일반적으로 널리 이용되고 있는 Rapid법과 Rapid법의 정제과정 중 PCR 저해물질 등 불순물을 효과적으로 제거하기 위해 CTAB (cetyltrimethylammonium bromide)를 첨가하여 사용하는 개량된 manual법 그리고 bead beating을 통하여 토양입자 내 세포 용균율을 높이고 skim milk 정제단계를 거쳐 고도로 정제된 DNA를 얻을 수 있도록 개발된 ISOIL kit를 이용하여 산림토양의 부식층 토양 시료로부터 DNA를 추출하고 PCR 증폭을 비교 평가하였다. 통상적인 Rapid법을 이용하여 추출된 DNA 농도(흡광도; O.
평가하여 왔다(18). 본 연구에서는 상수리나무림 산림토양의 부식층 내 세균군집의 계통학적 다양성을 평가하기 위하여 상기의 개량된 manual법과 ISOIL kit를 이용하여 각각 추출된 DNA를 대상으로 16S rDNA PCR 증폭산물을 pGEM-T easy vector에 cloning하고 구축된 clone에 대해 ARDRA (amplified rDNA restriction analysis)법, 즉 Haelll와 Alul 제한효소를 각각 처리하여 나타난 DNA fiagment의 양상에 따라 토양 세균 군집의 유전적 다양성을 분석흐)는 방법에 의거하여 상수리나무림 각 층위 내 세균군집의 계통학적 다양성을 비교 검토하였다.
본 연구에서는 현재 광범위하게 이용되고 있는 DNA 직접추출법(Rapid 법)과 정제단계 일부를 개량하여 토양시료 내 불순물을 효과적으로 제거하는 개량된 manual법을 이용하여 DNA를 직접 추출하고, 기존의 Kit보다 DNA 추출단계가 간편하고 환경 시료 내 불순물을 효과적으로 제거할 수 있도록 개발된 ISOIL kit를 이용하여 산림토양의 부식층 토양으로부터 각각 추출한 DNA를 대상으로 세균군집의 계통학적 다양성을 비교 검토하였다.

제안 방법

16S rDNA를 증폭하기 위해서 E. coll 16S rDNA 부분의 conserved sequence를 기초로 하여 27F (5-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3') primer와 1492R (S-AAGGAGCTGATCCAGCC GCA-3') primer를 이용하였다(3). PCR 조건은 lx PCR buffer, 0.
6 M NaCl이 포함된 13% PEG를 첨가하여 DNA pellet 을 얻었다. DNA pellet을 건조한 후 750μ1의 d.w를 첨가하여 37℃에서 녹이고 10 M NH₄OAc 190 gl, 1.5 ml의 ethanol 그리고 750 |il isopropanol을 첨가하여 DNA를 농죽하고 70% ethanol 1 ml 로 세척한 후 진공건조 (Micro Vac MV-100, TOMY)하였다. 최종 50 μ1의 D.
침전물에 washing solution 1 ml를 넣은 후 12,000xg에서 10분간 원심분리하였고 상등액을 제거하고 70% ethanol 1 ml 와 ethachinmate 2 μ1를 첨가하여 12,000xg에서 원심분리한 후 DNA pellet을 얻었다. DNA pellet을 진공건조(Micro Vac MV- 100, TOMY)하고 100μ1의 TE buffer를 첨가하여 전기영동 (Mupid-21, Gel documentation system, Bio-Rad)을 통해 DNA를 확인하였으며, Spectrophotometor (UV-1650PC, SHIMAZU)로 농도를 확인하고 흡광도 A₂₆₀A₂₈₀비를 계산하여 순도를 측정하였다.
를 첨가하여 DNA를 녹이고 전기영동(Mupid-21, Gel documentation system, Bio-Rad)을 통해 추출 여부를 확인하였다. DNA농도는 Spectrophotometor (UV- 1650PC, SH₁MAZU)을 이용하여 측정하였으며 흡광도 비를 순도로 계산하였다.
LB 배지 450 μ1를 첨가한 다음 3/C에서 144xg로 1시간 동안 진탕배양 한 후, X-gal (20 mg/ml) 1 ml, ITPG (20 mg/ml) 100 jil, 그리고 ampicillin (20 mg/ml) 1 ml이 포함된 LB 한천배지에 도말하여, 37℃에서 24시간 배양하였다. LB plate에 생성된 white colony를 분리하여 clone library 를 만든 후 T7 (5'-TAATACGA CTCACTATAGGG-3') primer와 SP6 (5'-TATTTAGGTGACACT ATAG-3') primer> 사용하여 colony PCR을 수행하였다(20, 23). colony PCR을 위하여 lx PCR buffer, 0.
반응 부피는 50μ1으로 핵산증폭기 (GeneAmpR PCR System 9700, Applied Biosystems)을 이용하여 94℃에서 5분간 반응한 다음 94℃에서 denaturation 1분, 58℃에서 annealing 30초, 72℃에서 extension 1분을 30회 반복하고 72℃에서 10분간 final extension 반응시켰다. PCR 증폭산물은 1% agarose gel에서 전기영동 (Mupid-21, Gel Documentation system, Bio-Rad)하여 증폭 여부를 확인하였다(20). 증폭된 16S rDNA는 ethanol precipitation 법으로 정제한 후, 30 μ1의 D.
3 μ1를 잘 혼합한 후 cycle sequencing을 실시하였다. PCR산물은 100% ethanol 50 와 3 M sodium acetate (pH 5.2) 2jil를 첨가한 후 12,000xg에서 20 분간 원심분리하고, 250 μ1의 70% ethanol로 세척하여 건조시킨후 HiDi Formamide 20 μ1를 첨가하여 95℃에서 2분 동안 denaturation한 후 얼음 위에서 냉각시키고 ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems)를 사용하여 16S rDNA (350-600 bp) 염기서열을 결정하였고, 유사도는 RDP II (Ribosomal Database Project II) database의 Sequence Match program을 이용하여 비교하였다. 각 염기서열의 상동성은 alignment clustal X program을 이용하여 병렬로 정렬하였고 계통도 작성은 근린 결합법(28)에 의거 결정하였다(21).
Sequencing PCRe BigDye 1.3 |il, T7 primer 1 p.1, 16S rDNA sample (100 ng) 1 |xl, 5x buffer 3.4에 D.W. 13.3 μ1를 잘 혼합한 후 cycle sequencing을 실시하였다. PCR산물은 100% ethanol 50 와 3 M sodium acetate (pH 5.
Takada 등의 bead beating 방법(26)에 DNA 직접추출과정 중 skim milk가 첨가되어 토양 DNA안의 부식산 제거 효과가 탁월하다고 밝혀진 ISOIL kit를 이용하여 부식층에서 채취한 시료로부터 total DNA의 추출하였다. 토양시료 0.
LB plate에 생성된 white colony를 분리하여 clone library 를 만든 후 T7 (5'-TAATACGA CTCACTATAGGG-3') primer와 SP6 (5'-TATTTAGGTGACACT ATAG-3') primer> 사용하여 colony PCR을 수행하였다(20, 23). colony PCR을 위하여 lx PCR buffer, 0.2 mM dNTPs, 0.2 |1M primer, 2.5 U Taq DNA polymerase (Solgent co., Korea)에 D.W. 를 넣어 최종 50 μ1의 반응물을 0.2 ml PCR tube에 넣고 잘 혼합한 후 95P에서 5분간 반응한 다음 94℃에서 denaturation 30초, 55℃에서 annealing 30초, 72℃에서 extension 1분을 30회 반복하고 72℃에서 7분간 final extension의 조건으로 PCR (GeneAmpR PCR System 9700, Applied Biosystems)반응을 실시하였다.
산림토양의 부식층 내에 분포하는 세균군집 구조의 계통 학적 다양성을 비교하기 위하여 각 시료의 ARDRA 분석에 따른 다양성 지수와 균등도 지수를 확인하였다. ISOIL kit를 이용한 경우, 다양성지수가 4.
산림토양의 부식층에서 채취한 시료로부터 total DNA의 추출은 Tsai 등이 제안한 sodium dodecyl sulfate (SDS)를 첨가하고 freezing과 thawing을 반복 실시하여 세포의 용해를 돕는 방법인 Rapid법(10, 18, 31)을 개량하여 cell lysis 후, CTAB를 첨가하여 정제하는 manual법으로 total DNA를 추출하였다. 토양시료 5 g 에 120 mM phosphate buffer (pH 8.
상수리나무림의 부식층으로부터 서로 다른 DNA 추출 방법에 의해 구축된 각 clone cluster로부터 대표 clone을 선발하여 16S rDNA 염기서열을 결정하고, RDP II (Ribosomal Database Project II) database-2] Sequence Match program을 이용하여 상동성 검색을 수행하였다.
선별된 done의 16S rDNA PCR 증폭산물에 대하여 제한효소 Haelll (Promega, USA) 와 Alul (TAKARA, Japan)을 각각 처리하여 나타난 band 절단 양상을 관찰하였다(3, 19). PCR product 1 gg, 10x buffer 2 |il, enzyme (500 unit) 1 pl, D.
정제한 16S rDNA 를 주형으로 ABI PRISM BigDye Tenninator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems)를 사용하여 염기서열을 결정하였다. Sequencing PCRe BigDye 1.
로 총 20 |xl 를 반응 tube에 넣은 후 37P에서 4시간 반응시켰다. 제한효소를 처리한 산물은 4% agarose gel (lx TAE buffer; 40 mM Trisacetate, 1 mM EDTA)을 사용하여 100 V, 300 mA로 1시간 30 분 동안 전기영동한 후 ethidium bromide (EtBr)로 30분간 염색하여 UV (Gel documentation system, Bio-Rad)하에서 제한효소의 절단 양상을 확인하였다. 확인된 band의 patterne Gel Compar II program (version 4.
증폭된 16S rDNA의 cloninge pGEM-T Easy Vfector Systems (Promega, USA)을 이용하여 실시하였다(7, 22). DNA 50 ng, lx buffer, T Easy Vector 50 ng, T4 DNA Ligase 1에 D.
5 ml의 ethanol 그리고 750 |il isopropanol을 첨가하여 DNA를 농죽하고 70% ethanol 1 ml 로 세척한 후 진공건조 (Micro Vac MV-100, TOMY)하였다. 최종 50 μ1의 D.W.를 첨가하여 DNA를 녹이고 전기영동(Mupid-21, Gel documentation system, Bio-Rad)을 통해 추출 여부를 확인하였다. DNA농도는 Spectrophotometor (UV- 1650PC, SH₁MAZU)을 이용하여 측정하였으며 흡광도 비를 순도로 계산하였다.
0) 8 ml을 첨가하여 -70℃ deep fieeezei에서 냉동과 6*>5C 에서 얼림과 녹임을 3회 반복한 후, 5, 600xg에서 10분간 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 획득된 상등액에 5M NaCl 2.7 μ1와 10% CTAB 2.1 μ1를 첨가하고 12,000xg에서 10분간 원심분리하고 상등액과 동일 한양의 1.6 M NaCl이 포함된 13% PEG를 첨가하여 DNA pellet 을 얻었다. DNA pellet을 건조한 후 750μ1의 d.

대상 데이터

본 연구에서는 공주시 계룡산 북사면에 밀집해 있는 상수리나 ^-(Quercus acutissima Carruth)림을 조사지로 선정하였다. 상수리나무림 지역은 매년 정기적으로 낙엽 및 낙지가 유입되어 이들 낙엽분해가 진행되면서 부식층(humus layer)을 형성하였다.
상수리나무림 지역은 매년 정기적으로 낙엽 및 낙지가 유입되어 이들 낙엽분해가 진행되면서 부식층(humus layer)을 형성하였다. 상수리나무림 낙엽층 15~20 cm 하층부의 부식층으로부터 시료를 채취하였다.

데이터처리

0; Applied Maths, Belgium)을 이용하여 band 단편(restriction fragment; RF)양상을 비교 분석하였다. 각 band 단편의 유사도는 Dice's similarity coefficients. 유사도 지수(S)를 계산하고, dendrograme UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic average)로 작성하였다(18, 21).
총 76 clones을 구축하였다. 이들 clones에 대하여 제한효소 Haelll와 AluI을 각각 첨가함에 따라 나타난 16S DNA 단편 (restriction fragment; RF) 양상은 Gel Compar II program (version 4.0; Applied Maths, Belgium) software를 이용하여 각 clone간의 다양성을 비교하고 UPGMA 분석을 위한 Matrix를 구하여 유사도를 확인하였다.
제한효소를 처리한 산물은 4% agarose gel (lx TAE buffer; 40 mM Trisacetate, 1 mM EDTA)을 사용하여 100 V, 300 mA로 1시간 30 분 동안 전기영동한 후 ethidium bromide (EtBr)로 30분간 염색하여 UV (Gel documentation system, Bio-Rad)하에서 제한효소의 절단 양상을 확인하였다. 확인된 band의 patterne Gel Compar II program (version 4.0; Applied Maths, Belgium)을 이용하여 band 단편(restriction fragment; RF)양상을 비교 분석하였다. 각 band 단편의 유사도는 Dice's similarity coefficients.

이론/모형

각 시료 내 세균군집의 다양도 지수(Diversity Index)는 Maigalef의 정보이론에 의해 유도된 Shannon-Weaver funtion (H)의 공식을 이용하여 산출하였고(25), 균등도 지수(Evenness Index)는 Pielov에 의해 제안된 지수를 적용하여 계산하였다(9).
2) 2jil를 첨가한 후 12,000xg에서 20 분간 원심분리하고, 250 μ1의 70% ethanol로 세척하여 건조시킨후 HiDi Formamide 20 μ1를 첨가하여 95℃에서 2분 동안 denaturation한 후 얼음 위에서 냉각시키고 ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Applied Biosystems)를 사용하여 16S rDNA (350-600 bp) 염기서열을 결정하였고, 유사도는 RDP II (Ribosomal Database Project II) database의 Sequence Match program을 이용하여 비교하였다. 각 염기서열의 상동성은 alignment clustal X program을 이용하여 병렬로 정렬하였고 계통도 작성은 근린 결합법(28)에 의거 결정하였다(21).
각 band 단편의 유사도는 Dice's similarity coefficients. 유사도 지수(S)를 계산하고, dendrograme UPGMA (unweighted pair group method using arithmetic average)로 작성하였다(18, 21).

성능/효과

그러나 토양의 양을 고려하였을 때, 그 차이가 비교적 낮아 추출되는 DNA 수율 및 순도에 있어서 ISOIL kit의 방법이 더 우수한 것으로 판단되었다. DNA 순도에서 확인할 수 있었듯이 PCR 저해 물질이 효과적으로 정제되지 않는 기존의 Rapid 법을 이용한 DNA 추출법으로는 토양 내 부식산 등이 다량 함유되어 있는 산림토양의 세균군집 해석에는 적당하지 않다고 판단되었다.
ISOIL kit를 이용하여 추출된 DNA를 대상으로 구축된 44개 16S rDNA-ARDRA clone cluster로부터 선발된 대표 clone의 16S rDNA 염기서열을 확인한 결과 a-, P-, y-, 8-Proteobacteria, Acidobacteria 및 Actinobacteria phylum의 3개의 계통군이 확인되었다. 이들 각 16S rDNA-ARDRA clone cluster에 속하는 clone들은 Caulobacterales (4 clones), Rhizobiales (20 clones) 그리고 unclassified alphaproteobacteria를 포함하는 a-Proteobacteria 계통군과 Burkholderiales (6 clones), unclassified betaproteobacteria (2 clones)를 포함하는 P-Proteobacteria 계통군, Xathononadales (6 clones), unclassified gammaproteobacteria (15 clones)을 포함하는 y-Proteobacteria 계통군, unclassified deltaproteobacteria 계통 군(2 clones), Acidobacteriaceae 계통군(12 clones), Micro- bacteriaceae 계통군(1 clone) 그리고 uncultured Actinobacteria 계통군(2 clones)이 확인되었다(Fig.
개량된 manual법에 의해 구축된 각 16S rDNA-ARDRA clone이나ster로부터 선발된 45개 대표 clone의 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과 a-, p-, y-, 6-Proteobactaia, Acidobacteria, Bacteroides, Verrucomicrobia, Planctomycetes, Gemmatomonadetes phylum 총 6개의 다양한 계통군이 확인되었다. 이들 각 16S rDNA-ARDRA clone cluster0]] 속하는 clone들은 unclassified Rhodospirillales (12 clones), Rhizobiales (22 clones) 그리고 unclassified alpha- proteobacteria (4 이ones)를 포함하는 a-Proteobacteria 계통군과 Bulkholderiales (5 clones) 그리고 unclassified betaproteo-bacteria (17 clones)를 포함하는 p-Proteobacteria 계통군, unclassified gammaproteobacteria 계통군(1 clone), Myxococcales (1 clone)를포함하는 8-Proteobacteria 계통군, Acidobacteriaceae (56 clones) 를 포함하는 Acidobacteria 계통군, Crenotrichaceae (1 clone)와 Sphingobacteriaceae (5 c* lones) 포함하는 Bacteroides 계통군, uncultured Verrucomicrobia bacterium (3 clones)# 포함하는 Verrucomicrobia 계통군, unclassified Planctomycetaceae (7 clones)을 포함하는 Planctomycetes 계통군 그리고 Gemmati- monadaceae (2 clones)# 포함하는 Gemmatimonadetes 계통 군의 매우 다양한 계통군이 확인되었다(Fig.
개량된 manual법에 의해 구축된 총 136 clonese genus 수준에서 분류가 가능한 유사도 70%에서 45개 ARDRA cluster로 분류되었으며(17) ISOIL kit에 의해 구축된 총 76개 clonese 유사도 70%에서 44개 ARDRA cluster로 확인되었다(Fig. 1).
5 g의 토양을 사용하는 ISOIL kit에 비해 5 g의 토양을 사용하여 DNA를 추출하는 rapid 법과 개량된 manual법에서 비교적 높은 농도의 DNA가 추출되었다. 그러나 토양의 양을 고려하였을 때, 그 차이가 비교적 낮아 추출되는 DNA 수율 및 순도에 있어서 ISOIL kit의 방법이 더 우수한 것으로 판단되었다. DNA 순도에서 확인할 수 있었듯이 PCR 저해 물질이 효과적으로 정제되지 않는 기존의 Rapid 법을 이용한 DNA 추출법으로는 토양 내 부식산 등이 다량 함유되어 있는 산림토양의 세균군집 해석에는 적당하지 않다고 판단되었다.
87로 나타났다. 또한, 개량된 manual법을 이용한 경우, 다양성 지수는 5.04이었으며, 균등도 지수는 0.92로 확인되었다(Fig. 3). 이상의 결과로부터 개량된 manual법을 이용하여 추출된 DNA를 대상으로 분석한 결과가 ISOIL kit를 이용한 경우보다 풍부한 종 구성과 안정적인 균등도 지수를 확인할 수 있음이 밝혀졌다.
부식층 토양시료로부터 추출된 DNA의 16S rDNA PCR 증폭 산물을 cloning한 결과 개량된 manual법에 의해 추출된 DNA의 경우 136 clones 그리고 ISOIL kit를 이용하여 추출한 DNA의 경우 총 76 clones을 구축하였다. 이들 clones에 대하여 제한효소 Haelll와 AluI을 각각 첨가함에 따라 나타난 16S DNA 단편 (restriction fragment; RF) 양상은 Gel Compar II program (version 4.
7%)의 순으로. 분포하는 계통학적 특징을 나타내어 DNA 추출법에 따라 우점하는 토양세균 군집 구조의 계통학적 특성이 상이하게 나타나고 있음을 알 수 있었다.
상기의 ISOIL kit를 이용하여 구축된 각 clone 중 약 40%가 a-Proteobacteria 계통군에 속하였으며, 약 30%가 y-Proteobacteria 계통군에 속하여 우점 계통군으로 나타났고, Acidobacteria (15.8%), P-Proteobacteria (10.4%), Actinobacteria (3.9%) 및 8- Proteobacteria (2.6%)의 순으로 분포하는 계통학적 특징을 나타내었다.
다양한 계통군이 확인되었다. 이들 각 16S rDNA-ARDRA clone cluster0]] 속하는 clone들은 unclassified Rhodospirillales (12 clones), Rhizobiales (22 clones) 그리고 unclassified alpha- proteobacteria (4 이ones)를 포함하는 a-Proteobacteria 계통군과 Bulkholderiales (5 clones) 그리고 unclassified betaproteo-bacteria (17 clones)를 포함하는 p-Proteobacteria 계통군, unclassified gammaproteobacteria 계통군(1 clone), Myxococcales (1 clone)를포함하는 8-Proteobacteria 계통군, Acidobacteriaceae (56 clones) 를 포함하는 Acidobacteria 계통군, Crenotrichaceae (1 clone)와 Sphingobacteriaceae (5 c* lones) 포함하는 Bacteroides 계통군, uncultured Verrucomicrobia bacterium (3 clones)# 포함하는 Verrucomicrobia 계통군, unclassified Planctomycetaceae (7 clones)을 포함하는 Planctomycetes 계통군 그리고 Gemmati- monadaceae (2 clones)# 포함하는 Gemmatimonadetes 계통 군의 매우 다양한 계통군이 확인되었다(Fig. 2).
이들 각 16S rDNA-ARDRA clone cluster에 속하는 clone들은 Caulobacterales (4 clones), Rhizobiales (20 clones) 그리고 unclassified alphaproteobacteria를 포함하는 a-Proteobacteria 계통군과 Burkholderiales (6 clones), unclassified betaproteobacteria (2 clones)를 포함하는 P-Proteobacteria 계통군, Xathononadales (6 clones), unclassified gammaproteobacteria (15 clones)을 포함하는 y-Proteobacteria 계통군, unclassified deltaproteobacteria 계통 군(2 clones), Acidobacteriaceae 계통군(12 clones), Micro- bacteriaceae 계통군(1 clone) 그리고 uncultured Actinobacteria 계통군(2 clones)이 확인되었다(Fig. 3).
Rapid법에 의해 추출된 DNA는 16S rDNA PCR 증폭이 이루어지지 않았으나, 개량된 manual법과 ISOIL kit법을 이용해 추출된 DNA를 주형으로 한 경우 성공적으로 16S rDNA의 PCR증폭 산물을 얻을 수 있었다(Table 1). 이상의 결과로부터 0.5 g의 토양을 사용하는 ISOIL kit에 비해 5 g의 토양을 사용하여 DNA를 추출하는 rapid 법과 개량된 manual법에서 비교적 높은 농도의 DNA가 추출되었다. 그러나 토양의 양을 고려하였을 때, 그 차이가 비교적 낮아 추출되는 DNA 수율 및 순도에 있어서 ISOIL kit의 방법이 더 우수한 것으로 판단되었다.
3). 이상의 결과로부터 개량된 manual법을 이용하여 추출된 DNA를 대상으로 분석한 결과가 ISOIL kit를 이용한 경우보다 풍부한 종 구성과 안정적인 균등도 지수를 확인할 수 있음이 밝혀졌다.
통상적인 Rapid법을 이용하여 추출된 DNA 농도(흡광도; O.D₂₆₀)는 105 ng/μ1로 순도(A₂₆₀/A₂₈₀비)가 0.89로 매우 낮았으며, 상기의 추가한 개량된 manual법을 이용하여 DNA를 추출한 결과, DNA 농도는 110 ng/μ1로 통상적인 Rapid법과 큰 차이가 없었으나 순도(A₂₆₀/A₂₈₀비)가 1.13으로 측정되었다. 한편, ISOIL kit를 이용하여 DNA를 추출한 결과, 순도(A₂₆₀/A₂₈₀비)가 1.
한편 개량된 manual법에 의해 추출된 DNA를 이용하여 구축된 clone의 41.3%가 Acidobacteria 계통군에 속하였으며, 27.9% 가 a-Proteobacteria 계통군에 속하여 우점 계통군으로 나타났고, P-Proteobacteria (16.2%), Planctomycetes (5.1%), Bacteroides (4.4 %), Verrucomicrobia (2.2%), Gemmatomonadetes (1.5%), y- Proteobacteria (0.7%), 8-Proteobacteria (0.7%)의 순으로. 분포하는 계통학적 특징을 나타내어 DNA 추출법에 따라 우점하는 토양세균 군집 구조의 계통학적 특성이 상이하게 나타나고 있음을 알 수 있었다.
13으로 측정되었다. 한편, ISOIL kit를 이용하여 DNA를 추출한 결과, 순도(A₂₆₀/A₂₈₀비)가 1.79로 정제면에서 월등히 우수하였다. 그러나 DNA 농도가 98 ng/μ1로 manual 법에 비해 다소 낮게 나타났다(Table 1).

후속연구

검토가 필요하다고 판단된다. 본 연구 결과는 토양미생물 군집의 분자생태학적 접근 방법의 기초자료로 활용 될 수 있으리라 기대한다.
최근 미생물생태학 실험실에서는 간편하고 쾌속하게 DNA를 추출할 수 있고 토양시료 내 부식산 등을 제거해 줄 수 있는 다양한 종류의 DNA 추출 Kit를 사용하여 토양세균 군집의 계통학적 해석을 수행하고 있으나, 본 연구 결과에서 밝혀진 바와 같이 토양세균 군집 구조의 계통학적 해석을 위해서는 대상으로 하는 토양 시료의 특성에 따라 DNA 추출법을 고려한 계통학적 다양성 비교 검토가 필요하다고 판단된다. 본 연구 결과는 토양미생물 군집의 분자생태학적 접근 방법의 기초자료로 활용 될 수 있으리라 기대한다.

참고문헌 (33)

임미라, 유찬, 조재창 . 2003. 환경시료의 생물군집핵산 (community DNA) 추출법 비교 J. Environ. Sci. Eng. 5, 17-19
조성진, 박천서, 엄대익, 토양학, 2002. 향문사
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저자의 다른 논문 :

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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