본 연구는 큰비쑥를 80% EtOH로 추출하고 극성에 따른 용매분획을 실시하여 혈핵암 세포주를 대상으로 분획별에 따른 암세포 증식억제(cytotoxicity) 효과와 이러한 혈액암 세포주에 대한 세포독성 효과가 세포자연사(apoptosis)에 의해 일어나는 것인지, 몇 가지 apoptosis 유도 실험을 통해 확인해 보았다. HL-60 세포에 대한 증식억제 효과는 전반적으로 모든 처리구에서 농도의존적인 세포증식 억제효과가 나타났으며, 특히 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 가장 강한 세포성장 억제효과가 나타났다. 이러한 세포성장 억제효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위해 apoptosis 유도에 의한 세포사멸의 특징인 DNA 단편화 현상을 비롯하여 세포형태학적 변화 및 유동세포분석기를 통한 DNA content를 측정한 결과, 큰비쑥 추출물에 의한 암세포 증식억제효과는 apoptosis를 유도하여 세포자연사를 통해 세포의 성장을 억제하는 것으로 확인되었다.
본 연구는 큰비쑥를 80% EtOH로 추출하고 극성에 따른 용매분획을 실시하여 혈핵암 세포주를 대상으로 분획별에 따른 암세포 증식억제(cytotoxicity) 효과와 이러한 혈액암 세포주에 대한 세포독성 효과가 세포자연사(apoptosis)에 의해 일어나는 것인지, 몇 가지 apoptosis 유도 실험을 통해 확인해 보았다. HL-60 세포에 대한 증식억제 효과는 전반적으로 모든 처리구에서 농도의존적인 세포증식 억제효과가 나타났으며, 특히 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 가장 강한 세포성장 억제효과가 나타났다. 이러한 세포성장 억제효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위해 apoptosis 유도에 의한 세포사멸의 특징인 DNA 단편화 현상을 비롯하여 세포형태학적 변화 및 유동세포분석기를 통한 DNA content를 측정한 결과, 큰비쑥 추출물에 의한 암세포 증식억제효과는 apoptosis를 유도하여 세포자연사를 통해 세포의 성장을 억제하는 것으로 확인되었다.
The present study describes the cytotoxic effect of Artemisia fukudo extracts. The extract from A. fukudo by 80% ethanol was fractionated with n-hexane, dichloromethane, ethylacetate, and butanol in serial. The cytotoxicity of A. fukudo extracts was examined for its effect on the growth of HL-60 cel...
The present study describes the cytotoxic effect of Artemisia fukudo extracts. The extract from A. fukudo by 80% ethanol was fractionated with n-hexane, dichloromethane, ethylacetate, and butanol in serial. The cytotoxicity of A. fukudo extracts was examined for its effect on the growth of HL-60 cells by the colorimetric 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. In addition, we used the HL-60 cells to see what effects the A. fukudo extracts will have on apoptosis of cancer cells. We checked the cell activity, cell morphologic changes, DNA fragmentation, and DNA content after 24 hr incubation with administering 25 ${\mu}g/mL$ of the A. fukudo extracts. In the treatment of the low concentration of n-hexane and dichloromethane fractions, the survival rate of HL-60 cells is lower than that of the control. The laddering-pattern DNA fragmentation was observed in the treatment with n-hexane and dichloromethane fractions. The DNA content of the cells apoptosis measured as the density of sub-$G_{1}$ hypodiploid cells by flow cytometric analysis. The number of sub-$G_{1}$ hypodiploid cells increased in the treatment with n-hexane and dichloromethane fractions. These fractions obstructed the cell cohesion and caused the blebbing of the cell membrane and fragmentation of the nucleus, both of which are symptoms of apoptosis. These results suggest that A. fukudo has a great potential value as food additives, medicinal supplements for patients with chronic diseases, and preventive measures against cancer.
The present study describes the cytotoxic effect of Artemisia fukudo extracts. The extract from A. fukudo by 80% ethanol was fractionated with n-hexane, dichloromethane, ethylacetate, and butanol in serial. The cytotoxicity of A. fukudo extracts was examined for its effect on the growth of HL-60 cells by the colorimetric 3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. In addition, we used the HL-60 cells to see what effects the A. fukudo extracts will have on apoptosis of cancer cells. We checked the cell activity, cell morphologic changes, DNA fragmentation, and DNA content after 24 hr incubation with administering 25 ${\mu}g/mL$ of the A. fukudo extracts. In the treatment of the low concentration of n-hexane and dichloromethane fractions, the survival rate of HL-60 cells is lower than that of the control. The laddering-pattern DNA fragmentation was observed in the treatment with n-hexane and dichloromethane fractions. The DNA content of the cells apoptosis measured as the density of sub-$G_{1}$ hypodiploid cells by flow cytometric analysis. The number of sub-$G_{1}$ hypodiploid cells increased in the treatment with n-hexane and dichloromethane fractions. These fractions obstructed the cell cohesion and caused the blebbing of the cell membrane and fragmentation of the nucleus, both of which are symptoms of apoptosis. These results suggest that A. fukudo has a great potential value as food additives, medicinal supplements for patients with chronic diseases, and preventive measures against cancer.
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문제 정의
각 용매별 큰 비쑥 추출물 및 순차적 분획물의 apoptosis 유도에 의하여 sub-Gi hypodiploid 세포가 증가하는지 알아보았다. 즉 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 propi dium iodide로 염색한 후 유동 세포 분석기(Flow Cytometry) 를 이용하여 세포 내 DNA 함량을 sub-Gi peak 구간을 환산하여 apoptotic c시1의 percentage로 측정하였다.
본 연구는 큰비쑥를 80% EtOH로 추출하고 극성 에 따른 용매 분획을 실시하여 혈핵암 세포주를 대상으로 분 획별에 따른 암세포 증식 억 저】(cytotoxicity) 효과와 이러한 혈액암 세포주에 대한 세포독성 효과가 세포자연사(apoptosis) 에의 해 일어나는 것인지, 몇 가지 apoptosis 유도 실험을 통해 확인해 보았다. HL-60 세포에 대한 증식억제 효과는 전반적으로 모든 처리 구에서 농도 의존적 인 세포증식 억제 효과가 나타났으며, 특히 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 가장 강한 세포성장 억제 효과가 나타났다.
본 연구에서는 쑥 속 식물 중 바닷가에 주로 서식하는 큰 비쑥(Artemisia fukudo; 갯 쑥)을 대상으로 그 유효성분이 항암제 개발의 기초자료로 사용될 수 있는지 탐색하고, 식품 산업에서 항암효과를 가진 기능성 식품으로의 가능성을 밝히고자 극성에 따라 순차적으로 용매 분획하여 각 분획물의 일정량을 혈액암 세포주인 HL-60 세포에 첨가함으로써 암세포증식억제(cytotoxicity) 효과와 이러한 인체 암세포주에 미치는 각 용매 분 획별 쑥 성분들의 생리활성이 세포자연사 (apoptosis)에 의한 것인지 몇 가지 apoptosis 유도 실험을 통해 확인해 보았다.
(25-28). 이에 apoptosis가 일어난 세포에서 볼 수 있는 가장 특징적인 변화인 형태학적 변화를 조사하였다. 그 결과 정상 세포핵의 형태는 정상적인 둥근 형태이나 헥산과 디클로로메탄 분획물이 처리된 세포에서는 세포의 크기가 축소되며, 핵의 모양이 불규칙하고 부분적인 핵의 응집현상을 관찰할 수 있었다(Fig.
제안 방법
HL-60 세포(3.5x105/2)에 시료를 처리하여 배양이 끝난 후 세포를 수집하여 Promega Wizard® Genomic DNA Purification kit(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA를 1.
5xl05/mL) 에 시료 농도를 25μg/mL로 처리하여 24시간 배양한 후, HL-60 세포를 수확하여 PBS로 세척하였다. HL-60 세포를 4℃에서 70% 에탄올로 30분 동안 고정시킨 毛 PBS로 세척하고, RNase A를 처리한 다음 propidium iodide(PI; Sigma)로 염색 하고, BD FACSCalibur 파 Flow Cytometer(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 로세포주기를 분석하였다.
, Winooski Vermont, WI, US A)를 사용하여 540 nm 에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군의 흡광도 값과 비교하여 세포 증식억제 정도를 조사하였다.
상기의 과정을 3회 반복 추출하여 에탄올 추출물을 얻은 뒤, 건조된 에탄올 추출물에 10배 량의 증류수와 동량의 헥산을 첨가하여 분획한 후 감압 농축하여 헥산 분획물을 얻었다. 동일한 방법으로 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물 층을 분획하여 각각의 순차 분획물을 얻었으며, 모든 과정은 3회 반복 실시하였다.
5x105/2)에 시료를 처리하여 배양이 끝난 후 세포를 수집하여 Promega Wizard® Genomic DNA Purification kit(Promega, Madison, WI, USA)를 이용하여 DNA를 분리하였다. 분리한 DNA를 1.0% agarose gel에서 20분(100 V) 동안 전기영동을 한 다음 ethidium bromide로 염 색하고 UV transilluminator 하에서 DNA 단편화 현상을 관찰하였다.
즉 분말 건조된 시료에 80% 에탄올로 추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압 농축하여 동결건조기로 완전 건조시켰다. 상기의 과정을 3회 반복 추출하여 에탄올 추출물을 얻은 뒤, 건조된 에탄올 추출물에 10배 량의 증류수와 동량의 헥산을 첨가하여 분획한 후 감압 농축하여 헥산 분획물을 얻었다. 동일한 방법으로 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물 층을 분획하여 각각의 순차 분획물을 얻었으며, 모든 과정은 3회 반복 실시하였다.
세포자사멸의 형태학적 특징 중의 하나인 핵의 변화를 관찰하기 위해 HL-60세포(3.5 XL 05/mL)에시료를 처리하여 배양이 끝나기 30분 전에 DNA 특이적으로 결합하는 생체 형광 염색액인 Hoechst 33342(Sigma Chemical Co.)를 사용하여 DNA를 염색하고 형광현미경으로 관찰하였다.
에탄올 추출물 및 순차적 용매분획물의 HL-60 세포의 성장에 대한 세포증식 억제효과는 tetrazolium salt의 하나인 MTT를 사용하여 MTT의 환원에 의해 생성되는 formazan 의 흡광도로 측정하였다. 그 결과 큰 비쑥 80% 에탄올 추출물의 ICso 값은 108.
즉 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 propi dium iodide로 염색한 후 유동 세포 분석기(Flow Cytometry) 를 이용하여 세포 내 DNA 함량을 sub-Gi peak 구간을 환산하여 apoptotic c시1의 percentage로 측정하였다. 그 결과, 헥산 및 디클로로메탄 분획물에서 HL-60 세포에 25 Lig/n工의농도로 처리하여 control과 비교 관찰 시, sub-Gi hypo diploid 세포가 control(5.
큰 비쑥 용매 분획물의 세포독성효과에 의한 HL-60 세포에서의 세포증식 억제작용이 apoptosis 유도에 의한 것인지 그 기전을 알아보기 위하여, apoptosis 유도에 의하여 나타나는 DNA 단편화 현상을 전기영동을 통해 확인하였다. 에탄올 추출물 및 순차적 용매 분획물의 농도를 25 μg/mL로 하여 관찰한 결과 헥산 및 디클로로메탄 분획물에서 HL-60 세포에 대한 DNA 단편화 현상이 가장 두드러지게 나타났다 (Fig.
큰 비쑥의 에탄올 추출물 및 순차적 분획물의 제조는 80% 에탄올(EtOH) 및 분획용 헥산(n-hexane), 디클로로메탄 (CH2CI2), 에틸아세테이트(EtOAc) 그리고 부탄올(BuOH) 을 사용하여 용매의 극성을 이용한 순차적 추출법을 사용하였다. 즉 분말 건조된 시료에 80% 에탄올로 추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압 농축하여 동결건조기로 완전 건조시켰다.
대상 데이터
급성 전골 수성 백혈병 환자에서 유래한 HL-60 세포주를 한국세포주은행 (KCLB)으로부터 분양받아 100 units/mL 의 penicillin-streptomycin(GIBCO; Grand Island, NY, USA)과 10%의 fetal bovine serum(FBS; GIBCO, Grand Island)이 함유된 RPMI 1640배지 (GIBCO; Grand Island)를사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 계대 배양은 3~4일에 한 번씩 시행하였다.
제주도 해안가 일대에 자생하고 있는 큰비쑥前a fukudo)을 2006년 9월경에 채집하여 대한식물도감(19)을 참고하여 동정하였으며, 채집된 시료는 증류수로 2~3회 수세한 뒤 물기를 제거하여 2주간 음건한 후 마쇄기로 분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.
데이터처리
그룹 간의 유의적인 통계 차를 분석하기 위하여 p<0.05의 유의 수준에서 Duncan's multiple range test를 실시하였다.
실험 결과는 SAS program(statistical analysis system)을이용하여 분석하였고, 평균치와 표준편차로 나타냈다. 그룹 간의 유의적인 통계 차를 분석하기 위하여 p<0.
이론/모형
각 용매별 큰 비쑥 추출물 및 순차적 분획물의 HL-60 세포에 대한 증식 억제 효과는 MTT assay 법 (20) 을 이용하여 알아보았다. HL-60 세포(5.
성능/효과
보았다. HL-60 세포에 대한 증식억제 효과는 전반적으로 모든 처리 구에서 농도 의존적 인 세포증식 억제 효과가 나타났으며, 특히 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 가장 강한 세포성장 억제 효과가 나타났다. 이러한 세포성장 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위해 apopto sis 유도에 의한 세포사멸의 특징인 DNA 단편화 현상을 비 못하여 세포형태학적 변화 및 유동 세포 분석기를 통한 DNA content를 측정한 결과, 큰 비쑥 추출물에 의한 암세포 증식억제 효과는 apoptosis를 유도하여 세포 자연사를 통해 세포의 성장을 억제하는 것으로 확인되었다.
이에 apoptosis가 일어난 세포에서 볼 수 있는 가장 특징적인 변화인 형태학적 변화를 조사하였다. 그 결과 정상 세포핵의 형태는 정상적인 둥근 형태이나 헥산과 디클로로메탄 분획물이 처리된 세포에서는 세포의 크기가 축소되며, 핵의 모양이 불규칙하고 부분적인 핵의 응집현상을 관찰할 수 있었다(Fig. 2).
흡광도로 측정하였다. 그 결과 큰 비쑥 80% 에탄올 추출물의 ICso 값은 108.69 μg/mL를 보였으며, 헥산, 디클로로메탄, 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물은 각각 13.53μg/mL, 17.01 μg/mL, 41.93μg/mL 및 127.68μg/mL의 ICso 값을 나타냈다. 그러나 잔사인 수용성 분획물인 경우는 본 연구에 사용된 농도 범위에서는 ICso 값을 구할 수가 없었으며, 전반적으로 모든 처리 구에서 농도 의존적인 세포증식 억제 효과가 나타났다.
즉 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 물질인 propi dium iodide로 염색한 후 유동 세포 분석기(Flow Cytometry) 를 이용하여 세포 내 DNA 함량을 sub-Gi peak 구간을 환산하여 apoptotic c시1의 percentage로 측정하였다. 그 결과, 헥산 및 디클로로메탄 분획물에서 HL-60 세포에 25 Lig/n工의농도로 처리하여 control과 비교 관찰 시, sub-Gi hypo diploid 세포가 control(5.75%)에 비해 에탄올 추출물은 9.09%, 헥산 분획물은 84.83%, 디클로로메탄 분획물은 85%, 에틸아세테이트 분획물은 15.52%, 부탄올 분획물은 7.31% 그리고 수용성 분획물은 6.21%로 나타났다. 특히 헥산과 디클로로메탄 분획물인 경우는 조 추출물인 에탄올 분획물에 비하여 Gr/Gi 세포가 약 5배 정도 감소되었고 sub-Gi hypo diploid 세포가 약 9.
68μg/mL의 ICso 값을 나타냈다. 그러나 잔사인 수용성 분획물인 경우는 본 연구에 사용된 농도 범위에서는 ICso 값을 구할 수가 없었으며, 전반적으로 모든 처리 구에서 농도 의존적인 세포증식 억제 효과가 나타났다. 한편 본 연구에 사용된 초기농도인 25μg/mL 에서부터 세포증식 억제율이 50% 이상을 보인 처리구는 헥산과 디클로로메탄 분획물이었으며, 농도 의존적으로 세포 성장 억제효과가 더 좋았던 분획물은 디클로로메탄 분획물이 었다.
한편 본 연구에 사용된 초기농도인 25μg/mL 에서부터 세포증식 억제율이 50% 이상을 보인 처리구는 헥산과 디클로로메탄 분획물이었으며, 농도 의존적으로 세포 성장 억제효과가 더 좋았던 분획물은 디클로로메탄 분획물이 었다. 디클로로메탄 분획물을 여러 농도로 처리하였을 때의 세포성장 억제율은 25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL 및 200μg/mL 농도에서 각각 64.54%, 79.15%, 87.66% 및 86.59%로 유의적인 세포 성장 억제 효과를 보였다(Table 2). Hwang 등(16)도 아세톤에 의해 분획 된 쑥 G4.
에탄올 추출물 및 순차적 용매 분획물의 농도를 25 μg/mL로 하여 관찰한 결과 헥산 및 디클로로메탄 분획물에서 HL-60 세포에 대한 DNA 단편화 현상이 가장 두드러지게 나타났다 (Fig. 1). 이와 같은 결과는 Hu 등(22)이 발표한 사철쑥 수용성 추출물이 사람 간암 세포주인 SMMC-7721에 대하여 세포 자연사의 전형적인 DNA 단편화 현상을 보인다는 보고와 일치한다.
25%이었다. 에탄올 추출물에 대한 각 순차 분획물 중 헥산 분획물 수율이 9.01%로 가장 낮았고, 수용성 분획물이 33.05%로 가장 높은 수율을 보였다.
HL-60 세포에 대한 증식억제 효과는 전반적으로 모든 처리 구에서 농도 의존적 인 세포증식 억제 효과가 나타났으며, 특히 헥산과 디클로로메탄 분획물에서 가장 강한 세포성장 억제 효과가 나타났다. 이러한 세포성장 억제 효과가 apoptosis 유도에 의한 것인지 알아보기 위해 apopto sis 유도에 의한 세포사멸의 특징인 DNA 단편화 현상을 비 못하여 세포형태학적 변화 및 유동 세포 분석기를 통한 DNA content를 측정한 결과, 큰 비쑥 추출물에 의한 암세포 증식억제 효과는 apoptosis를 유도하여 세포 자연사를 통해 세포의 성장을 억제하는 것으로 확인되었다.
그러나 잔사인 수용성 분획물인 경우는 본 연구에 사용된 농도 범위에서는 ICso 값을 구할 수가 없었으며, 전반적으로 모든 처리 구에서 농도 의존적인 세포증식 억제 효과가 나타났다. 한편 본 연구에 사용된 초기농도인 25μg/mL 에서부터 세포증식 억제율이 50% 이상을 보인 처리구는 헥산과 디클로로메탄 분획물이었으며, 농도 의존적으로 세포 성장 억제효과가 더 좋았던 분획물은 디클로로메탄 분획물이 었다. 디클로로메탄 분획물을 여러 농도로 처리하였을 때의 세포성장 억제율은 25μg/mL, 50μg/mL, 100μg/mL 및 200μg/mL 농도에서 각각 64.
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