한국멧토끼 ZFX와 ZFY 유전자의 성별 이형성과 분자 성판별 Molecular Sex Determination Using Sexual Dimorphisms between ZFX and ZFY Genes in Korean Hares(Lepus coreanus Thomas)원문보기
우리나라에 분포하는 멧토끼 (Lepus coreanus)의 성판별을 위한 분자 표지자를 개발하기 위하여, X, Y 염색체간 상동인 ZFX와 ZFY 유전자들의 성별 이형성에 초점을 맞추어 본 연구를 수행하였다. ZFX와 ZFY 유전자의 인트론 7 영역은 멧토끼의 암수가 구분되는 증폭 양상을 나타내었다. 인트론 7의 길이는 각각 ZFX에서 538, ZFY에서 233-bp로 확인되었다. 특히, ZFX의 인트론 7에서는 RNA-매개성 전위인자 중 한 종이며 토끼의 유전체에서 빈번하게 관찰되는 CSINE2와 유사한 반복서열이 발견되었다. 반면, 반복서열은 ZFY의 인트론 7에서는 관찰되지 않았다. ZFX와 ZFY 유전자의 인트론 7에서 확인된 길이의 차이에 근거하여 중합효소연쇄반응 기법을 이용한 유전자 성판별을 수행하였다. 시험에 이용된 모든 DNA시료들은 ZFX에서 증폭된 공통의 밴드를 가지고 있었다. 이에 반해, 멧토끼 수컷 DNA들은 각각 ZFX와 ZFY에서 증폭된 두 개의 구분되는 밴드들을 나타내었다. ZFX-ZFY 유전자·성판별 결과는 표현형 성별 정보뿐만 아니라 수컷-특이적인 SRY 유전자의 증폭양상과도 일치한 결과와도 정확히 일치하였다. 이상의 결과들은 멧토끼에서 ZFX와 ZFY의 인트론 7 영역간의 성별 이형성은 유전자 성판별을 위한 유용한 유전자 표지자가 될 것으로 사료된다.
우리나라에 분포하는 멧토끼 (Lepus coreanus)의 성판별을 위한 분자 표지자를 개발하기 위하여, X, Y 염색체간 상동인 ZFX와 ZFY 유전자들의 성별 이형성에 초점을 맞추어 본 연구를 수행하였다. ZFX와 ZFY 유전자의 인트론 7 영역은 멧토끼의 암수가 구분되는 증폭 양상을 나타내었다. 인트론 7의 길이는 각각 ZFX에서 538, ZFY에서 233-bp로 확인되었다. 특히, ZFX의 인트론 7에서는 RNA-매개성 전위인자 중 한 종이며 토끼의 유전체에서 빈번하게 관찰되는 CSINE2와 유사한 반복서열이 발견되었다. 반면, 반복서열은 ZFY의 인트론 7에서는 관찰되지 않았다. ZFX와 ZFY 유전자의 인트론 7에서 확인된 길이의 차이에 근거하여 중합효소연쇄반응 기법을 이용한 유전자 성판별을 수행하였다. 시험에 이용된 모든 DNA시료들은 ZFX에서 증폭된 공통의 밴드를 가지고 있었다. 이에 반해, 멧토끼 수컷 DNA들은 각각 ZFX와 ZFY에서 증폭된 두 개의 구분되는 밴드들을 나타내었다. ZFX-ZFY 유전자·성판별 결과는 표현형 성별 정보뿐만 아니라 수컷-특이적인 SRY 유전자의 증폭양상과도 일치한 결과와도 정확히 일치하였다. 이상의 결과들은 멧토끼에서 ZFX와 ZFY의 인트론 7 영역간의 성별 이형성은 유전자 성판별을 위한 유용한 유전자 표지자가 될 것으로 사료된다.
This study was performed to develop the molecular marker for sex determination of hare (Lepus coreanus) distributed in Korea which focused on sexual dimorphism between X and Y chromosomal homologous genes, zinc finger-X (ZFX) and -Y (ZFY). The intron 7 regions of ZFX and ZFY genes exhibited differen...
This study was performed to develop the molecular marker for sex determination of hare (Lepus coreanus) distributed in Korea which focused on sexual dimorphism between X and Y chromosomal homologous genes, zinc finger-X (ZFX) and -Y (ZFY). The intron 7 regions of ZFX and ZFY genes exhibited differential amplification patterns between male and female hares. The lengths of intron 7 region of ZFX and ZFY genes were 538 and 233-bp, respectively. Especially, the ZFX intron 7 contained a repetitive sequence identified as member of RNA-mediated transposable elements which was similar to CSINE2 commonly found in the rabbit genome. However, it was not present in intron 7 of ZFY gene. The molecular sex typing by polymerase chain reaction (PCR) was also carried out to determine the sex of hare based on difference in lengths between the intron 7 regions of ZFX and ZFY genes. All DNA samples tested had common band amplified from ZFX. However, the male hare DNAs had two distinct bands which amplified from ZFX and ZFY genes, respectively. The results from ZFX-ZFY PCR sex typing were identical to those from phenotypic investigation and from amplification patterns using male-specific sex determining region Y (SRY) gene as well. Finally, this study suggested that the sexual dimorphism between intron 7 regions of ZFX and ZFY could be useful genetic marker to determine sex of hare.
This study was performed to develop the molecular marker for sex determination of hare (Lepus coreanus) distributed in Korea which focused on sexual dimorphism between X and Y chromosomal homologous genes, zinc finger-X (ZFX) and -Y (ZFY). The intron 7 regions of ZFX and ZFY genes exhibited differential amplification patterns between male and female hares. The lengths of intron 7 region of ZFX and ZFY genes were 538 and 233-bp, respectively. Especially, the ZFX intron 7 contained a repetitive sequence identified as member of RNA-mediated transposable elements which was similar to CSINE2 commonly found in the rabbit genome. However, it was not present in intron 7 of ZFY gene. The molecular sex typing by polymerase chain reaction (PCR) was also carried out to determine the sex of hare based on difference in lengths between the intron 7 regions of ZFX and ZFY genes. All DNA samples tested had common band amplified from ZFX. However, the male hare DNAs had two distinct bands which amplified from ZFX and ZFY genes, respectively. The results from ZFX-ZFY PCR sex typing were identical to those from phenotypic investigation and from amplification patterns using male-specific sex determining region Y (SRY) gene as well. Finally, this study suggested that the sexual dimorphism between intron 7 regions of ZFX and ZFY could be useful genetic marker to determine sex of hare.
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문제 정의
뿐만 아니라, 야생에서의 자연사나 사고에 의해 죽은 개체 역시 포식동물이나 세균에 의한 생식기관이 손상될 가능성은 다분하다. 본 연구는 야생상태의 어떤 원인에 의해 죽었거나, 인위적으로 포획된 멧토끼의 사체에 대한유전자 성판별 기법을 확립하는데 그 목적이 있다. 이를 위해 멧토끼의 X, Y 염색체에 상동으로 존재하는 ZFX, ZFY 유전자 절편에 대한 염기서열을 결정하고, 상호간의 염기서열의 특성을 비교하여 두 유전자간 성별 이형성을 탐색하고, 발견된 성별 이형성에 근거한 유전자 성판별 기법을 확립하고자 본 연구를 수행하였다.
algirns 종에서만 빈번하고 집토끼에서는 관찰되지 않는다고 보고되었으나[9], 현재까지 유전자 성판별 기법은 멧토끼뿐만 아니라 집토끼에 대한 보고마저도 없다. 본 연구에서는 X, Y 성염색체 상동인 ZFX-ZFY 유전자 서열 사이에서 성별 이형성을 발견하였고, 이를 이용하여 멧토끼 사체에 대한 유전자 성판별을 수행하여 멧토끼의 사체에 대한 유전자성판별에 따른 성별 자료를 얻어낼 수 있었다. PCR에 의한 유전자 성판별은 미량의 DNA라도 확보 가능하다면, PCR 증폭과 전기영동으로 이어지는 간단한 분석을 통해 거의 정확한 성판별 자료를 얻어낼 수 있어 밀렵이나 불법 포획된 멧토끼의 암수 판별에 활용할 수 있을 것이다.
본 연구는 야생상태의 어떤 원인에 의해 죽었거나, 인위적으로 포획된 멧토끼의 사체에 대한유전자 성판별 기법을 확립하는데 그 목적이 있다. 이를 위해 멧토끼의 X, Y 염색체에 상동으로 존재하는 ZFX, ZFY 유전자 절편에 대한 염기서열을 결정하고, 상호간의 염기서열의 특성을 비교하여 두 유전자간 성별 이형성을 탐색하고, 발견된 성별 이형성에 근거한 유전자 성판별 기법을 확립하고자 본 연구를 수행하였다.
가설 설정
1, nucleotide sequences are displayed from 5' to 3';.
제안 방법
근육과 피부에서의 DNA추출은 sucrose-proteinase K lysis buffer[4]를 이용하였으며, 추출 과정은 일부 변형하여 수행하였다. DNA 추출 후 RNase를 처 리하였고, 이후 phenol 추출법과 ethanol 침 전으로 다시 회수하여 TE buffer에 용해하여 PCR 증폭을 위한 주형으로 이용하였다.
유전자 성판별을 위해, 성별 이형성을 보이는 인트론 7을 포함한 절편의 증폭은 hZFe7F와 hZFe8R을 이용하였고, 웅성 특이적 SRY 유전자의 증폭을 위한 haSRYF와 haSRYR 프라이머를 이용하였다. PCR 증폭은 상기된 반응액 조성에 따랐으며 각각의 프라이 머 세트의 annealing 온도는 gradient PCR 분석을 통해 최적 온도를 결정하였고, PTC-200 (MJ Research, USA)을 이용하였다. 유전자 증폭은 94℃ 2분 열변성 후, 94345 초, annealing 온도-1 분, 72℃-1 분 (ZFX-ZFY 인트론 7, SRY) 또는 2분 (ZFX-ZFY 엑손 7-10)으로 이어지는 증폭반응을 30회 반복한 후 72℃-10 분 최종신장하고, 이후 4℃에서 보관하였.
PCR 증폭용 pri- mer들은 기존에 보고된 서열정보들을 토대로 직접 고안하였고, 서열의 정보는 Table 1에 제시하였다. ZFX-ZFY 유전자의 엑손 7과 10에서 고안한 hZFe7F와 hZFelOR을 멧토끼 인트론 7, 8, 9, 엑손 8과 9 전체, 엑손 7과 10의 일부가 포함된 서열의 결정을 위한 PCR 증폭에 이용하였다. 유전자 성판별을 위해, 성별 이형성을 보이는 인트론 7을 포함한 절편의 증폭은 hZFe7F와 hZFe8R을 이용하였고, 웅성 특이적 SRY 유전자의 증폭을 위한 haSRYF와 haSRYR 프라이머를 이용하였다.
시료는 근육 또는 피부에서 DNA를 추출하였다. 근육과 피부에서의 DNA추출은 sucrose-proteinase K lysis buffer[4]를 이용하였으며, 추출 과정은 일부 변형하여 수행하였다. DNA 추출 후 RNase를 처 리하였고, 이후 phenol 추출법과 ethanol 침 전으로 다시 회수하여 TE buffer에 용해하여 PCR 증폭을 위한 주형으로 이용하였다.
멧토끼에서 분리한 DNA를 주형으로, lOxPCR 반응 완충액, 20 mM dNTP, 각각 10 pmol primer, 2.0 units Taq DNA polymerase (TaKaRa, Japan)에 멸균한 탈이온수를 첨가하여 25 4 용량으로 PCR 반응을 수행하였다. PCR 증폭용 pri- mer들은 기존에 보고된 서열정보들을 토대로 직접 고안하였고, 서열의 정보는 Table 1에 제시하였다.
멧토끼의 생식기에 대한 표현형 조사를 통해 암수가 결정된 시료 중 수컷 2 개체에서 ZFX와 ZFY 유전자 엑손 7의 3'말단부에서 10의 5' 개시부에 이르는 영역에 대한 DNA 염기서열 분석을 수행하였다. 서열의 길이는 ZFX가 1, 778-bp, ZFY는 1, 613-bp이고, 이 중 인트론 7의 길이는 ZFX-ZFY에서 각각 538-bp, 233-bp로 확인되었다.
사체 16 개체를 수집하여 이용하였다. 시료는 근육 또는 피부에서 DNA를 추출하였다. 근육과 피부에서의 DNA추출은 sucrose-proteinase K lysis buffer[4]를 이용하였으며, 추출 과정은 일부 변형하여 수행하였다.
염기서열 결정에서 확인된 ZFX 인트론 7에서 LsSINE의삽입/결실 형태를 이용하여 수집된 전 개체에 대한 유전자성판별을 시도하였다. 먼저 암수에 대한 표현형 정보를 알고있는 시료에 대한 성판별 시험결과, 암수에서 ZFX와 ZFY 인트론 7을 포함한 절편에 대한 증폭양상이 서로 상이하게 관찰되었다 (Fig.
또한 수컷-특이적인 ZFY 밴드는 암수 공통인 ZFX 밴드에 비해 앞에서 언급한 LcSINE의 결실에 따라 더 작은 크기를 갖는 것으로 관찰되었다. 유전자 성판별에 대한 결과의 재확인과 궁극적으로 웅성발생을 유도하는 핵심 유전자인 SRY의 존재를 확인하기 위해 PCR 증폭을 수행하였다. 그 결과 전기영동 겔 상에서 수컷에서는 PCR 산물이 관찰되나, 암컷은 PCR 산물이 관찰되지 않았다 (Fig.
ZFX-ZFY 유전자의 엑손 7과 10에서 고안한 hZFe7F와 hZFelOR을 멧토끼 인트론 7, 8, 9, 엑손 8과 9 전체, 엑손 7과 10의 일부가 포함된 서열의 결정을 위한 PCR 증폭에 이용하였다. 유전자 성판별을 위해, 성별 이형성을 보이는 인트론 7을 포함한 절편의 증폭은 hZFe7F와 hZFe8R을 이용하였고, 웅성 특이적 SRY 유전자의 증폭을 위한 haSRYF와 haSRYR 프라이머를 이용하였다. PCR 증폭은 상기된 반응액 조성에 따랐으며 각각의 프라이 머 세트의 annealing 온도는 gradient PCR 분석을 통해 최적 온도를 결정하였고, PTC-200 (MJ Research, USA)을 이용하였다.
유전자 증폭산물에 대한 염기서열 결정을 위하여 DNA sequencing 을 수행하였다. 정제된 SRY와 ZFX, ZFY에 대한 PCR 산물들은 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, USA)의 pCR2.
을 수행하였다. 정제된 SRY와 ZFX, ZFY에 대한 PCR 산물들은 TOPO TA Cloning Kit (Invitrogen, USA)의 pCR2.0 vector에 연결한 후 대장균 OneShot Topl0Fz competent 세포에 형질전환하였고, 재조합 plasmid는 Wizard Plus SV Minipreps (Promega, USA)로 회수하였다. 추출한 plasmid DNA를 주형으로 dye-termination 반응을 수행하였고 MegaBase 500 (Amersham Pamacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였다.
다. 증폭 산물은 ethidium bromide가 함유된 1.5% agarose 겔 상에서 전기영동한 후, UV 하에서 확인하고 사진촬영 하였다.
0 vector에 연결한 후 대장균 OneShot Topl0Fz competent 세포에 형질전환하였고, 재조합 plasmid는 Wizard Plus SV Minipreps (Promega, USA)로 회수하였다. 추출한 plasmid DNA를 주형으로 dye-termination 반응을 수행하였고 MegaBase 500 (Amersham Pamacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 기존에 보고된 서열들 (Table 1)을 기준으로 액손-인트론 경계를 확인하였고, 염기서열간 비교를 위한 다중정렬은 CLUSTAL W program[27]을 이용하였다.
대상 데이터
본 연구에서 새롭게 결정한 멧토끼 ZFX-ZFY 서열들은 database 에 등록하였다 (GenBank Accession EF110883-EF110886). 또한 인트론 7 상에서 반복서열의 존재는 CENSOR web program (http://www.girinst. org/censor/)으로 확인하였다.
연구에 이용한 야생 멧토끼 시료는 한국유전자원은행에서 암수 판별기록이 있는 시료 중 암수 각각 2 개체씩을 분양받아 사용하였으며, 경상남도에서 암수 표현형 자료가 없는 멧토끼 사체 16 개체를 수집하여 이용하였다. 시료는 근육 또는 피부에서 DNA를 추출하였다.
데이터처리
추출한 plasmid DNA를 주형으로 dye-termination 반응을 수행하였고 MegaBase 500 (Amersham Pamacia, USA)을 이용하여 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열은 기존에 보고된 서열들 (Table 1)을 기준으로 액손-인트론 경계를 확인하였고, 염기서열간 비교를 위한 다중정렬은 CLUSTAL W program[27]을 이용하였다. 본 연구에서 새롭게 결정한 멧토끼 ZFX-ZFY 서열들은 database 에 등록하였다 (GenBank Accession EF110883-EF110886).
성능/효과
유전자 성판별에 대한 결과의 재확인과 궁극적으로 웅성발생을 유도하는 핵심 유전자인 SRY의 존재를 확인하기 위해 PCR 증폭을 수행하였다. 그 결과 전기영동 겔 상에서 수컷에서는 PCR 산물이 관찰되나, 암컷은 PCR 산물이 관찰되지 않았다 (Fig. 2b). 또한 SRY와 ZFX-ZFY 증폭양상은 서로 일치하였고, 생식기관 관찰에 의한 표현형 자료들과도 정확히 일치하였다.
2b). 또한 SRY와 ZFX-ZFY 증폭양상은 서로 일치하였고, 생식기관 관찰에 의한 표현형 자료들과도 정확히 일치하였다. 이상의 결과는 본 연구에서 이용한 시료들은 SRY와 ZFY 유전자가 Y 염색체 위에 완전히 연관되어 있어, SRY 유전자 전위에 위한 XX (+SRY) 웅성 또는 XY (-SRY) 자성은 없는 것으로 판단된다 [18, 27, 28].
수컷에서 관찰되는 695-bp 밴드는 암컷의 것과 동일한 위치에서 확인되어, 결과적으로 이 밴드는 암수 공통인 X 염색체 ZF 유전자 즉, ZFX를 주형으로 증폭된 산물이며, 그에 반해 수컷에서만 특이적으로 발견되는 또 하나의 밴드는 Y 염색체의 ZFY 유전자를 주형으로 증폭된 것임을 알 수 있었다. 또한 수컷-특이적인 ZFY 밴드는 암수 공통인 ZFX 밴드에 비해 앞에서 언급한 LcSINE의 결실에 따라 더 작은 크기를 갖는 것으로 관찰되었다. 유전자 성판별에 대한 결과의 재확인과 궁극적으로 웅성발생을 유도하는 핵심 유전자인 SRY의 존재를 확인하기 위해 PCR 증폭을 수행하였다.
시도하였다. 먼저 암수에 대한 표현형 정보를 알고있는 시료에 대한 성판별 시험결과, 암수에서 ZFX와 ZFY 인트론 7을 포함한 절편에 대한 증폭양상이 서로 상이하게 관찰되었다 (Fig. 2a). 전기영동 겔 상에서 암컷은 단일 PCR 밴드 (695-bp)를, 수컷에서는 두 개의 PCR 밴드 (390-bp, 695-bp)를 보였다.
수 2개체씩에서 결정한 ZFX와 ZFY 유전자서열들을 다중 정렬하여 나타낸 것이다. 발견된 SINE -like 반복서열은 LcSINE으로 명명하였으며, BLAST 검색을 GenBank database 내의 서열과의 유사성을 검색한 결과 집토끼에서 보고된 유전체 서열상에서 방대하게 분포하고 있는 것으로 확인되었다 (data not shown).
전기영동 겔 상에서 암컷은 단일 PCR 밴드 (695-bp)를, 수컷에서는 두 개의 PCR 밴드 (390-bp, 695-bp)를 보였다. 수컷에서 관찰되는 695-bp 밴드는 암컷의 것과 동일한 위치에서 확인되어, 결과적으로 이 밴드는 암수 공통인 X 염색체 ZF 유전자 즉, ZFX를 주형으로 증폭된 산물이며, 그에 반해 수컷에서만 특이적으로 발견되는 또 하나의 밴드는 Y 염색체의 ZFY 유전자를 주형으로 증폭된 것임을 알 수 있었다. 또한 수컷-특이적인 ZFY 밴드는 암수 공통인 ZFX 밴드에 비해 앞에서 언급한 LcSINE의 결실에 따라 더 작은 크기를 갖는 것으로 관찰되었다.
또한 SRY와 ZFX-ZFY 증폭양상은 서로 일치하였고, 생식기관 관찰에 의한 표현형 자료들과도 정확히 일치하였다. 이상의 결과는 본 연구에서 이용한 시료들은 SRY와 ZFY 유전자가 Y 염색체 위에 완전히 연관되어 있어, SRY 유전자 전위에 위한 XX (+SRY) 웅성 또는 XY (-SRY) 자성은 없는 것으로 판단된다 [18, 27, 28].
후속연구
본 연구에서는 X, Y 성염색체 상동인 ZFX-ZFY 유전자 서열 사이에서 성별 이형성을 발견하였고, 이를 이용하여 멧토끼 사체에 대한 유전자 성판별을 수행하여 멧토끼의 사체에 대한 유전자성판별에 따른 성별 자료를 얻어낼 수 있었다. PCR에 의한 유전자 성판별은 미량의 DNA라도 확보 가능하다면, PCR 증폭과 전기영동으로 이어지는 간단한 분석을 통해 거의 정확한 성판별 자료를 얻어낼 수 있어 밀렵이나 불법 포획된 멧토끼의 암수 판별에 활용할 수 있을 것이다. 야생동물 사체에 대한 성비조사는 야생집단의 변화추이를 확인할 수 있어 야생동물의 보존과 체계적인 관리를 위해 좋은 자료가 될수 있다.
야생동물 사체에 대한 성비조사는 야생집단의 변화추이를 확인할 수 있어 야생동물의 보존과 체계적인 관리를 위해 좋은 자료가 될수 있다. 향후, 집토끼를 대상으로 암수 성판별 가능성의 확인, 포획이나 사고, 자연사에 의해 죽은 멧토끼를 다른 포유류와 구분할 수 있는 유전자 식별 기법 등을 보완한다면, 사체에 대한 정확한 종 동정과 더불어 암수 판별을 가능하게할 수 있는 분석 체계가 구축될 수 있을 것으로 사료되며, 가축화된 집토끼의 산업적 이용에서도 기여할 수 있을 것으로 사료된다.
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