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문제 정의
- CK가 간 세포내에서 당 신생경로의 주요 효소인 PEPCK, G6Ese 유전자 발현에 미치는 영향을 H4IIE ceU line에서 확인해 보았다. CK는 0.
- 본 연구에서는 compound K가 in vivo에서 혈당강하 활성을 나타낼 수 있는지를 알아보기 위한 예비실험으로 첫째, 췌장 베타세포에서 인슐린 분비를 촉진 시키는가? 둘째, 간세포에서 탄수화물 대사에 관여하는 효소들의 전사체 발현에 영향을 미치는가? 셋째, 인슐린 민감성과 관련이 있는 지방분화에 영향을 미치는 지를 각 세포주를 이용하여 살펴보았다.
가설 설정
- 인슐린 분비를 촉진 시키는가? 둘째, 간세포에서 탄수화물 대사에 관여하는 효소들의 전사체 발현에 영향을 미치는가? 셋째, 인슐린 민감성과 관련이 있는 지방분화에 영향을 미치는 지를 각 세포주를 이용하여 살펴보았다.
제안 방법
- 잘 풀어 주었다. 1.037, 1.069, 1.085, 1.10 Ficoll 농도 기울기에 소도세포를 가하고 2000rpm/4℃에서 20분 동안 원심분리를 한 후 2와 3번째 층을 분리하여 5%의 FBS 가 포함된 HBSS에 옮겨 1500rpm/4OC에서 1분 동안 원심분리를 하여 최종적으로 소도세포를 얻었다. 10% fetal bovine serum과 1% pencillin/streptomycin0] 첨가된 RPMI- 1640 배지를 처리하여 37℃, 5% CO2 조건에서 1~2일 동안 incubation 하였다.
- CK의 인슐린 분비 촉진 기전을 일차 배양한 췌장 소도세포에서 0.5 mM의 diazoxide을 이용하여 확인해 보았다 (Fig. 3). 그림에서 보듯이 0.
- PCR 조건은 95℃에서 1분 동안 변성, 55℃에서 1분 동안 붙임 그리고 72℃에서 2분 동안 연장을 하여 총 30 cycle을 running 하였다. PCR 생성물은 0.5)ig/m/ ethidium bromide로 염색된 1% agarose gel을 이용하여 100V에서 전기영동 하였으며 GS-700 이미지 농도계를 이용하여 발현 정도를 수치화하여 CPN과의 비로 표현하였다.
- PCR 조건은 95℃에서 1 분 동안 변성, 57SC에서 1분 동안 붙임 그리고 72℃에서 1분 동안 연장을 하여 총 30 cycle 하였다. PCR 생성물은 0.5p.g/m/ ethidium bromide로 염색된 1% agarose gel을 이용하여 100V에서 전기영동 하였으며 GS-700 이미지 농도계를 이용하여 발현 정도를 수치화하여 (3-actin과의 비로 표현하였다.
- 세포는 24 well plate에 well당 4x104씩 분주하며 CK를 처리하기 16시간 전부터 serum이 들어있지 않은 배지에서 배양하였다. Phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK)와 glucose-6-phosphatase (G6Pase) 유전자의 발현을 유도하기 위하여 0.1 mM cAMP와 500 nM dexamethasone을 처리하였으며 , CK는 0.8 혹은 3.2 pM 농도로 cAMP/dex와 함께 처리한 후 4h 동안 incubation한 후 RNA를 아래와 같이 분리하여 두 효소 유전자의 발현에 대한 억제 활성을 측정하였다.
- 본 실험에 사용한 primer 종류와 염기서열은 다음과 같다: PEPCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase)의 주형사 서열은 ATG CCT CCT CAG CTG CAT A, 비주형사 서열은 TTA CAT CTG GCT GAT TCT CTG TT, G6Pase (Glucose-6-phos- phatase)의 주형사 서열은 ACC CTG GTA GCC CTG TCT TI; 비주형사 서열은 GGG CTT TCT CTT CTG TGT CG, CPN(Cyclophilin)의 주형사 서열은 ATG GTC AAC CCC ACC GTG, 비주형사 서열은 TTA GAG TTG TCC ACA GTC GGA GA 이다. Primer는 20 mM Tns- HC1 (pH 8.4), 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM dNTE 5 yd cDNA 그리고 2.5 unit의 Taq DNA poly- merase가 포함되어 있는 25pZ의 반응 용액에 최종 농도가 0.5 rM이 되도록 첨가하였다. PCR 조건은 95℃에서 1분 동안 변성, 55℃에서 1분 동안 붙임 그리고 72℃에서 2분 동안 연장을 하여 총 30 cycle을 running 하였다.
- Primer는 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 50 mM KC1, 1.5 mM MgCl2, 0.5 mM dNTR 5jJ cDNA 그리고 2.5 unit의 Taq DNA polymerase가 포함되어 있는 25 ul의 반응 용액에 최종 농도가 0.5 mM이 되도록 첨가하였다. PCR 조건은 95℃에서 1 분 동안 변성, 57SC에서 1분 동안 붙임 그리고 72℃에서 1분 동안 연장을 하여 총 30 cycle 하였다.
- RIN-m5F cell line (ATCC, passage number 8-10)을 10% fetal bovine serum과 1% pencillin/streptomycin °] 첨가된 RPMI-1640 (2 mM L-glutamine, 1.5 sodium bicarbonate, 10 mM HEPES, 1.0 mM sodium pyruvate) 배지를 사용하여 37℃, 5% coyo2 조건하에서 배양하였으며 subculture는 4~5일 사이에 시행하였다.
- 18)물 층에 있는 total RNA는 이소프로판올을 이용하여 침전시켜 분리한 RNA는 260 nm와 280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. Total RNA 1 μg을 Moloney murine leukemia virus transcrptase와 random hexamer를 이용하여 역전사하였다. 본 실험에 사용한 primer 종류와 염기서열은 다음과 같다: PEPCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase)의 주형사 서열은 ATG CCT CCT CAG CTG CAT A, 비주형사 서열은 TTA CAT CTG GCT GAT TCT CTG TT, G6Pase (Glucose-6-phos- phatase)의 주형사 서열은 ACC CTG GTA GCC CTG TCT TI; 비주형사 서열은 GGG CTT TCT CTT CTG TGT CG, CPN(Cyclophilin)의 주형사 서열은 ATG GTC AAC CCC ACC GTG, 비주형사 서열은 TTA GAG TTG TCC ACA GTC GGA GA 이다.
- 5 mM isobutylmethylxanthine, 1 mM dexamethasone 그리고 10 jig/m/ 인슐린이 포함된 DMEM)로 교환하여 2일 간격으로 교환하고 총 4일 동안 배양한 후 10μm2 인슐린이 포함된 DMEM 으로 교환하여 2일을 더 배양하였다. 그 후 FBS만 포함된 DMEM으로 2일 배양하여 총 8일 동안 분화를 유도하였다.
- 분화 유도는 위의 방법과 동일하며 처음 2일 동안 1.6, 8, 16 그리고 32mM의 CK를 첨가시켜 6 well plate에서 분화를 유도 시켜 총 8일 동안 배양한 세포를 PBS로 2번 세척한 후 10% 포르말린을 포함한 PBS로 1시간 동안 실온에서 세포를 고정시켰다. 그 후 0.
- 5% CO?와 37℃ 조건하에 배양하였다. 분화를 유도시키기 위해서 3T3-L1 preadipocyte는 80% 정도 자라면 분화 유도 배지 (5% fetal bovine serum, 0.5 mM isobutylmethylxanthine, 1 mM dexamethasone 그리고 10 jig/m/ 인슐린이 포함된 DMEM)로 교환하여 2일 간격으로 교환하고 총 4일 동안 배양한 후 10μm2 인슐린이 포함된 DMEM 으로 교환하여 2일을 더 배양하였다. 그 후 FBS만 포함된 DMEM으로 2일 배양하여 총 8일 동안 분화를 유도하였다.
- 미치는가? 셋째, 인슐린 민감성과 관련이 있는 지방분화에 영향을 미치는 지를 각 세포주를 이용하여 살펴보았다.
- 지방세포에서 인슐린 감수성과 관련하여 CK가 3T3-L1 cell line에서 TG의 함량변화와 PPAR-y 유전자의 발현 정도에 미치는 영향을 살펴보았다 (Fig. 5). 그림 5A에서 보듯이 CK는 16 uM 농도까지 TG의 함량이 조금씩 용량 의존적으로 감소하는 경향을 나타내었다.
- 진세노사이드의 인슐린 분비 활성을 알아보기 위해 proto- panaxadiol계 진세노사이드 (PPD)와 protopanaxatriol계 진세노사이드 (PPT)의 인슐린 분비량을 RIN-m5F cell line에서 측정하였다 (Fig. 1). 각 진세노사이드의 농도는 10 皿을 사용하였다.
- 3% oil red 0가 포함된 60% 이소프로판올을 2시간 동안 실온에서 착색시켰다. 착색 후 3 차 증류수로 남은 oil red 0 용액을 제거한 후 37℃에서 20분 동안 남아 있는 물기를 제거 한 후 100% 이소프로판올로 탈 염색하여 540nm에서 triacylglyceride (TG)를 측정하였다.
- 3, 000 rpm (4℃에서 5분 동안 원심 분리하여 얻은 상등액을 eppendorf tube에 옮겨 rat insulin kit (Shibayagi, Japan)를 이용하여 ELISA reader로 450 nm에서 측정하였다. 한편 CK의 인슐린 분비 촉진 기전을 알아보기 위한 실험에서는 0.5 mM diazoxideS- 함유한 KRB 용액에서 1시간 동안 incubation한 후 위와 동일한 방법으로 인슐린 농도를 측정하였다.
대상 데이터
- 간세포인 H4HE cell linee 2.5% fetal calf serum, 2.5% newborn calf serum과 100 U/m/의 항생제가 포함되어 있는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 37℃ 온도 유지와 5% CO2 조건에서 배양하였다. 세포는 24 well plate에 well당 4x104씩 분주하며 CK를 처리하기 16시간 전부터 serum이 들어있지 않은 배지에서 배양하였다.
- Total RNA 1 μg을 Moloney murine leukemia virus transcrptase와 random hexamer를 이용하여 역전사하였다. 본 실험에 사용한 primer 종류와 염기서열은 다음과 같다: PEPCK (phosphoenolpyruvate carboxykinase)의 주형사 서열은 ATG CCT CCT CAG CTG CAT A, 비주형사 서열은 TTA CAT CTG GCT GAT TCT CTG TT, G6Pase (Glucose-6-phos- phatase)의 주형사 서열은 ACC CTG GTA GCC CTG TCT TI; 비주형사 서열은 GGG CTT TCT CTT CTG TGT CG, CPN(Cyclophilin)의 주형사 서열은 ATG GTC AAC CCC ACC GTG, 비주형사 서열은 TTA GAG TTG TCC ACA GTC GGA GA 이다. Primer는 20 mM Tns- HC1 (pH 8.
데이터처리
- 실험 결과는 평균士오차로 나타내었다. 통계처리는 Student's MestS.
- 실험 결과는 평균士오차로 나타내었다. 통계처리는 Student's MestS. 검정하였고 대조군과 비교하여 P<0.
이론/모형
- 위의 방법으로 CK를 처리한 후 total RNA는 guanidine thiocyanate-water saturated phenol/chroloform 분리 방법을 이용하였다.18)물 층에 있는 total RNA는 이소프로판올을 이용하여 침전시켜 분리한 RNA는 260 nm와 280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.
성능/효과
- 질환이다. 1) 당뇨병은 고혈당이라는 특징적인 증상을 나타내는데, 이는 췌장으로부터 인슐린 분비감소 또는 분비된 인슐린의 각 장기에 대한 작용성 감소에 기인 한다.2)지금까지의 역학적 연구와 임상 실험 결과에 의하면 고혈당이 망막증, 신경장해, 신장해와 같은 소혈관계 당뇨 합병증과 심장병, 뇌졸중, 사지 절단과 같은 대혈관계 당뇨 합병증을 일으키는 원인으로 밝혀져 있다.
- 방법을 이용하였다.18)물 층에 있는 total RNA는 이소프로판올을 이용하여 침전시켜 분리한 RNA는 260 nm와 280 nm의 파장에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. Total RNA 1 μg을 Moloney murine leukemia virus transcrptase와 random hexamer를 이용하여 역전사하였다.
- 2)지금까지의 역학적 연구와 임상 실험 결과에 의하면 고혈당이 망막증, 신경장해, 신장해와 같은 소혈관계 당뇨 합병증과 심장병, 뇌졸중, 사지 절단과 같은 대혈관계 당뇨 합병증을 일으키는 원인으로 밝혀져 있다.3)결국, 당뇨의 합병증을 예방하고 당뇨 환자의 삶의 질을 개선하기 위해서는 효과적인 혈당의 조절이 가장 중요하다고 할 수 있다.45)
- CK는 RIN-m5F cell line과 일차 배양한 췌장 소도세포에서 용량 의존적으로 인슐린의 분비를 촉진하였고 이러한 CK의 인슐린 분비 촉진 기전은 ATP-sensitive K+ 채널 의 봉쇄에 의한 것임을 확인하였다. H4IIE cell line에서 간세포 내 당신생과 관련된 효소의 발현을 측정한 결과 CK는 dexamethasone/cAMP에 의한 PEPCK와 G6Pase의 발현을 억제하였다.
- CK는 RIN-m5F cell line과 일차 배양한 췌장 소도세포에서 용량 의존적으로 인슐린의 분비를 촉진하였고 이러한 CK의 인슐린 분비 촉진 기전은 ATP-sensitive K+ 채널 의 봉쇄에 의한 것임을 확인하였다. H4IIE cell line에서 간세포 내 당신생과 관련된 효소의 발현을 측정한 결과 CK는 dexamethasone/cAMP에 의한 PEPCK와 G6Pase의 발현을 억제하였다. 이로 미루어 볼 때, CK는 간에서 당의 신생을 억제하여 공복 시 혈당을 감소시킬 수 있음을 시사하였다.
- 통계처리는 Student's MestS. 검정하였고 대조군과 비교하여 P<0.05 이하의 경우 유의적인 차이가 있다고 판정하였다.
- 또한 3T3-L1 cell line에서 TCP] 함량과 PPAR-y 유전자의 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과 CK는 PPAR-y의 발현을 억제하여 결과 지방세포의 분화를 억제하였다. 결론적으로 CK는 췌장에서 ATP-sensitive K+ channel을 봉쇄힘.으로 인슐린 분비를 촉진시키고 또한 간세포에서 당 신생을 억제함으로 식후 및 공복 시 혈당을 감소시킬 것으로 기대된다.
- 또한 CK는 PFAR-y 유전자 발현을 증가시키지 못하였으며 오히려 용량 의존적으로 감소시키는 경향을 보였다. 결론적으로 Cite PPAR-Y의 발현을 억제하여 결과 지방세포의 분화를 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.
- 이로 미루어 볼 때, CK는 간에서 당의 신생을 억제하여 공복 시 혈당을 감소시킬 수 있음을 시사하였다. 또한 3T3-L1 cell line에서 TCP] 함량과 PPAR-y 유전자의 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과 CK는 PPAR-y의 발현을 억제하여 결과 지방세포의 분화를 억제하였다. 결론적으로 CK는 췌장에서 ATP-sensitive K+ channel을 봉쇄힘.
- 한편 32 μM 농도의 경우 세포독성으로 인해 TG량이 급격히 감소된 것으로 판단된다. 또한 CK는 PFAR-y 유전자 발현을 증가시키지 못하였으며 오히려 용량 의존적으로 감소시키는 경향을 보였다. 결론적으로 Cite PPAR-Y의 발현을 억제하여 결과 지방세포의 분화를 억제하는 활성이 있음을 알 수 있었다.
- 4B). 이 결과로부터 CK는 간에서 당신생 과정의 주요 효소인 PEPCK와 G6pase 유전자 발현을 억제함으로 공복시 혈당을 낮추어 줄수 있을 것으로 사료된다.
- IB). 이 결과로부터 우리는 인삼 사포닌성분중 PPD 계열의 성분이 PPT 계열보다 인슐린 분비를 촉진시키는 활성이 우수함을 알 수 있었고, PPD 계열 중에서도 장내 대사체인 CK가 인슐린 분비를 가장 촉진시킴을 알 수 있었다.
- H4IIE cell line에서 간세포 내 당신생과 관련된 효소의 발현을 측정한 결과 CK는 dexamethasone/cAMP에 의한 PEPCK와 G6Pase의 발현을 억제하였다. 이로 미루어 볼 때, CK는 간에서 당의 신생을 억제하여 공복 시 혈당을 감소시킬 수 있음을 시사하였다. 또한 3T3-L1 cell line에서 TCP] 함량과 PPAR-y 유전자의 발현에 미치는 영향을 살펴본 결과 CK는 PPAR-y의 발현을 억제하여 결과 지방세포의 분화를 억제하였다.
- 01). 이로 미루어보아 CK의 인슐린 분비 촉진 기전은 ATP- sensitive K+ 채널의 봉쇄에 의한 것임을 확인할 수 있었다.
- 진세노사이드의 인슐린 분비 활성을 비교해 본 결과 PPD 계열 진세노사이드가 인슐린의 분비를 촉진하는 경향을 보였으며, 그 중에서도 CK의 인슐린 분비 촉진 효과가 가장 뛰어났다. CK는 RIN-m5F cell line과 일차 배양한 췌장 소도세포에서 용량 의존적으로 인슐린의 분비를 촉진하였고 이러한 CK의 인슐린 분비 촉진 기전은 ATP-sensitive K+ 채널 의 봉쇄에 의한 것임을 확인하였다.
후속연구
- 결론적으로 CK는 췌장에서 ATP-sensitive K+ channel을 봉쇄힘.으로 인슐린 분비를 촉진시키고 또한 간세포에서 당 신생을 억제함으로 식후 및 공복 시 혈당을 감소시킬 것으로 기대된다.
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