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문제 정의
- 알려져 있다. 따라서 LPS에 의해서 활성화된 iNOS가 당귀에 의해서 억제되는 기전을 확인하고자 Western blot analysis를 이용하여 NF-kB 활성을 조사하였다. LPS로 활성화 시킨 대식세포에서 AGE를 100 ug/ml로 하여 처리한 후, 10분 동안 IkB 단백질 발현의 변화를 살펴보았다 (Fig.
- 그러나 當歸의 항염작용에 대한 분자적 기전은 알려져 있지 않다. 따라서 본 저자들은 RAW 264.7 세포를 이용하여 당귀가 NFkB 활성을 저하시키고 iNOS의 발현을 억제하여 NO의 생성을 줄일 수 있는지를 평가해서 當歸의 항염작용의 기전을 살펴보았다.
- 본 실험에서는 참당귀 에탄올 추출물에 의한 대식세포에서의 항염 작용을 알아보기 위하여, 대식세포에서 LPS로 염증반응을 유도하였으며, 염증반응과 관련된 iNOS 유전자 발현의 억제에 의한 NO생성 억제를 확인하고자 하였다. 앞으로의 연구는 이러한 결과를 바탕으로 당귀의 고유한 작용기전을 밝히고, 기존의 양약과 염증 호전도에 대한 객관적 약효를 비교할 것이다.
- 이상에서 살펴본바와 같이 當歸가 NF-kB활성을 저하시키고 iNOS의 발현을 억제하여 NO의 생성을 줄일 수 있는지를 평가해서 當歸의 염증성 질환 치료기전을 밝혀보고자 하였다.
제안 방법
- 1% N-1 -napthylethylenediamine dihydrochloride] # 섞어주고, 10분간 상온에 정치시킨후, micro-ELISA readei로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 0.1 M sodium mitric의 농도별 표준곡선을 이용하여 배양액 내의 NO 농도를 결정하였다.
- 이 assay는 mitochodrial dehydrogenases°1] 의 하여 MTS 가 formazari 으로 전환되는 것에 의한다. 1x104 cells로 96well plate에 배양한 세포에 추출물을 농도별로 처치하였다, 48시간 배양 후, Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI, U.S.A) 용액을 첨가하고, 4시간 후 micro-ELISA readere- 이용하여 490nm에서 O.D. 값을 측정하였다.
- AGE가 LPS로 활성화된 대식세포에서 NO 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 AGE 농도를 20, 50, 100 ug/ml로 하여 NO를 측정하였다 (Fig. 2). LPS에 의해 활성화된 대식세포는 대조군에 비해 90배의 NO를 생성하였다.
- 따라서 LPS에 의해서 활성화된 iNOS가 당귀에 의해서 억제되는 기전을 확인하고자 Western blot analysis를 이용하여 NF-kB 활성을 조사하였다. LPS로 활성화 시킨 대식세포에서 AGE를 100 ug/ml로 하여 처리한 후, 10분 동안 IkB 단백질 발현의 변화를 살펴보았다 (Fig. 5). 그 결과로 LPS에 의해 자극을 받은 대식세포에서는 NF-kB 의 활성이 유도되면서 IkB 단백질이 감소하였고 AGE를 처리하였을 때 IkB 의 단백질 발현은 LPS로 활성화 시키지 않은 세포에서의 IkB의 발현과 유사하게 나타났다.
- NO의 농도는 배양액 내의 nitrite 농도를 Griess Reagent System (Promega, co., USA)을 이용하여즉정하였다. 100 mm culture dish에 다양한 농도의 추출물을 전처리하고 30분후 LPS 1 μg/ml를처치하여 24시간 배양하였다.
- 각각의 specific antibodies (iNOS, actin - Santa Cruz Biotechnology, Santa cruz, CA, USA; IkBq - cell signaling Technology, Beverly, MA, USA)> 1:1000으로 하여 4℃에서 overnight 하고, Tris-bufiered saline으로 3회 세척한 뒤, 2000 배로 희석한 secondary antibody (immunoglobulin G-horseradish peroxidase (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA))를 넣고 1 시간동안 반응 시켰다. protein band를 관찰하기 위하여, enhanced chemiluminescence detection system (ECL) (Amersham Pharmacia Biotech, USA)을 사용하였다.
- 배양 후 Trizol-reagent (Invirogen)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA에서 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 을 수행하여 cDNA를 합성하고, cDNA를 증폭하였다.
- 배양 후 Trizol-reagent (Invirogen)를 이용하여 RNA를 분리하였다. 분리한 RNA에서 reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) 을 수행하여 cDNA를 합성하고, cDNA를 증폭하였다. 사용한 primer는 다음과 같다.
- LPS로 활성화 시킨 대식세포 .에서 AGE를 20, 50, 100 ug/ml로 하여 처리한 후, 14시간 후 mRNA를 분리하여 RT-PCR을 통해 iNOS 유전자 발현의 변화를 살펴보았다 (Fig. 3). 그 결과로 LPS를 처리하지 않은 세포에서는 세포에서의 iNOS의 발현이 나타나지 않았으나, LPS로 활성화된 대식세포에서 iNOS의 발현이 크게 유도되었다.
- iNOS;'5-TGG GAA TGG AGA CTG TCC CAG-3* (forward), *5-GGG ATC TGA ATG TGA TGT TTG-3* (reverse): 306bp, P-actin; f5-TGT GAT GGT GGG AAT GGG TCA G・3' (froward), '5-TTT GAT GTC ACG CAC GAT TTC C-3r (reverse); 514bp. 증폭한 PCR 산물은 ethidium bromide가 포함된 1% agarose로 전기영동하여 확인하였다.
- 참당귀 에탄올 추출물이 NO의 생성을 억제시키는 기전을 알아보기 위하여 LPS로 활성화 시킨 대식세포에서의 iNOS의 발현을 mRNA level에서 확인하여 보았다. LPS로 활성화 시킨 대식세포 .
- 추출액은 여과하여 감압 농축 후 동결건조하여, 참당귀 에탄올 추출물을 제조하였다. 참당귀 에탄올 추출물은 DimethylsuHbxide(DMSO)에 20 mg/ml로 녹여 실험 시료로 사용하였다.
- 한의학적으로 補血調經, 活血止痛등의 효능이 있는 참당귀의 항염 효과를 검토하기 위해 RAW 264.7세포에 LPS를 처리하여 염증매개체의 분비량 및 발현을 측정하고 그 억제 작용기전을 밝히기 위해 NF-kB활성도를 확인한 결과 다음과 같은 결론을 얻을 수 있었다.
대상 데이터
- Murine Macrophage cell line인 RAW 264.7 세포는 서울대학교 암연구소 한국세포주은행에서 분양받았으며, 10% Fetal bovine serum (FBS, GibcoBRL, USA)과 1% antibiotics/antimycotics (100 U/ml of penicillin, 25 ug/ml of amphotericin D and 100 ug/ml of strptomycin)가 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, GibcoBRL, USA) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다.
- 100 mm culture dish에 다양한 농도의 추출물을 전처리하고 30분후 LPS 1 μg/ml를처치하여 24시간 배양하였다. 배양액만을 회수, 원심분리하여 상층액을 실험에 사용하였다. 배양액 50 μ1과 같은 양의 Griess Reagent [1%' sulfanilaminde in 5% phosphoric acid, 0.
- 본 실험에서 사용된 참당귀(ANgelica gigas Nakai) 는 강원도 평창군 하진면에서 재배한 것으로 서울특별시 동대문구 제기동 소재의 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
- 모든 측정값은 평균값 士 표준오차 (Mean 士 standard error)로 나타내었으며, oneway - ANOVA 로 통계 검정한 뒤 Newman-Keuls 방법을 사용하여 사후 분석하였다. 유의수준 p < 0.
이론/모형
- NO생성 억제기전에 대한 iNOS protein level에서의 관련성을 조사하기 위하여 Western blot analysis를 이용하여 세포질내의 iNOS 단백질의 발현양을 조사하였다. LPS를 처리하지 않은 세포에서는 iNOS의 단백질 발현이 나타나지 않은 반면에, LPS에 의하여 대식세포내의 iNOS 단백질은 강하게 유도되었으며, AGE의 농도가 증가할수록 iNOS의 발현이 감소하는 것으로 나타났다.
- 참당귀 에탄올 추출물에 대한 대식세포의 생존율은 3-(4, 5-dimethylthiazol-1 )-5-(3-caroboxymeth-oxyphenyl)-2H-tetrazolium, inner salt (MTS) assay 방법으로 분석하였다. 이 assay는 mitochodrial dehydrogenases°1] 의 하여 MTS 가 formazari 으로 전환되는 것에 의한다.
성능/효과
- 7 세포의 iNOS 단백질 발현의 본 실험에서 LPS를 처리하지 않은 세포에서는 iNOS의단백질 발현이 나타나지 않고, LPS로 활성화된 대식세포 내의 iNOS 단백질은 강하게 유도되었다. AGE의 농도가 증가할수록 iNOS의 발현이 감소하는 것으로 나타나며 iNOS의 발현은 최고 농도에서 가장 많이 억제되었다. 이러한 결과들로 볼 때, LPS로 활성화 시킨 대식세포에서 AGE에 의해 농도 의존적으로 iNOS의 유전자 발현과 단백질 발현을 억제하며, 이는 Nitric Oxide의 생성에도 영향을 미친다.
- 이용하여 세포질내의 iNOS 단백질의 발현양을 조사하였다. LPS를 처리하지 않은 세포에서는 iNOS의 단백질 발현이 나타나지 않은 반면에, LPS에 의하여 대식세포내의 iNOS 단백질은 강하게 유도되었으며, AGE의 농도가 증가할수록 iNOS의 발현이 감소하는 것으로 나타났다. iNOS의 발현은 최고 농도인 100 ug/ml에서 가장 많이 억제되었다 (Fig.
- RAW264.7 세포의 iNOS 단백질 발현의 본 실험에서 LPS를 처리하지 않은 세포에서는 iNOS의단백질 발현이 나타나지 않고, LPS로 활성화된 대식세포 내의 iNOS 단백질은 강하게 유도되었다. AGE의 농도가 증가할수록 iNOS의 발현이 감소하는 것으로 나타나며 iNOS의 발현은 최고 농도에서 가장 많이 억제되었다.
- 그 결과로 LPS를 처리하지 않은 세포에서는 세포에서의 iNOS의 발현이 나타나지 않았으나, LPS로 활성화된 대식세포에서 iNOS의 발현이 크게 유도되었다. iNOS의 발현은 AGE의 양이 증가할수록 iNOS의 발현에 감소가 일어나는 것으로 나타났다.
- 1 에 나타내었다. 그 결과 AGE가 100 ug/ml일 때까지는 세포의 생존율에 영향을 미치지 않았으나, 200 ug/ml 이상의 농도에서는 세포 생존율이 유의성을 갖고 크게 감소하는 것으로 나타났다. 따라서 실험에서 사용한 AGE의 농도는 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 최고 농도인 100 ug/ml 로 하였다(Fig.
- 3). 그 결과로 LPS를 처리하지 않은 세포에서는 세포에서의 iNOS의 발현이 나타나지 않았으나, LPS로 활성화된 대식세포에서 iNOS의 발현이 크게 유도되었다. iNOS의 발현은 AGE의 양이 증가할수록 iNOS의 발현에 감소가 일어나는 것으로 나타났다.
- 5). 그 결과로 LPS에 의해 자극을 받은 대식세포에서는 NF-kB 의 활성이 유도되면서 IkB 단백질이 감소하였고 AGE를 처리하였을 때 IkB 의 단백질 발현은 LPS로 활성화 시키지 않은 세포에서의 IkB의 발현과 유사하게 나타났다.
- 둘째, iNOS의 mRNA와 protein 발현이 참당귀 에탄올 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 감소되었다.
- 여기에 AGE를 농도별로 처치하였을 때, 농도가 증가할수록 유의성 있게 nitrite의 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 또한 AGE 100 ug/ml를 처리하였을 때 유의성이 있게 73%의 NO생성을 억제하였다.
- 본 실험에서 LPS를 처리하지 않은 세포에서는 iNOS의 발현이 나타나지 않았고, LPS로 활성화된 대식세포에서 iNOS의 발현이 크게 유도되었고, AGE의 양이 증가할수록 iNOS의 발현에 감소가 일어나는 것으로 나타났다. 이 결과로 부터 LPS로 활성화 시킨 대식세포에서 AGE 추출물이 농도 의존적으로 iNOS발현을 억제한다고 할 수 있다.
- 본 실험에서 RAW264.7 세포의 NO 생성에 미치는 영향은 AGE의 농도가 증가할수록 유의하게 nitrite의 생성을 억제하고, AGE 100 ug/ml를 처리하였을 때 유의성이 있게 73%의 NO생성을 억제하였다. 이는 에탄올을 이용하여 추출된 참당귀 성분이 LPS로 활성화된 대식세포의 NO생성을 억제한다고 보여지며, 이는 농도에 비례하여 NO 생성을 억제한다고 할 수 있다.
- 셋째, LPS로 유도된 RAW264.7 세포의 NF-kB 활성화는 참당귀 에탄올추출물에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 當歸 에탄올 추출물이 항염증 효과가 있음을 설명해주고, 과량의 염증성 매개물 생성과 관련된 염증성 질환의 치료에 도움을 줄 수 있을 것이라 사료된다.
- LPS에 의해 활성화된 대식세포는 대조군에 비해 90배의 NO를 생성하였다. 여기에 AGE를 농도별로 처치하였을 때, 농도가 증가할수록 유의성 있게 nitrite의 생성을 억제하는 것으로 나타났다. 또한 AGE 100 ug/ml를 처리하였을 때 유의성이 있게 73%의 NO생성을 억제하였다.
- 일어나는 것으로 나타났다. 이 결과로 부터 LPS로 활성화 시킨 대식세포에서 AGE 추출물이 농도 의존적으로 iNOS발현을 억제한다고 할 수 있다.
- AGE의 농도가 증가할수록 iNOS의 발현이 감소하는 것으로 나타나며 iNOS의 발현은 최고 농도에서 가장 많이 억제되었다. 이러한 결과들로 볼 때, LPS로 활성화 시킨 대식세포에서 AGE에 의해 농도 의존적으로 iNOS의 유전자 발현과 단백질 발현을 억제하며, 이는 Nitric Oxide의 생성에도 영향을 미친다.
- 첫째, NO의 분비 량은 참당귀 에탄올 추출물 처리에 의해 농도 의존적으로 억제되었고 처리군 100 ug/ml에서 73%의 억제율을 보였다.
후속연구
- 이는 에탄올을 이용하여 추출된 참당귀 성분이 LPS로 활성화된 대식세포의 NO생성을 억제한다고 보여지며, 이는 농도에 비례하여 NO 생성을 억제한다고 할 수 있다. 그러므로 NO의 생성에 의해 발생되어지는 염증반응과 자가 면역 관련 질환에 참당귀 에탄올 추출물이 NO의 생성을억제시켜 질환을 완화시키는데 도움이 될 것이다.
- 다량의 생성된 NO는 혈관확장, 세포독성, 조직손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다기). 그러므로 iNOS 발현을 억제하여 NO의 생성을 줄인다면 염증성 질환의 치료에 중요한 역할을 할 것으로 기대된다.
- 따라서 천연물에서 이들 효소들을 억제하여 항염증 작용을 나타내고 또한 이들 효소와 관련된 여러 biomarker들에 작용하는 기전을 통하여 항염증제로 적용할 수 있는 물질들을 찾기 위한 많은 연구가 이루어지고 있다. 따라서 염증에 관여하는 중요한 요소인 NO의 생성을 NF-kB신호 전달 경로에서 억제하는 참당귀 에탄올 추출물은 항염증 치료제로 활용될 수 있을 것이라 사료된다.
- iNOS의 발현은 NF-kB 활성으로 유도되며 이는 대식세포에서 LPS나 cytokine에 의해 염증성 매개물들이 과잉 생산되는 중요한 매커니즘이다35-4。). 따라서 참당귀 에탄올 추출물은 cytokine 등에 의해 iNOS의 발현으로 생성되는 NO의 생성을 iNOS 유전자 발현과 iNOS 단백질 억제를 통해 NO의 생산을 억제하는 항염증제로서의 기능을 할 수 있을 것이다.
- 본 실험에서는 비록 일당귀와 중국당귀를 시료로 사용하지 않았지만, 참당귀 및 일당귀와 중국 당귀에는 ligustilide와 ferulic acid가 공통 성분이며 그 함량에는 서로 차이가 있는데, 중국 당귀가 가장 많은 양을 함유하고 있으므로 이를 모두 시료로 사용하여 그 특성을 비교하는 것은 가치 있는 연구테마일 것으로 사료된다.
- 앞으로의 연구는 이러한 결과를 바탕으로 당귀의 고유한 작용기전을 밝히고, 기존의 양약과 염증 호전도에 대한 객관적 약효를 비교할 것이다.
- 7 세포의 NF-kB 활성화는 참당귀 에탄올추출물에 의해 억제됨을 확인할 수 있었다. 이상의 결과는 當歸 에탄올 추출물이 항염증 효과가 있음을 설명해주고, 과량의 염증성 매개물 생성과 관련된 염증성 질환의 치료에 도움을 줄 수 있을 것이라 사료된다.
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