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문제 정의
- 본 연구에서는 인삼, 목과 혼합추출액(Gin-CHF)이 AD 병태 생쥐의 뇌조직 손상에 미치는 영향을 실험적으로 규명하고자 βA로 유도된 AD 병태 생쥐의 뇌세포를 분석하여 뇌조직의 허혈 (虛血)상태, 조직손상의 변화를 면역조직염색법으로 관찰한 바, 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.
제안 방법
- Calbiochem 회사에서 공급받아 AD 병태 생쥐모델을 만들었다. AD 유발생쥐를 마취한 후후두부에서 전두부 방향으로 두개(願蓋)를 열어 그 안에 있는 뇌를 꺼내어 생리식염수에 씻은 후 brain matrix를 이용하여 2mm 의 두께로 자른 후 2% TTC 용액을 가하여 20분간 염색하였다. TTC 용액에 의하여 정상조직은 적색으로 염색이 되고, 허혈(虛血)된 부분은 염색이 되지 않는다.
- C57BL/6 mice were orally administered of Gin-CHF or Tacrine HCl and the acquisition taining trial continued once a day for 60 days. Normal C57BL/6 mice (A) was not treated.
- C57BL76 mice were orally administered of Gin-CHF or TacrineHCl and the acquisition taining trial continued once a day for 60 days. Normal C57BL/6 mice (A) was not treated.
- C57BU6 mice were orally administered of Gin-CHF or Tacrine HCl and the acquisition taining trial continued once a day for 60 days. Normal C57BL/6 mice (A) was not treated.
- βA는 AD 환자의 뇌에서 senile plaques와 diffuse deposits를 주로 유도하는 것으로 알려졌다. Calbiochem 회사에서 공급받아 AD 병태 생쥐모델을 만들었다. AD 유발생쥐를 마취한 후후두부에서 전두부 방향으로 두개(願蓋)를 열어 그 안에 있는 뇌를 꺼내어 생리식염수에 씻은 후 brain matrix를 이용하여 2mm 의 두께로 자른 후 2% TTC 용액을 가하여 20분간 염색하였다.
- 분리된 AD 병태 생쥐의 뇌를 10% formaldehyde 용액에 고정한 후 세절하여 흐르는 물에 8시간 수세한 다음 표준 방법으로 포매하였다. 이것을 microtome으로 절편을 만들어 HematoxyHn & Eosin염색을 실시하고 광학 현미경상에서 관찰하였다.
- 분리된 AD 병태 생쥐의 뇌를 적출하여 10% 포르말린 용액에 고정한 후 파라핀 블록을 만든 후 조직절편을 4μm 두께로 세절한 후 probe-on plus slide(Fisher Scientific, USA) 에 부착시켜 건조시켰다. 그리고 탈파라핀(Deparaffinized) 후 함수시키고 0.
- 포매하였다. 이것을 microtome으로 절편을 만들어 HematoxyHn & Eosin염색을 실시하고 광학 현미경상에서 관찰하였다.
- 인삼 15g과 목과 15g을 혼합한 다음 증류수 1, 300㎖을 가하여 열탕추출기에서 3시간 가열하여 얻은 250㎖추출액을 여과지(Wh atman NO. 1)로 1회 여과한 후 감압 농축장치로 농축하였고, 이를 다시 동결 건조기를 이용하여 완전 건조한 추출물을 deep-freezer (-84℃)에 보관한 뒤, 실험에 필요한 농도로 희석하여 사용하였다.
- 0)를 이용해 microwave oven에 15분간 전 처리하였다. 조직 내 과산화효소의 작용을 억제하기 위하여 3% HQ에 10분간 처리한 후 조직 내의 항원과 비특이적 단백결합을 억제하기 위해 정상 혈청으로 단백질을 차단시켰다.
- Brain Hippocampus (BH)는 뇌의 hippocampus 부분의 면적이며, risk에 대한 허혈(虚血) 크기는 전체 면적의 percent로 표현하였다. 즉 BH부위의 허혈虛血) 면적(LV)은 (AT of area at risk/ST of BH) x 100으로 계산하여 분석하였다.
대상 데이터
- o, D), they were sacrificed, immunohistochemical staining for presenilin 1/preseilin 2 protein was performed on brain tissue sections. The brain specimens were embedded in OCT compound (Miles, EDchard, IN), snap frozen in liquid nitrogen and then stored at -8010 until use. Frozen sections cut in 6mm were fixed in cold acetone (-2010) for lOmin.
- o, D), they were sacrificed, immunohistochemical staining for GFAP protein was performed on brain tissue sections. The brain specimens were embedded in OCT compound (Miles, Elkhard, IN), snap frozen in liquid nitrogen and then stored at -801 until use. Frozen sections cut in 6mm were fixed in cold acetone (-2013) for lOmin.
- o, D), they were sacrificed, immunohistochemical staining for Tau protein was performed on brain tissue sections. The brain specimens were embedded in OCT compound (Miles, Elkhard, IN), snap frozen in liquid nitrogen and then stored at -80℃ until use. Frozen sections cut in 6 mm were fixed in cold acetone (-20℃) for 10 min.
- 본 실험에 사용한 인삼, 목과 혼합추출액(Gin-CHF)에 사용한 약재는 금산약재시장에서 금산인삼 4년근과 한국산 목과를 구입하여 사용하였고, 인삼과 목과의 용량은 Table 1과 같다.
- 본 실험을 위하여 사용된 암컷 C57BL/6생쥐와 BALB/c 생쥐는 한국생명과학연구원에서 분양받아 1주 이상 적응시킨 후 실험에 사용하였으며, 실험당일까지 고형사료(조단백질 22.1% 이상, 조지방 8.0%이하, 조섬유 5.0%이하, 조회분 8.0%이하, 칼슘 0.6%이상, 인 0.4%이상, 삼양사, 한국)와 물을 충분히 공급하고 실온 22±2℃를 계속 유지하고 2주일간 실험실 환경에 적응시킨 후 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean±standard error 로 기록하였다. 유의성 검증은 Student's t-test 분석 방법을 이용하였다.
- 기록하였다. 유의성 검증은 Student's t-test 분석 방법을 이용하였다.
이론/모형
- TTC 용액에 의하여 정상조직은 적색으로 염색이 되고, 허혈(虛血)된 부분은 염색이 되지 않는다. 허혈(虚血) 크기의 측정은 Michael의 방법으로 수행하였다. 허혈(虛血)의 크기(AT)는 [(A1 / ST1)+(A2 / ST2)+(A3 / ST3)+(A4 / ST4)]이고, A는 사진 상에 나타난 허혈(虚血) 면적, ST는 각각 section(2mm)의 전체 면적.
성능/효과
- 1. 인삼, 목과 혼합추출액은 AD 병변 뇌조직의 虛血 상태를 유의성 있게 개선하였고 虛血로 인한 뇌조직 손상을 억제하였다.
- 2. 인삼, 목과 혼합추출액은 AD 병변 뇌조직의 면역조직화학염색법으로 Tau 단백질, GFAP 단백질, presenilin 1/presenilin 2 단백질의 발현 억제를 확인하였다.
- AD 병태 생쥐 뇌조직의 虛血 크기를 관찰한 결과, Fig. 1과 Fig. 2에서 보는 것처럼 βA를 뇌에 주입한 대조군에서 虛血의 크기가 89.3±6.8(%)이었고, tacrine 투여군은 45.8±4.7(%)로 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였으며(p<0.001), 인삼, 목과 혼합추출액(Gin-CHF) 400㎎/㎏ 투여군도 57.3±4.8(%) 로 대조군에 비하여 유의성 있게 감소하였다(p<0.05). 그리고 200㎎/㎏ 투여군은 81.
- AD 병태 생쥐 뇌조직의 손상을 관찰한 결과, 정상군은 hippocampus와 entorhinal cortex(EC) 그리고 fimbriaformix (FIFX)가 뚜렷이 나타났다. 그러나 대조군은 뇌조직의 염증과 병변으로 그 형태가 뚜렷하지 않으나, tacrine과 인삼, 목과 혼합추출액(Gin-CHF)을 투여한 실험군은 정상과 가깝게 뚜렷한 조직 형태를 갖추고 있었다(Fig.
- pannel B인 대조군에서 Tau 단백질에 positive한 조직 세포가 많이 보이고, tacrine(pannel C)과 인삼, 목과 혼합추출액 (pannel D) 투여군에서는 Tau 단백질에 positive한 조직 세포가 현저히 감소한 것을 볼 수 있었다. 그리고 Fig.
- 그리고 hippocampus의 neuronal line이 정상군은 뚜렷이 나타나지만 대조군은 뇌 조직의 염증세포와 병변 등으로 그 형태가 뚜렷하지 않았다. tacrine을 투여한 실험군은 정상과 가깝게 뚜렷한 hippocampus의 neuronal line을 나타내고 있으며 인삼, 목과 혼합추출액 (Gin-CHF) 투여 군에서도 희미하지만 hippocampus의 neuronal line이 나타났다(Fig. 4).
- 현저히 감소한 것을 볼 수 있었다. 그리고 Fig. 7은 glial fibrillary acidic protein(GFAP)로 성상교세포 특이 단백질에 대한 면역조직화학 염색을 한 결과로, 대조군인 pannel B에서 GFAP 단백질에 positive한 성상교세포가 많이 보이고, tacrine(pannel C)과 인삼, 목과 혼합추출액 (pannel D) 투여군에서는 GFAP 단백질에 positive한 성상교세포가 현저히 감소한 것을 볼 수 있었다.
- 4의 B pannel에 나타난 바와 같이 조직에 astrocytes와 microglial 세포(화살표)가 침투되어 neuronal line이 사라지고 병변이 심화된 것을 볼 수 있었다. 그리고 tacrine과 인삼, 목과 혼합추출액(Gin-CHF)을 투여한 실험군은 정상과 가깝게 뚜렷한 astrocytes와 microglial 세포가 Hippocampus로 침투가 억제된 것을 알 수 있었다. 그리고 인삼, 목과 혼합추출액(Gin-CHF) 투여군인 D panned 대조군에서 뇌의 虛血상태로 유도된 stratum orion, stratum radiatum, oligodendrocytes-like cells, astrocytes-like cell 등은 보였지만, 병변 부위에서 사라졌던 pyramidal cell layer, neurons 그리고 dentate gyrus 등은 회복된 것을 볼 수 있었다(Fig.
- 그리고 tacrine과 인삼, 목과 혼합추출액(Gin-CHF)을 투여한 실험군은 정상과 가깝게 뚜렷한 astrocytes와 microglial 세포가 Hippocampus로 침투가 억제된 것을 알 수 있었다. 그리고 인삼, 목과 혼합추출액(Gin-CHF) 투여군인 D panned 대조군에서 뇌의 虛血상태로 유도된 stratum orion, stratum radiatum, oligodendrocytes-like cells, astrocytes-like cell 등은 보였지만, 병변 부위에서 사라졌던 pyramidal cell layer, neurons 그리고 dentate gyrus 등은 회복된 것을 볼 수 있었다(Fig. 5).
- 이상의 결과를 종합해 보면 인삼, 목과 혼합추출액(Gin-CHF)은 뇌조직의 虛血상태를 개선하고 虛血상태로 인한 뇌조직의 손상을 억제하는 것으로 나타났다.
후속연구
- 따라서 인삼, 목과 혼합추출액(Gin-CHF)은 βA의 과다 생성, 미신경교세포의 염증반응 cytokine의 과잉발현 등으로 인해 야기될 수 있는 AD와 choline성 신경세포의 퇴화에 의해 야기되는 기억력 감퇴에 대한 예방과 치료제로 활용될 수 있을 것으로 판단되며, 향후 정확한 기전에 대한 연구와 AH 대한 인삼, 목과 혼합추출액(Gin-CHF)의 임상적 활용에 대한 연구가 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로 미루어 보아 인삼, 목과 추출액은 AD의 예방과 치료에 사용될 수 있을 것으로 판단되며 정확한 기전에 대한 연구와 AD 치료에 있어서 인삼, 목과 혼합추출액의 임상적 활용에 대한 연구가 향후 지속적으로 이루어져야 할 것으로 사료된다.
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