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문제 정의
- 그러나 신이와 전호의 품질을 평가할수 있는 지표물질의 선정이나 이를 이용한 함량분석에 대한 연구는 없었다. 따라서 본 연구에서는 국내 유통 생약의품질 표준화 연구의 일환으로 신이와 전호의 주성분인magnolia anthricin을 지표물질로 선정하고 HPLC로 정 량하여 신이와 전호의 품질관리 기준을 설정함으로써, 우수한약재 유통에 기여하고자 하였다 (2)
제안 방법
- NMR spectrume Bruker사의 Avance 250(250 MHz)를 사용하여 측정하였고, 내부표준물질은 TMS로, chemical shift는 ppm 단위로 표시하였다. 회분시험법 및 산불용성 회분시험법에 사용된 회화로는 미국 Thermolyne사의 Furnace 47900을 사용하였다.
- 45 membrane filter로 여과하여 여액을 5 ml로 조정, 검액으로 사용하였다. 각각의 검 액을 0.5 cc씩 HPLC를 실시하여 얻은 chromatogram에서 각각의 peak 면적을 구하여 회귀직선방정식으로부터 각각의 지표물질의 함량을 구했다.
- 추출물을 감압농축 하였다. 농축물을 dichloromethane (MC)-water로 분획하여 MC 가용물을 얻었다. MC 분획물을 silica gel column에 loading 하고 n-hexane: EtOAc> 용매로 하여 elution 시켜 7개의 fraction을 얻었다 (MF1 ~MF7).
- 산불용성회분시험 - 회분에 묽은 염산 25 ml를 조심하여 넣고 5분간 가만히 끓여 불용물을 정 량용 여과지를 사용하여 여과하고 열탕으로 잘 씻어 잔유물을 여과지와 함께 건조한 다음 회분실험에서와 같은 조작으로 무게를 미리 단사기제 도가니에서 3시간 강열하여 데시케이터에서 방냉한 다음 그 무게를 정밀하게 달아 산불용성 회분 (%)으로 하였다.
- 신이로부터 magnolin의 분리 — 전국 각지에서 구입한 신이 시료로부터 일정 량씩 취하여 섞은 5 kg을 MeOH로 추출하여 추출물을 감압농축 하였다. 농축물을 dichloromethane (MC)-water로 분획하여 MC 가용물을 얻었다.
- 약전생약인 신이와 전호의 품질평가를 위한 guide line을 제시하기 위하여 전국에서 수집된 시판 신이와 전호에 대하여 회분실험, 산불용성회분실험, 묽은 EtOH 엑스량 및 MeOH 추출물 중의 지표물질의 함량평가를 실시하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 감압 농축한 MeOH 추출액을 증류수에 현탁시키고, 동량의 MC를 가하여, 분획 깔때기로 MC층과 H20층을 분획하는 조작을 3회 반복 실시한 후, MC층을 감압 농축하여 281 g을 얻었다. 얻어진 MC분획을 silica gel column chromatography를 이용하여 n-hexane:EtOAc의 gradient로 용출시켜 10개의 什action으로 나누었다. 이 중 fr.
- 지표물질의 함량 - 미리 조제된 검액을 10 ㎕씩 HPLC를 실시하여 얻은 chromatogram에서 면적을 구하여 회귀방정식으로부터 각각의 지표물질 함량을 구하였다.
- 품질표준화 연구를 위하여 수집한 신이와 전호 각각 42 종에 대하여 회분함량, 산불용성회분함량, 묽은 EtOH 엑스량, MeOH 엑스 중의 지표물질인 magnolin 및 anthricin 함량을 구하였다. Magnolin의 Revalue는 0.
대상 데이터
- ) Hoffin.(미나리과 Umbellif&ae)의 뿌리를 사용 한다.6) 전호(Anthrici Radix)는방추형으로 근두부에는 줄기와 엽초가 남아 있는 것도 있다.
- HPLC의 분석조건 — Columne Shim-pak CLC-ODS(M) 을 사용하였으며, detector는 UV-278 nm (magnolin:과 UV-289nm (anthricin)을 사용하였다. Mobile phase는 MeOH: H2O=80:20 (v/v%)# 사용하였고, flow rate는 6ml/min이었다.
- 검체 - 2005년 국내에서 시판되고 있는 신이와 전호 각각 42종을 구입하여 사용하였다. 구입 방법은 전국을 서울 경기-강원, 충청, 영남, 호남 지역으로 분류하고 각 지역에서 인구비례에 따라서 시판되는 신이와 전호의 시료수를 정하여 각각 구입 하였다.
- 42종을 구입하여 사용하였다. 구입 방법은 전국을 서울 경기-강원, 충청, 영남, 호남 지역으로 분류하고 각 지역에서 인구비례에 따라서 시판되는 신이와 전호의 시료수를 정하여 각각 구입 하였다.
- 시약 및 기기 - HPLC는 Shimadzu LC-10A를 사용하였다. NMR spectrume Bruker사의 Avance 250(250 MHz)를 사용하여 측정하였고, 내부표준물질은 TMS로, chemical shift는 ppm 단위로 표시하였다.
이론/모형
- NMR spectrume Bruker사의 Avance 250(250 MHz)를 사용하여 측정하였고, 내부표준물질은 TMS로, chemical shift는 ppm 단위로 표시하였다. 회분시험법 및 산불용성 회분시험법에 사용된 회화로는 미국 Thermolyne사의 Furnace 47900을 사용하였다.
성능/효과
- 1. 실험에 사용된 42종의 신이와 전호의 회분함량은 각각3.79±1.25%와 5.19±1.27%로 신이의 회분함량은 3.0% 이상, 전호의 회분함량은 4.0%이상이 타당할 것 같다.
- 성분으로는magnosalin, magnosalicin, magnone A, B, eudesmin, magnolin, lirioresinol-B dimethylether 등의 lignan 계열의 물질, a-pinene, cineole, citral, metylchavicol, eugenol, capric acid, oleic acid, limonene, camphor, sabinene, aterpineol, /-asarone, euasarone, asarylaldehyde 등의 정유, (-)-coclaurine, (-)-jV-methylcoclaurine, (+)-reticuline, yuzirine, liriodenine, remerine, anonaine, glaucine, isolaurenine Moxide 등의 alkaloid 등이 알려져 있다한방에서는 두통, 비염(축농증), 치통 등에 사용하며, 알러지 반응에 관여하는 비만세포(mast cell, RBL-2H3 cell)의 세포사멸을 촉진한다.2) M.fargesii의 꽃봉오리에서 분리된 lignan류인 eudesmin과 magnolin, lirioresinol-B dimethylether는 LPSS. 유도한 TNFa의 생산을 억제하며 (in vitro)^ tiliroside 에는 rosmarinic acid보다 강한 항보체활성이 있다.
- 2. 산불용성 회분함량은 각각 0.66±0.05%와 0.64±0.43%로 신이의 산불용성 회분함량은 0.7%이하, 전호의 산불용성 회분 함량은1.0% 이하가 타당할 것 같다.
- 3. 묽은 EtOH 엑스의 함량은 8.47±6.04%와 15.26±4.78%로, 함량의 편차가 큰 것을 감안하여 신이의 경우는 3.0% 이상, 전호의 경우는 10.0% 이상으로 하면 타당하리라 생각된다.
- 4. Magnolia 지표물질로 하여 신이에서의 함량을 분석한 결과 31.09±15.74%이었다. 시료 중 magnolia 함량이 극히 적은 시료 6종을 제외하면 대부분이 15% 이상의 함량을 나타내었다.
- 5. 전호 중 anthricin의 함량은 1.08±0.85%이었으며, anthricin0] 전혀 검출되지 않았거나 극히 미량 (0.1% 미만)으로 검출된 시료 5종을 제외하면 대부분의 시료에서 0.5 % 이상의 함량을 보였다. 따라서 전호의 지표물질로 anthricin을 사용했을 경우 0.
- (미나리과 Umbellif&ae)의 뿌리를 사용 한다.6) 전호(Anthrici Radix)는방추형으로 근두부에는 줄기와 엽초가 남아 있는 것도 있다. 길이 3~ 10 cm, 지름 7~ 15 mm로 바깥면은 회흑색~흑갈색이며, 위쪽에는 가로주름 및 뿌리자국이 있다.
- 각표준용액 0.5 cc를 취 하여 HPLC를 실시하여 얻은 chromatogram으로부터 면적을 구하여, 이들 면적과 표준용액의농도를 변수로하여 검량선을 작성하여 얻은 회귀직선 방정식은 magnolin의 경우는 y = 2655192x — 802436 (R2 = 0.992016)이었고, anthricin의 경우는 y = 2555x-185441 (R2=0.9999) 이었다.
- 78% (전호)였다. 수집된 시료의 methanol 추출물에 대한 magnolin과 anthHcin의 함량을 HPLC로 정량한 결과, 신이의 각 시료에 함유된 magnolin의 함량은 31.09±15.74%였다. Magnolin의 함량이 비교적 높게 나타난 것은 신이의 함유성분 중에서 정유가 차지하는 비율이 높으나 HPLC의 검출계로 U* V 사용하여 정유성분의 대부분이 검출되지 않고 UV에 검출된 시료 중 magnolin의 함량이 높았던 것으로 사료된다.
- Magnolin의 함량이 비교적 높게 나타난 것은 신이의 함유성분 중에서 정유가 차지하는 비율이 높으나 HPLC의 검출계로 U* V 사용하여 정유성분의 대부분이 검출되지 않고 UV에 검출된 시료 중 magnolin의 함량이 높았던 것으로 사료된다. 실험에 사용된 전호의 MeOH 엑스에서의 anthricin 함량은 1.08 ±0.85% 이 었으며, anthricin이 전혀 검출되지 않았거나 극히 미량 (0.1% 미만)으로 검출된 시료 5종을 제외하면 대부분의 시료에서 0.5% 이상의 함량을 보였다. 이는 우리나라에 수입되는 전호의생산지가 매우 다양하여 생산지의 기후 등 환경의 차이에서 기인하는 것으로 생각된다(Tables 1, 11).
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