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문제 정의
- (26-29). 본 연구에서는 약용 자원 식물로서 보존 활용가치가 높으며 민간요법에서 경험적으로 얻은 약리효과를 토대로 등대풀을 이용하여 에탄올 추출물 및 순차적 용매분획물을 얻어 항산화성 및 항균효과를 검색하고자 하였으며, 아울러 총폴리페놀 및 플라보노이드 함량을 측정하여 그 상관성 등을 비교 조사하여 식품 저장성이나 안전성을 향상하기 위한 식품첨가제나 보존제로서의 개발 가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- 5 mM NBT를 첨가하여 반응 시 켰다. Xanthine oxidase 억제 및 superoxide 소거 활성은 각각 생성된 uric acid와 superoxide의 흡광도가 50% 감소할 때 나타나는 시료의 농도 (ICG로 표시하였으며, 각 시료는 3회 반복하여 실험을 실시하여 평균값을 구하였다.
- mL 으로 하여 액체배지에 첨가한 후 미생물에 대한 생육저해율을 측정하였다(Fig. 1). 그 결과 에탄올 추출물은 각각의 균주마다 약간의 차이는 보였지만 전반적으로 30% 내외에서 생육저해효과를 나타내었고, 특히 순차적 분획물들 중에서 에틸아세테이트 분획물이 B.
- 각 균주는 10 mL의 액체배지에 접종하고 37oC 에서 18시간씩 3회 계대 배양하여 항균활성 시험균주로 사용하였으며, 항균성 시험용 평판배지 조제는 각각의 시험균 농도를 650 nm에서 optical density(O.D) 값 0.4(106 CFU/mL)가 되게 한 후 pour-plate 방법에 따라 배지가 분주된 배양 접시에 균일하게 섞은 후 실온에서 응고시켜 균접종평판배지를 만들어 사용하였다. 각각의 시료를 100, 250, 500, 1000 ug/mL로 희석하여 멸균된 paper disc(Whatman No.
- 동일한 방법으로 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물 층을 분획하여 각각의 순차 분획물을 얻었으며, 모든 과정은 3회 반복 실시하였다. 각 시료 분획물은 해당 용매로 용해 시 켜 0.2 ym membrane filter(Advantec MFS Inc., USA)로 제균하여 4oC에 보관하면서 본 연구에 사용하였다.
- 다음과 같이 측정하였다. 각각의 균 농도를 650 nm에서 O.D 값 0.4(106 CFU/mL)가 되게 한 후 well plate에 분주하고, 각 시료를 0, 25, 50, 100, 200 ug/mL 농도로 10 uL씩 처리하여 24시간 배양하였다. 세균 배양액의 증식 정도를 microplate reader(Bio-TEK Instrumenis Inc.
- 4(106 CFU/mL)가 되게 한 후 pour-plate 방법에 따라 배지가 분주된 배양 접시에 균일하게 섞은 후 실온에서 응고시켜 균접종평판배지를 만들어 사용하였다. 각각의 시료를 100, 250, 500, 1000 ug/mL로 희석하여 멸균된 paper disc(Whatman No. 5, 8 mm)를 시료 수에 맞게 25 uL씩 천천히 흡수시 킨후, 추출용매를 완전히 증발시키고 시험용 평판배지 표면에 놓아 밀착시키고 37oC에서 24시간 배양한 후 disc 주변에 생성된 생육저해환(clear zone, mm)의 크기를 측정하여 항균활성을 비교 분석하였다.
- 97이 되도록 에탄올로 희석하여 10초간 진탕 시 켰다. 그리고 용매 1 mL에 분말로 추출된 시료 1 mg 을 첨가하여 충분히 녹인 후 준비된 DPPH 450 yL에 시료 용액액 50 yL를 넣어 실온에서 10분간 방치 하였다가 517 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 대조군으로는 Sigma사의 butylated hydroxy anisole(BHA), ascorbic acid, trolox를 사용하였다.
- 상기의 과정을 3회 반복 추출하여 에 탄올 추출물을 얻은 뒤, 건조된 에탄올 추출물에 10배량의 증류수와 동량의 헥산을 첨가하여 분획한 후 감압 농축하여 헥산 분획물을 얻었다. 동일한 방법으로 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물 층을 분획하여 각각의 순차 분획물을 얻었으며, 모든 과정은 3회 반복 실시하였다. 각 시료 분획물은 해당 용매로 용해 시 켜 0.
- 등대풀 에탄올 추출물과 순차적 분획물의 에항균활성은 disc 에 점적한 추출물과 분획물의 처리농도에 따른 항균활성을 비교 즉정하였다. 그 결과 조 추출물인 에탄올 추출물과 순차적 분획물 중에서 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물이 처리농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 생육저해환 크기가 비례적으로 크게 증가하였으며, 그람양성균은 B.
- 69 貽/ mL로 나타났다(Table 3). 등대풀에 탄올 추출물 및 순차적분획 물의 xanthine oxidase 저 해 활성 과 superoxide radical 소거활성을 xanthine/xanthine oxidase system에 의해 즉정하였다. 그 결과, 등대풀에 탄올 추출물 및 순차적 분획물의 xanthine oxidase 저해 활성은 본 연구에 사용된 처리농도범위에서는 거의 나타나지 않았는데 에틸아세테이트 분획물인 경우 IC50 값이 256.
- 사용하였다. 등대풀의 에탄올 추출물 및 순차적 분획물의 제조는 80% 에탄올(EtOH) 및 분획용 헥산(n-hexane), 디클로로메탄 (CH2CW, 에틸아세테이트(EtOAc) 그리고 부탄올(BuOH) 을 사용하여 용매의 극성을 이용한 순차적 추출법을 사용하였다. 즉 분말 건조된 시료에 80%에 탄올로 추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압 농축하여 동결건조기로 완전 건조시 켰다.
- 또한 단백질과 결합하는 성질은 미생물 세포와 작용하여 성장저해를 유발시킴으로써 항균효과 등의 생리활성 기능을 가진다(29, 30). 따라서 등대풀 에탄올 추출물과 순차적 분획물의 총 폴리페놀 화합물과 플라보노이드의 함량을 측정 비교하였다(Table 6).
- 미생물의 생육 저해율의 측정은 배지 10mL에 각각의 균농도를 650 nm에서 O.D 값 0.4(106 CFU/mL) 가되 게 한 후, 각각의 시료를 500 ug/mL 농도로 처리하였다. 배양 후 microplate reader(Bio-TEK Instrumenis Inc.
- Superoxide의 양은 nitroblue tetrazolium(NBT) 환원 방법에 의해 측정하였다 (31, 32). 반응액으로는 각 농도별 시료(15.63, 31.25, 62.5, 125, 250, 500, 1000 ug/mL)와 0.5 mM xanthine과 1 mM EDTA 를 200 mM phosphate buffer(pH 7.5) 100 uL에서 준비 하였고 50 mU/mL xanthine oxidase를 첨가하여 uric acid의 생성을 유도하였다. Superoxide 소거 활성은 위 반응액에 0.
- 즉 분말 건조된 시료에 80%에 탄올로 추출한 후 여과하여 얻어진 추출액을 감압 농축하여 동결건조기로 완전 건조시 켰다. 상기의 과정을 3회 반복 추출하여 에 탄올 추출물을 얻은 뒤, 건조된 에탄올 추출물에 10배량의 증류수와 동량의 헥산을 첨가하여 분획한 후 감압 농축하여 헥산 분획물을 얻었다. 동일한 방법으로 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물 층을 분획하여 각각의 순차 분획물을 얻었으며, 모든 과정은 3회 반복 실시하였다.
대상 데이터
- Xanthine/xanthine oxidase에 의한 uric acid 생성은 290 nm에서 증가된 흡광도에 의해 측정하였고, 대조군으로는 allopurinol(Sigma)를 사용하였다. Superoxide의 양은 nitroblue tetrazolium(NBT) 환원 방법에 의해 측정하였다 (31, 32).
- 본 실험에 사용한 균주는 Table 1에 나타낸 바와 같이 그람양성균 3종과 그람음성균 4종으로 총 7종을 선정하여 사용하였으며, 배지는 tryptic soybean agar(TSA), tryptic soybean broth(TSB), brain heart infusion(BHI)는 Difco (USA)사에서 구입하여 사용하였다. 또한, DPPH(1, 1-di-phenyl-2-picrylhydrazyl), NBT(nitroblue tetrazolium), xanthine oxidase, Folin-Ciocalteu's phenol reagent, tannic acid, rutin 등 그 밖의 시 약들은 Sigma Chemical Co.
- 제주도 해안가 일대에 자생하고 있는 대극과 식물인 등대풀(Euphorbia helioscopia)을 2006년 4월경 에 채 집 하여 대한식물도감(29)을 참고하여 동정하였으며, 동정된 등대풀전초를 증류수로 2~3회 수세한 뒤 물기를 제거한 후 7일간음건한 후 마쇄기로 분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다. 등대풀의 에탄올 추출물 및 순차적 분획물의 제조는 80% 에탄올(EtOH) 및 분획용 헥산(n-hexane), 디클로로메탄 (CH2CW, 에틸아세테이트(EtOAc) 그리고 부탄올(BuOH) 을 사용하여 용매의 극성을 이용한 순차적 추출법을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치 土 표준편차를 구하여 신뢰수준 95%(p<0.05) 에서 통계적 유의차를 평가하였다.
이론/모형
- 사용하였다. Superoxide의 양은 nitroblue tetrazolium(NBT) 환원 방법에 의해 측정하였다 (31, 32). 반응액으로는 각 농도별 시료(15.
- 총 플라보노이드 화합물의 함량은 다음과 같은 발색 방법을 통하여 측정하였다(36). 즉, 시료를 각각 1 mg/mL로 녹인다음 0.
- 최 소저 해 농도(MIC)는 broth microdilution 방법 (34)에 따라 다음과 같이 측정하였다. 각각의 균 농도를 650 nm에서 O.
- 추출된 항균성 물질의 항균력 검색은 paper disc 방법을 사용하였다(33). 각 균주는 10 mL의 액체배지에 접종하고 37oC 에서 18시간씩 3회 계대 배양하여 항균활성 시험균주로 사용하였으며, 항균성 시험용 평판배지 조제는 각각의 시험균 농도를 650 nm에서 optical density(O.
- 폴리페놀 화합물 함량은 페놀성 물질인 phosphomolybdic acid 와 반응하여 청색을 나타내는 원리를 이용한 FolinDenis 방법을 이용하여 측정하였다(35). 시료를 1 mg/mL로녹인 다음 0.
- 항산화 활성은 1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH, Sigma)를 이용하여 시료의 라디칼 소거효과(radical scavenging effect)를 측정하는 Blois 법을 활용하였다(30). DPPH 약 2 mg을 에탄올 15 mL에 녹여 DPPH용액을 제조하였다.
성능/효과
- 결과를 Table 3에 나타내었다. DPPH의 free radical 소거활성은 에탄올 추출물 및 순차적 분획물 모두에서 처리농도에 따라 농도 의존적으로 DPPH의 free radical 소거 활성이 증가함을 보였다. 특히 순차적 분획물 중 에틸아세테이트와 부탄올 분획물은 DPPH radical 소거 활성이 대조군인 BHA 등의 항산화제와 비교 시 전혀 뒤떨어지지 않는 활성을 갖고 있으며, 이때의 IC50 값은 각각 5.
- 1). 그 결과 에탄올 추출물은 각각의 균주마다 약간의 차이는 보였지만 전반적으로 30% 내외에서 생육저해효과를 나타내었고, 특히 순차적 분획물들 중에서 에틸아세테이트 분획물이 B. subtig 대해 77.11%로가장 높은 저해율을 나타내었고, 그다음으로는 L. mono-cytogeneseM 76.24%, P. aeruginosa에서 75.65% 의 생육저해율을 나타내었다.
- 비교 즉정하였다. 그 결과 조 추출물인 에탄올 추출물과 순차적 분획물 중에서 에틸아세테이트 및 부탄올 분획물이 처리농도가 증가할수록 항균 활성을 나타내는 생육저해환 크기가 비례적으로 크게 증가하였으며, 그람양성균은 B. subiis에서, 그람음성균은 P. aeruginosa에서 가장 높게 항균활성이 나타났다(Table 4). 순차적 분획물들 중에서 항균력이 가장 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물의 최소저해농도를 액 체배지 희석 법 (broth dilution method)으로 측정 한결과를 Table 5에 나타내었다.
- 등대풀에 탄올 추출물 및 순차적분획 물의 xanthine oxidase 저 해 활성 과 superoxide radical 소거활성을 xanthine/xanthine oxidase system에 의해 즉정하였다. 그 결과, 등대풀에 탄올 추출물 및 순차적 분획물의 xanthine oxidase 저해 활성은 본 연구에 사용된 처리농도범위에서는 거의 나타나지 않았는데 에틸아세테이트 분획물인 경우 IC50 값이 256.96 ug/mL로 분획물 중 유일하게 xanthine oxidase 저해 활성을 갖고 있었다(Table 3). 그러나 superoxide radical 소거 활성은 xanthine oxidase 저해활성결과와 달리 에탄올 추출물 및 순차적 분획물 모든 처리구에서 농도 의존적으로 활성이 증가함을 보였으며, 특히 에틸아세테 이트 분획물인 경우 superoxide radical 소거 활성 의 IC50 값이 10.
- 96 ug/mL로 분획물 중 유일하게 xanthine oxidase 저해 활성을 갖고 있었다(Table 3). 그러나 superoxide radical 소거 활성은 xanthine oxidase 저해활성결과와 달리 에탄올 추출물 및 순차적 분획물 모든 처리구에서 농도 의존적으로 활성이 증가함을 보였으며, 특히 에틸아세테 이트 분획물인 경우 superoxide radical 소거 활성 의 IC50 값이 10.55 ug/mL로 대조 구로 사용한 Allopurin이보다 매우 우수한 superoxide radical 소거 활성을 나타내었다(Table 3). 항산화 물질의 가장 특징적인 기작은 유리기와 반응하는 것으로 유리기 소거 작용은 활성 라디칼(free radical)에 전자
- 3배가량 증가되는 경향을 보였다. 등대 풀 에탄올 추출물과 순차적 분획물별 총 플라보노이드 함량은 에탄올 추출물에서 8.47 mg/g, 헥산에서 22.96 mg/g, 디클로로메 탄에서 31.32 mg/g, 에틸아세 테 이 트에 서 27.96 mg/g, 부탄올에서 5.68 mg/g 그리고 수용성 분획물에서 0.54 mg/g으로 나타났으며, 디클로로 메탄 분획물과 에틸아세테이트 분획물은 비슷한 함량을 보여주었다. 등대풀에탄올 추출물과 순차적 분획물에서의총 플라보노이드 함량 순서는 디클로로 메탄 분획물> 에틸아세테이트 분획물> 에탄올 추출물> 헥산 분획물> 부탄올 분획물> 수용성 분획물 순이었다.
- 순차적 분획물들 중에서 항균력이 가장 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물의 최소저해농도를 액 체배지 희석 법 (broth dilution method)으로 측정 한결과를 Table 5에 나타내었다. 등대풀 디클로로메탄 분획물에 대한 최 소저 해 농도는 B. subtilis, L. monocytogenes, S. Typhimurium에서 50 ug/mL로 가장 낮은 농도에서 생육이 저해되었으며, S. aureus, P. aeruginosa, S. Enteritidis에서는 100 ug/mL, Ecoli에서는 200 ug/mL 등의 순으로 나타났다. 또한 등대풀 추출물과 순차적 분획물의 농도를 500 ug/
- 54 mg/g으로 나타났으며, 디클로로 메탄 분획물과 에틸아세테이트 분획물은 비슷한 함량을 보여주었다. 등대풀에탄올 추출물과 순차적 분획물에서의총 플라보노이드 함량 순서는 디클로로 메탄 분획물> 에틸아세테이트 분획물> 에탄올 추출물> 헥산 분획물> 부탄올 분획물> 수용성 분획물 순이었다. 총 폴리페놀과 플라보노이드의 함량 차이에 따른 항산화및 항균 활성과의 유연관계를 살펴보면, 전반적으로 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높게 나타난 에틸아세테이트분획물에서 항산화능 및 항균력 결과가 모두 우수하게 나타났으며, 아울러 추출물 및 순차적 분획물에 함유된 총 페놀성화합물의 함량에 따라서 항산화 활성 및 항균 활성의 차이가 다르게 나타남을 확인할 수 있었다.
- 34%이었다. 에탄올 추출물에 대한 각 순차분획물 중디클로로메탄 분획물 수율이 1.31%로 가장 낮았고, 수용성분획물이 47.91%로 가장 높은 수율을 보였다.
- 등대풀에탄올 추출물과 순차적 분획물에서의총 플라보노이드 함량 순서는 디클로로 메탄 분획물> 에틸아세테이트 분획물> 에탄올 추출물> 헥산 분획물> 부탄올 분획물> 수용성 분획물 순이었다. 총 폴리페놀과 플라보노이드의 함량 차이에 따른 항산화및 항균 활성과의 유연관계를 살펴보면, 전반적으로 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높게 나타난 에틸아세테이트분획물에서 항산화능 및 항균력 결과가 모두 우수하게 나타났으며, 아울러 추출물 및 순차적 분획물에 함유된 총 페놀성화합물의 함량에 따라서 항산화 활성 및 항균 활성의 차이가 다르게 나타남을 확인할 수 있었다. 최근 같은 대극과 식물인 암대극 추출물을 대상으로 한항산화 및 항균 활성 결과 보고⑻에서도 페놀 성화합물의 함량이 높게 나타난 분획물에서 높은 항산화 활성 및 항균 활성을 나타낸다는 연구결과와 마찬가지로 본 실험에서도 등대풀 또한 다른 대극과 식물과 마찬가지로 페놀화합물 함량이 높은 분획물에서 우수한 항산화 활성 및 항균 활성을 갖고있음을 확인할 수 있었다.
- 총 폴리페놀과 플라보노이드의 함량 차이에 따른 항산화및 항균 활성과의 유연관계를 살펴보면, 전반적으로 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량이 높게 나타난 에틸아세테이트분획물에서 항산화능 및 항균력 결과가 모두 우수하게 나타났으며, 아울러 추출물 및 순차적 분획물에 함유된 총 페놀성화합물의 함량에 따라서 항산화 활성 및 항균 활성의 차이가 다르게 나타남을 확인할 수 있었다. 최근 같은 대극과 식물인 암대극 추출물을 대상으로 한항산화 및 항균 활성 결과 보고⑻에서도 페놀 성화합물의 함량이 높게 나타난 분획물에서 높은 항산화 활성 및 항균 활성을 나타낸다는 연구결과와 마찬가지로 본 실험에서도 등대풀 또한 다른 대극과 식물과 마찬가지로 페놀화합물 함량이 높은 분획물에서 우수한 항산화 활성 및 항균 활성을 갖고있음을 확인할 수 있었다.
- DPPH의 free radical 소거활성은 에탄올 추출물 및 순차적 분획물 모두에서 처리농도에 따라 농도 의존적으로 DPPH의 free radical 소거 활성이 증가함을 보였다. 특히 순차적 분획물 중 에틸아세테이트와 부탄올 분획물은 DPPH radical 소거 활성이 대조군인 BHA 등의 항산화제와 비교 시 전혀 뒤떨어지지 않는 활성을 갖고 있으며, 이때의 IC50 값은 각각 5.77 貽/mL 와 18.69 貽/ mL로 나타났다(Table 3). 등대풀에 탄올 추출물 및 순차적분획 물의 xanthine oxidase 저 해 활성 과 superoxide radical 소거활성을 xanthine/xanthine oxidase system에 의해 즉정하였다.
- 76 mg/g으로 에틸아세테이트 분획물> 부탄올 분획물>디클로로메탄 분획물>에탄올 추출물> 수용성 분획물>헥산분획물 순으로 나타났다. 특히 총 폴리페놀 함량이 가장 높게 나타난 에틸아세테이트 분획물은 에탄올 추출물에 비해 약3.3배가량 증가되는 경향을 보였다. 등대 풀 에탄올 추출물과 순차적 분획물별 총 플라보노이드 함량은 에탄올 추출물에서 8.
후속연구
- 그러나 이 내인성 항산화방어체계가 세포 내 산화-환원 균형을 유지하는데 문제가 생길 경우 결과적으로 산화스트레스가 일어나게 되며 이 산화스트레스는 직접적으로 세포 내 거대분자의 손상을 일으키거나 세포손상을 일으키는데 중요한 역할을 한다(38). 따라서 산소 유리기의 자유기를 소거할 수 있는 물질 또한 산화적 손상의 예방에 유용할 것으로 사료된다.
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