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제안 방법
- MAPK 와 IKI3-C1 를 조사하였다. 백두옹은 ERK1/2의 신호전달을 억제하였으나, 다른 MAPKe억제하제 못하였다.
- ERK. [j38, JNK 의 phosphoiylalion 과 IiuBa 을 ECL detection 용액 (Amersham)으로 확인하였다.
- -6, IL-12, TNF-a의 생산 억제는 ERK1/2의 활성을 억제하여 나타나는 결과로 사료된다. in vivo에서 LPS 에 의한 자극에서 백두 옹의 효과를 조사하기 위해 마우스 혈액에서 염증성 인자들을 조사했다. 백두옹을투여한 집단에서 염증성 인자들을 분비하는 것이 현저히 억제 하였음을 확인하였다.
- 간단히 설명하면 지수 성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 1 * 의 밀도로 현탁하였고, 여러가지 농도로 AETD로 처리하였다. 4시간 동안 배양한 뒤 lmg/ml의 농도로 배양하기 위해서 MTT용액을 첨가하고 다시 2시간 동안 배양하였다.
- 하지만 활성화되면 IKB-a가분해되고 NF-KB는 핵으로 이동하여 다양한 cytokine을 생산하게 된다. 따라서 NF-KB의 활성은 IKB-a의 분해에 의존 호}게 되므로 IKB-a를 조사하였다. Figure 4에서 나타난 바와 같이 백두옹이 LPS에의한 IKB-a 분해를 저해하지 못하였다.
- 백두 옹의 세포독성에 관해 알아보기 위하여 대식세포에 백두옹을 농도 의존적으로 처리하여 24 시간후에 세포의 생존률을 측정하였다. Figure 1에 나타난 바와 갇이 백두옹은 0.
- 백두옹 물 추출물은 백두옹 100 忘을 3차 증류수로 2시간 30분 전탕한 후 동결 건조 시켜서 용매를 제거하고 그 얻어진 분말을 농도별로 녹여서 실린지 필터 (02m)로 여과해서 사용했다.
- 백두옹 주줄 물을 마우스 한 그룹에 6마리씩으로마리당 250㎎/㎏과 25㎎/㎏ 두 가지 농도로 존대를이용하여 일주일 동안 매일 경구투여 한뒤 일주일째먹인 후에 치사량의 LPS (25 ㎎/㎏)를 LP. 하였다.
- 백두옹이 항염효과에 미치는 영향을 조사하기위하여 대식세포에서 LPS에 의한 NO 생성에 미치는영향을 조사하였다. 백두옹을 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다. 24시간 후에 NO의 생성을측정한 결과 LPS로 자극한 대조군에 비해 백두옹추출물을 전 처리한 군에서 농도 의존적으로 NO 생성이 감소하고 있음을 알 수 있다.
- 백두옹을 두 가지 농도 (25 mg/ml, 250 mg/ml)로일주일 간 경구투여한 후에, LPS에 의한 염증성 사이토카인의 생성을 혈청에서 조사하였다. 백두옹을일주일동안 경구투여 한 그룹 모두 LPS만 복강주사한 그룹에 비해 TNF-a, IL-6, ILT2의 생산이 현저히 줄어들었다는 것을 보여주었다 (Figure 5).
- LPS 는 NF-KB를 활성화 시켜서 각종 염증성 cytokine을 분비한다. 백두옹이 NF-KB 활성에 미치는 영향을 조사하기위해 백두옹을 전처리하고 LPS로 자극한 대식세포에서 IKB-a의 분해정도를 조사하였다. NF-KW는 지.
- NO는 신경전달 혈관의 이완 및 세포 매개성 면역반응에 관여하는데, 특히 대식세포가 interferon-y (IFN-y) 또는 LPS로 자극될 때 inducible NOS (1NOS)가 발현되어 NO을 생성하게 된다冃e 이렇게 생성된 NO는 염증반응을 매개하는 역할을 하게된다. 백두옹이 항염효과에 미치는 영향을 조사하기위하여 대식세포에서 LPS에 의한 NO 생성에 미치는영향을 조사하였다. 백두옹을 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다.
- 복강에서 추출한 마우스 대식세포를 60mm culture dish에 1 * 로 세포를 배양하고 senim free media (RPMI 1640)으로 12시간 starvation 시킨 후백두옹 (500 mg/ml)으로 30분 전처리 한뒤에 LPS (3)0 ng/ml)로 자극하여 cold PBS로 3회 세척한 후시간별로 (0, 15, 30, 60min) cell을 harvest하여 cell을얻은 뒤 원심분리 (5000RPM, 5min) 하여 그 상층액을 버리고 cell pellet을 수거하였다. lysis buffer Oysis buffer 1ml + phosphotase inhibitor 10ul +protase inhibitor 10nl X 넣어 단백질을 lysis 시켜서 원심분리 (15000RPM, 20mm)하여 찌꺼기를 가라앉히고 단백질 정량하였다.
- 실험 일 전에 실험 mouse에 염증 물질 (thioglucollate 2~ 3ml) 을 i.p. 로 투여하여 RPMI-1640-10%FBS medium을 6~ 7rri를 복강에 투여하여 넣어 5분간 마우스 복강을 마사지 한 뒤 복강액을 뽑아내 원심분리한 후 cell> counting 해서 1 x 10"cells/ml로 60mm Dish나 12well 또는 24weil Plate에 seeding하고 5% CO2 37 "C가 유지되는 incubator에서 3시간 배잉하고, suspension 세포를 버린 후에 부착한 세포를 대식세포로 간주하여 실험하였다.
- 两。에서 염증성 매개 물질 즉 NO, 염증성 사이토카인의 생산을 조사하였다.
- 전염증성 인자들에 다] 한 영향을 조사하기위하여백두옹을 전처리한 후 LPS로 자극하여 ELISA 방법으로 TNI」a, IL-이:LT2를 측정하였다-. 백두옹 추출물이 염증성 세포 활성 물질들 (TNF-a, IL-12, 丄-6)을농도 의존적으로 억제함을 알 수 있었다 (Figure 3).
- 5% 의 나프틸에틸렌아민)은 아질산염과 화학 반응하여보라색의 아조염을 형성하고 이것은 일산화질소의 농도와 일치하기 때문에, 아조염의 농도로부터 아질산염의 농도를 측정하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 즉, 의 그리스 시약을 상기 대조군과 실험군의 샘 플 1내 지 6의 각각에 100 M 씩 을 첨가하고, 그혼합물을 37℃에서 10분간 배양하였다. 그 샘플의 빛의 흡수는 스펙트로포토메터 (MD, USA)로 540nm 에서 측정하였다.
대상 데이터
- C57BL/6 6주령 암컷을 오리엔트바이오에서 구입하여 사용하였다.
- Fetal bovine serum (FBS), RPMIT640, penicillin-streptomycin 등의 세포 배양용 시약들은 Gibco BRL (Grand Island. USA) 시세서 배양조는 Coming (Rochester, USA) 사에서 구입하였다 실험에사용된 시약 중 HEPES, sodium d(xlesyl sulfate (SDS), acrylamide, bisacrylamide, LPS, Tris-HCl 등은 SIGMA (St. Louis, USA) 사에서 구입하였으며, 실험에 사용된 항체인 anti-phospo-ERKl/2, anti-phospo-p38, antiTK-B-a, antrphospo-JNK 는 Cell signaling (MA, USA) 사에서 구입하였다. anti-mouse IL-6, TNF-a, IL-12 antitodies, 재조합 IL~6, TNFJi, ILT2는 R & D Systems (Minneapolis, MN, USA에서 구입했다.
- Louis, USA) 사에서 구입하였으며, 실험에 사용된 항체인 anti-phospo-ERKl/2, anti-phospo-p38, antiTK-B-a, antrphospo-JNK 는 Cell signaling (MA, USA) 사에서 구입하였다. anti-mouse IL-6, TNF-a, IL-12 antitodies, 재조합 IL~6, TNFJi, ILT2는 R & D Systems (Minneapolis, MN, USA에서 구입했다. 실험에 사용된 모든 시약은 분석용 등급 이상으로 사용하였다.
- 실험에 사용한 백두옹은 옴니허브 (경북, 영천)에서 구입하여 물 1L에 100g을 넣고 2시간 동안 전탕한 액을 동결 건조하여 3차 증류수에 녹여서 필터한후 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과에 대한 통계처리는 Student's f-test에준하였고 p-value가 0.05 미만일 경우 유의한 것으로판정하였다.
이론/모형
- 하였다. Pro-inflammatory cytokine의 염증매개물질의 생성에미치는 약물의 효과를 검증하기 위해서 LPS (500 ng/rnl)로 자극한 후 24시간 뒤 이들 염증매개물을 세포 상층액에서 ELISA법으로 정량하였다.
- 대식세포의 생존율은 밀집 세포의 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자주빛 formazan 생성물로 변하는 MTT환원을 바탕으로 M1T분석법으로 측정했다. 간단히 설명하면 지수 성장을 하는 세포들은 RPMI-1640배지에서 1 * 의 밀도로 현탁하였고, 여러가지 농도로 AETD로 처리하였다.
- 그 후 2시간 뒤에 마우스를 마취하여서 심장에서 마우스 혈액을 1ml 실린 지로 뽑아낸 후 2000RWM으로 4'C에서 20분간 원심분리하여 상층액 serum만 분리하였다. 이 분리한 serum을 ELISA법으로 TNF-a, DL-6 와 ILT2를 정량하였다.
- 그 샘플의 빛의 흡수는 스펙트로포토메터 (MD, USA)로 540nm 에서 측정하였다. 일산화질소의 농도는 아질산염의표준커 브로부터 계산하였다.
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