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문제 정의
- 그러나 아교버섯은 이 실험에서 분석한 비스페놀 A의 분해가 거의 확인되지 않았다(22). 본 연구실에서는 기계충버섯의 형질전환 방법을 확립하였으므로(1) 아교버섯의 laccase cDNA를 형질전환 방법으로 기계충버섯에 도입함으로써 분해능이 향상된 형질전환체를 확보하고자 실험을 수행하였다.
제안 방법
- Laccase의 활성은 o-tolidine을 발색기질로 사용하여 분석하였고(9) 효소활성은 이 조건에서 1분당 OD59I) 0.1의 상승을 보이는 효소의 양을 1 unit으로 정하였다. Tiizol 추출 완충액(Invitrogen)을 사용하여 각 형질전환체의 균체로부터 총 RNA를 분리하고, 각 RNA를 대상으로 laccase 유전자 서열에 근거한 PCR 프라이머 (5)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였으며 증폭된 DNA는 전기영동 방법으로 분리하여 분석하였다.
- 1의 상승을 보이는 효소의 양을 1 unit으로 정하였다. Tiizol 추출 완충액(Invitrogen)을 사용하여 각 형질전환체의 균체로부터 총 RNA를 분리하고, 각 RNA를 대상으로 laccase 유전자 서열에 근거한 PCR 프라이머 (5)를 사용하여 RT-PCR을 수행하였으며 증폭된 DNA는 전기영동 방법으로 분리하여 분석하였다.
- 선발된 형질전환체 2개와 야생형 균주를 PDA에서 5일간 배양하여 균체를 얻었고 이를 최소배지 50 .mH에 작게 자른 약 20조각의 균체를 접종하여 3CTC에서 5일간 진탕배양 하였다.
- Laccase 발현 벡터를 기계충버섯에 도입하기 위하여 전통적인 원형질체-Cad? 방법을 사용하였고(1), 형질전환체는 선택표지인 phosphinothricin 저항성으로 선발하였다. 선발된 형질전환체로부터 총 DNA를 분리하고 발현 벡터에 존재하는 trpC 프로모터-phosphinothricin 저항성 유전자(bar) 특이 프라이머(forward primer; 5-GTCGACAGAAGA TGATATTG-3' 및 reverse primer; 5' - AGTTAG AC A ACCTGAAG TCT-3)를 사용하는 PCR을 수행하여 발현벡터의 안정적 유지를 확인하였다.
- 완전배지는 PDA (Potato Dextrose Agar)를 사용하였으며 최소배지는 Leem 등(11)의 배지를 사용하였고 기타 배양은 Yeo 등(22)의 방법을 따랐다. 아교버섯의 laccase cDNA (accession no.: AM282562)를 pBARGPEl의 BamHI 위치에 삽입함으로써 laccase 발현벡터 pBARLACl 을 구축하였다. Laccase 발현 벡터를 기계충버섯에 도입하기 위하여 전통적인 원형질체-Cad? 방법을 사용하였고(1), 형질전환체는 선택표지인 phosphinothricin 저항성으로 선발하였다.
- 6 mm column)를 시용하여 분석하였다. 용출 용매는 acetonitrile과 H2O (9:1, v/v) 혼합용액을 사용하였고, 용출속도는 1.0 ml/min이었으며 BPA 표준 시약을 동일한 조건으로 분석하여 BPA의 농도를 결정하였다.
- 형질전환체들의 배양액 전체를 n-hexane으로 추출하고 이를 다시 ethylacetate로 추출한 후 24, 900xg에서원심분리 하였다. 잔류 BPA를 포함하는 유기용매 층을 회수하고 HPLC (HP 1, 525 series, Gemini 5 |im C6-phenyl 110A 150x4.6 mm column)를 시용하여 분석하였다. 용출 용매는 acetonitrile과 H2O (9:1, v/v) 혼합용액을 사용하였고, 용출속도는 1.
- mH에 작게 자른 약 20조각의 균체를 접종하여 3CTC에서 5일간 진탕배양 하였다. 진탕 배양한 균체 전체를 Waring blender로 갈아 새로운 최소배지 100 ml에 20% (v/v) 되도록 접종하고 비스페놀 A (BPA) 무첨가 배지에 비하여 약 70%의 길이생장을 보이는 농도인 BPA (50 mg/ L)를 더하고 30℃에서 진탕배양 하였다. BPA의 잔류농도는 다음과 같이 분석하였다.
대상 데이터
- 대관령 지역에서 분리한 기계충버섯을 이 실험에 사용하였다 (7). 완전배지는 PDA (Potato Dextrose Agar)를 사용하였으며 최소배지는 Leem 등(11)의 배지를 사용하였고 기타 배양은 Yeo 등(22)의 방법을 따랐다.
- : AM282562)를 pBARGPEl의 BamHI 위치에 삽입함으로써 laccase 발현벡터 pBARLACl 을 구축하였다. Laccase 발현 벡터를 기계충버섯에 도입하기 위하여 전통적인 원형질체-Cad? 방법을 사용하였고(1), 형질전환체는 선택표지인 phosphinothricin 저항성으로 선발하였다. 선발된 형질전환체로부터 총 DNA를 분리하고 발현 벡터에 존재하는 trpC 프로모터-phosphinothricin 저항성 유전자(bar) 특이 프라이머(forward primer; 5-GTCGACAGAAGA TGATATTG-3' 및 reverse primer; 5' - AGTTAG AC A ACCTGAAG TCT-3)를 사용하는 PCR을 수행하여 발현벡터의 안정적 유지를 확인하였다.
- 배양상등액에 진존히는 에스트로겐 활성은 Shizuoka 대학의 Nishida 교수로부터 분양받은 yeast two hybrid system (Y190)을이용하여 분석하였다(8).
이론/모형
- 완전배지는 PDA (Potato Dextrose Agar)를 사용하였으며 최소배지는 Leem 등(11)의 배지를 사용하였고 기타 배양은 Yeo 등(22)의 방법을 따랐다. 아교버섯의 laccase cDNA (accession no.
성능/효과
- BPA를 분해하는 과정에서 laccase의 활성과 발현은 야생형에 비하여 TF4와 TF7에서 모두 높았다(Fig. 2B). 그러나 BPA의 첨가가 없는 경우에도 laccase의 발현이 증가하기 때문에 BPA 첨가 시 나타나는 laccase의 활성 및 발현상승은 BPA에 의하여 유도되는 것이 아니다(Fig.
- 한편 아교버섯은 프탈레이트류에 대한 우수한 분해능에 비하여 BPA의 분해 및 에스트로겐 활성제 거 효율이 매우 저조하지만, 상대적으로 BPA의 분해가 우수하나 laccase 활성이 거의 없는 기계충버섯에 타 버섯균의 laccase 를 도입하고 발현시킴으로써 BPA의 분해능이 더 향상된 형질전환체를 얻을 수 있었다. 결론적으로 laccase 형질전환체들은 생장기에 laccase의 발현 및 활성이 증가되었고, 이는 배양 초기에 BS의 분해는 물론 그 결과 에스트로겐 활성 제거에도 긍정적인 효과를 가져왔다.
- 기계충버섯에 laccase 발현벡터 pBARLACl을 형질전환 방법으로 도입한 결과 약 80개의 형질전환체가 선발되었으며 이 중에서 laccase 활성이 가장 높은 두 개의 균주를 선발하였다. 이들은 PDA에서 야생형에 비하여 발색기질인 o-tolidine과 더 강한 발색을 보였고(Fig.
- Laccase에 매개제인 1 -hydroxybenzotriazole (HBT) 또는 2, 2, -azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate) (ABTS) 를 더하고 17P-estradiol 및 ethinylestradiol과 반응시키면 1시간 후에 80% 이상의 에스트로겐 활성이 감소되며 8시간 후에는 에스트로겐 활성이 완전히 제거된다(20). 본 실험에서 BPA에 의한에스트로겐 활성의 감소가 laccase 활성증가와 평행하게 진행된 결과에 의하여 laccase 활성이 증가된 형질전환체들이 야생형보다 더 효율적으로 BPA 및 그 중간산물이 보이는 에스트로겐 활성을 제거했음을 알 수 있다. 한편 아교버섯은 프탈레이트류에 대한 우수한 분해능에 비하여 BPA의 분해 및 에스트로겐 활성제 거 효율이 매우 저조하지만, 상대적으로 BPA의 분해가 우수하나 laccase 활성이 거의 없는 기계충버섯에 타 버섯균의 laccase 를 도입하고 발현시킴으로써 BPA의 분해능이 더 향상된 형질전환체를 얻을 수 있었다.
- 세 가지 균주(야생형, TF4와 TF7)들에 의한 BPA의 분해를 HPLC로 분석한 결과 모두 배양 24시간에 BPA (50 mg/L)를 95% 이상 분해하였다(Table 1). 형질전환체들에 의한 BPA 분해율이 야생형에 비하여 비록 3% point 정도 우세하지만 상등액에 잔존하는 에스트로겐 활성은 큰 차이를 보였다.
- 한편 백색부후균 Stereum hirsutume\- Heterobasidium insulare는 BPA (100 mg/L) 를 99%까지 제거하는 데에 7~14일이 소요되었다(10). 이러한 결과는 TF4와 TF7이 BPA를 제거하는 것에는 야생형과 비슷하지만 형질전환체들은 BPA 및 이의 분해 중간산물에 대한 분해능이 야생형에 비하여 더 우수하고, 따라서 이들 중산산물이 보이는 에스트로겐 활성의 제거에 더 효율적이었다고 판단된다.
- 본 실험에서 BPA에 의한에스트로겐 활성의 감소가 laccase 활성증가와 평행하게 진행된 결과에 의하여 laccase 활성이 증가된 형질전환체들이 야생형보다 더 효율적으로 BPA 및 그 중간산물이 보이는 에스트로겐 활성을 제거했음을 알 수 있다. 한편 아교버섯은 프탈레이트류에 대한 우수한 분해능에 비하여 BPA의 분해 및 에스트로겐 활성제 거 효율이 매우 저조하지만, 상대적으로 BPA의 분해가 우수하나 laccase 활성이 거의 없는 기계충버섯에 타 버섯균의 laccase 를 도입하고 발현시킴으로써 BPA의 분해능이 더 향상된 형질전환체를 얻을 수 있었다. 결론적으로 laccase 형질전환체들은 생장기에 laccase의 발현 및 활성이 증가되었고, 이는 배양 초기에 BS의 분해는 물론 그 결과 에스트로겐 활성 제거에도 긍정적인 효과를 가져왔다.
- 이상 분해하였다(Table 1). 형질전환체들에 의한 BPA 분해율이 야생형에 비하여 비록 3% point 정도 우세하지만 상등액에 잔존하는 에스트로겐 활성은 큰 차이를 보였다. TF4와 TF7의 배양 상등액에 잔존하는 에스트로겐 활성은 배양 1일째 야생형보다 더 낮으며, 배양 2일째에는 야생형에 비하여 5배 이상 에스트로겐 활성의 제거율을 보였다(Fig.
- 이렇게 배양 초기에 laccase 활성이 높은 균주는 질소성분이 낮은 배지에서 배양 7일째 리그닌 분해효소의 활성이 나타나는 것(19)과 비교할 때 난분해성 물질분해를 배양 초기부터 시작할 수 있기 때문에 긍정적인 효과라고 판단된다. 형질전환체에 pBARLACl의 안정적인 유지를 확인하기 위하여 ftpC/bar 유전자 특이 프라이머를 사용한 PCR을 수행한 결과 예상되는 DNA 조각(1.4 kb)이 오직 형질전환체 (TF4와 TF7)의 염색체로부터 증폭되었다(Fig. 1C). 이 형질전환체들은 유전적으로 매우 안정되어 비선택배지에서 10회 이상 계대 배양한 후에도 선택표지 및 laccase 유전자가 유지되었다.
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