할미꽃의 정단 분열조직배양에 의한 기내 효율적 미세번식에 미치는 식물생장조절물질의 효과를 조사하기 위해 2,4-D, NAA, kinetin, TDZ와 BA를 혼용처리한 MS배지에 정단분열조직을 배양하였다. 배지내 2,4-D와 kinetin, 2,4-D와 TDZ, NAA와 TDZ 혼용처리는 캘러스 유도에 효과적이지 못하였으나 NAA와 BA가 혼용 처리되었을 때 배발생적 또는 기관분화성 캘러스가 유도되었다. 특히 0.5mg/L NAA와 1.0mg/L BA 혼용처리된 MS 배지에서는 캘러스로부터 고빈도로(62%) 신초가 형성되어 캘러스 유도 및 신초형성에 적합하였다. 적합배지에 10% coconut water를 첨가하여 30일마다 계대배양 하므로 캘러스 증식률, 신초 분화율 및 신초 신장이 현저히 증가되었는데, 그 결과 절편체 당 평균 12.9개의 shoot bud를 분리할 수 있었다. 할미꽃 기내 유도된 식물체에서 뿌리는 쉽게 분화되지 못하였으나 9.0mg/L NAA 단용 또는 0.5mg/L NAA와 1.0mg/L BA 혼용처리된 MS배지에서 캘러스를 통해서만 분화되었다. 이들 뿌리는 동일 배지에서 캘러스유도 및 식물체 분화를 반복적으로 실시하는 시원체가 되기도 하였다.
할미꽃의 정단 분열조직배양에 의한 기내 효율적 미세번식에 미치는 식물생장조절물질의 효과를 조사하기 위해 2,4-D, NAA, kinetin, TDZ와 BA를 혼용처리한 MS배지에 정단분열조직을 배양하였다. 배지내 2,4-D와 kinetin, 2,4-D와 TDZ, NAA와 TDZ 혼용처리는 캘러스 유도에 효과적이지 못하였으나 NAA와 BA가 혼용 처리되었을 때 배발생적 또는 기관분화성 캘러스가 유도되었다. 특히 0.5mg/L NAA와 1.0mg/L BA 혼용처리된 MS 배지에서는 캘러스로부터 고빈도로(62%) 신초가 형성되어 캘러스 유도 및 신초형성에 적합하였다. 적합배지에 10% coconut water를 첨가하여 30일마다 계대배양 하므로 캘러스 증식률, 신초 분화율 및 신초 신장이 현저히 증가되었는데, 그 결과 절편체 당 평균 12.9개의 shoot bud를 분리할 수 있었다. 할미꽃 기내 유도된 식물체에서 뿌리는 쉽게 분화되지 못하였으나 9.0mg/L NAA 단용 또는 0.5mg/L NAA와 1.0mg/L BA 혼용처리된 MS배지에서 캘러스를 통해서만 분화되었다. 이들 뿌리는 동일 배지에서 캘러스유도 및 식물체 분화를 반복적으로 실시하는 시원체가 되기도 하였다.
In order to investigate the effect of plant growth regulators on effective in vitro micropropagation, apical meristems of Pulsatilla cernua var. koreana were cultured on Murashige and Skoog's (MS) medium with 2,4-D, NAA, TDZ and BA. Media containing 2,4-D and kinetin, 2,4-D and TDZ, NAA and TDZ were...
In order to investigate the effect of plant growth regulators on effective in vitro micropropagation, apical meristems of Pulsatilla cernua var. koreana were cultured on Murashige and Skoog's (MS) medium with 2,4-D, NAA, TDZ and BA. Media containing 2,4-D and kinetin, 2,4-D and TDZ, NAA and TDZ were not effective on callus induction. However, embryogenic or organogenic callus was obtained on media containing NAA and BA. Especially, on MS medium with 0.5mg/L NAA and 1.0mg/L BA was optimal for a high frequency (62%) of shoot or shoot bud obtained from callus. Callus proliferation, shoot multiplication and elongation were significantly increased by adding 10% coconut water on MS media with 0.5mg/L NAA and 1.0mg/L BA. Repeated subculturing of in vitro grown shoots resulted in propagation rate of 12.9 shoots per explant every 30 days. Root formation from the adventitious shoots was not easily achieved. However, roots were only produced through callus on MS medium with 2.0mg/L NAA alone or 0.5mg/L NAA and 1.0mg/L BA. These roots were used materials for callus and shoot production repetitively.
In order to investigate the effect of plant growth regulators on effective in vitro micropropagation, apical meristems of Pulsatilla cernua var. koreana were cultured on Murashige and Skoog's (MS) medium with 2,4-D, NAA, TDZ and BA. Media containing 2,4-D and kinetin, 2,4-D and TDZ, NAA and TDZ were not effective on callus induction. However, embryogenic or organogenic callus was obtained on media containing NAA and BA. Especially, on MS medium with 0.5mg/L NAA and 1.0mg/L BA was optimal for a high frequency (62%) of shoot or shoot bud obtained from callus. Callus proliferation, shoot multiplication and elongation were significantly increased by adding 10% coconut water on MS media with 0.5mg/L NAA and 1.0mg/L BA. Repeated subculturing of in vitro grown shoots resulted in propagation rate of 12.9 shoots per explant every 30 days. Root formation from the adventitious shoots was not easily achieved. However, roots were only produced through callus on MS medium with 2.0mg/L NAA alone or 0.5mg/L NAA and 1.0mg/L BA. These roots were used materials for callus and shoot production repetitively.
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문제 정의
따라서 본 연구는 할미꽃 유전자원유지 및 확보를 위해정단분열조직을 배양함으로 효율적 기내번식 체계를 확립 코자 실시 되었다.
제안 방법
MS(Murashige and Skoog, 1962) 기본 배지에 식물 생장조절물질을 첨가하지 않거나, 2, 4-D와 kinetin, NAA 와 BA, NAA와 TDZ를 동일 수준(0.5-2.0 mg/L)으로 처리하여 캘러스 및 shoot를 유도하였고, 캘러스 및 식물체 재분화에 효과적이었던 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L BA 배지에 10% 및 20% coconut water를 첨가하여 정단 분열조직 유래 형성된 캘러스 및 shoot 형성에 미치는 coconut water 효과를 조사하였다.
기내에서 형성된 할미꽃shoot를 2, 4-D, NAA 및 IBA 를 각각 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 및 5.0 mg/L 단용 처리하거나 캘러스 유도에 효과적이었던 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L BA 혼용 처리된 MS배지에 180일간 계대 배양한 후 뿌리 분화를 조사하였다. 할미꽃의 shoot를 2, 4-D, NAA 및 IBA 단용 배지에 계대 배양 한 결과 shoot로부터 직접 뿌리는 분화되지 않았고 초기 배양에서와 같이 2, 4-D 처리 구에서는 담황색 점액성 캘러스가, NAA 및 IBA 처리구에서는 희고 단단하면서 부스러지기 쉬운 캘러스가 형성된 후 캘러스를 통해 뿌리가 분화되었다.
배양 30, 60, 90일 후정단분열조직 유래 캘러스를 2개씩 선발하여 tert-Butyl Alcoh이에 고정, 상법에 따라 파라핀으로 포매한 후 shoot 분화현상을 현미경 하에서 검경하였다.
배지 내 첨가한 식물생장 조절물질의 종류와 관계없이 모든 치상한 절편은 배양 1주일 후부터 팽대와 캘러스를 형성하기 시작하였으나 배양 3주 경부터 팽대된 절편 및 증식된 캘러스는 배지 내 첨가된 식물생장 조절물질의 종류에 따라 육안으로 구별이 가능한 상태로 변화하였다. 즉 배지내 D 2, 4- 와 kinetin, 2, 4-D와 TDZ 처리구에서는 처리농도에 관계없이 황색, 또는 회색빛을 띈 흰색의 점액성 캘러스가 형성되었으며 0.
엽원기를 1-2 매 부착한 할미꽃의 정단 분열 조직을 MS 배지에 2, 4-D와 kinetin, 2, 4-D와 TDZ, NAA와 BA, NAA 와 TDZ를 각각 0.5, 1.0, 2.0 mg/L 수준으로 혼용 처리한 후 90일간 배양한 결과는 Fig. 1과 같다.
엽원기를 3-4매 붙여 채취된 정단분열 조직을 70% 에탄올에 30초간 침지하고 7% calcium hypochlorite 수용액에 10분간 소독과 멸균수로 4-5회 수세한 다음 현미경 하에서 정단분열 조직과 1-2 매 엽원기를 붙여 절취한 후 배양 배지에 치싱하였으며 22 ± TC와 50 umol-m-2-s-1, 16/8h 광주기로 조절한 생장상에서 배양하였다.
치상 후 10일 간격으로 정단분열 조직 유래 캘러스와 shoot 를 육안으로 관찰하였고 배양 90-120일경에는 캘러스로부터 shoot 재분화수를 조사하였다. 한편, 분화된 shoot에서 뿌리분화를 유도하기 위해 MS 배지에 2, 4-D, NAA 및 IBA를 농도별(0, 0.
캘러스 증식 및 shoot 생장에 미치는 coconut water의 효과를 조사하기 위해 할미꽃정단 분열 조직유래 캘러스 형성에 효과적이었던 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L BA가 혼용 처리된 MS 배지에 10%, 20% coconut water를 첨가하였다(Fig. 2).
shoot 재분화수를 조사하였다. 한편, 분화된 shoot에서 뿌리분화를 유도하기 위해 MS 배지에 2, 4-D, NAA 및 IBA를 농도별(0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 mg/L) 단용또는 BA와 혼용처리한 후 뿌리 분화에 미치는 생장조절물질 효과를 조사 하였다.
할미꽃의 정단 분열조직 배양에 의한 기내 효율적 미세번식에 미치는 식물생장 조절물질의 효과를 조사하기 위해 2.4- D, NAA, kinetin, TDZ와 BA를 혼용 처리한 MS 배지에 정단분열 조직을 배양하였다. 배지 내 2, 4-D와 kinetin, 2.
대상 데이터
전북 무주지역에 자생하고 있는 할미꽃을 분양받아 화분에 옮겨본 대학 온실에서 재배관리하였으며 순화 1주일 후부터 정단분열 조직을 배양 재료로 이용하였다 .
성능/효과
0 mg/L 이상 고농도 배지에서는 shoot로부터 캘러스 증식은 물론 계대 배양된 shoot도 갈변, 고사하여 뿌리 분화에 부적합하였다. 2.0 mg/L NAA 처리구에서는 담황색의 캘러스를 통해 담갈색의 굵은 뿌리가 다수 발생되어 본 실험의 오옥신 단용처리 가운데 가장 효과적이었다. 그러나 할미꽃 캘러스 유도 및 shoot 분화에 효과적이었던 0.
1A). 30일 간격으로 callus를 동일 배지에 계대 배양한 결과 배양 60일 경에는 증식된 캘러스에서 단단한 돌기 및 shoot 원기가 형성되기 시작하였고 (Photo. 1B), 이들 돌기는 배양 90 일경에는 치상한 절편의 62%가 육안으로도 구분되는 shoot 또는 shoot bud로 분화되었다 (Photo. 1C).
2A). Coconut water 첨가로 캘러스로부터 multiple shoot 및 shoot bud 분화가 현저하게 빨랐으며 배양 60일경에는 shoot 길이가 0.5-1.0 cm 크기로신장되어 기내 생장이 왕성하여 10% coconut water는 할미꽃 배양시 식물체증식에 효과적인 첨가물질로 생각되었다.
유지하여 증식효과가 있었다. Coconut water가 첨가되지 않은 대조구에서 개체당 평균 5.2개의 shoot bud를 분리할 수 있었고, 10% coconut water 첨가시 평균 12.9개 (Photo. 2B), 20% coconut water 첨가는 7.2개로 10% coconut water는 절편 당부정 신초 증식에 탁월한 효과가 있었다. 또한 10% coconut water 첨가 시 shoot 길이가 대조구에 비해 0.
그러나 NAA와 BA 모든 처리구에서는 배양 초기부터 담녹색 및 담황색의 팽대한 치상절편에서 단단하고 부스러지기 쉬운 배 발생적 캘러스가 형성되었고 이어서 shoot 가 분화되어 본 실험 중 할미꽃정단유래 캘러스유도에 적합하였다. 특히 0.
, 2006). 그러나 본 실험에서 분리된 shoot에서 직접 뿌리가 분화되지는 않았으며 캘러스를 통해서만 뿌리가 분화되었는데 2, 4-D, IBA 및 NAA 단용 처리 시 2.0 mg/L NAA가 뿌리 분화에 적합하였으나 0.5 mg/L NAA 와 1.0 mg/L BA와 혼용처리 시 형성된 캘러스에서 배양 130여일이 경과된 후 굵고 담갈색의 뿌리가 다수 분화되어가장 효과적이었다. 이들 shoot와 뿌리가 동시에 분화된 개체를 동일 배지에 배양함으로써 multiple shoot와 더불어 다량의 뿌리를 획득할 수 있었다.
0 mg/L NAA 처리구에서는 담황색의 캘러스를 통해 담갈색의 굵은 뿌리가 다수 발생되어 본 실험의 오옥신 단용처리 가운데 가장 효과적이었다. 그러나 할미꽃 캘러스 유도 및 shoot 분화에 효과적이었던 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L BA 혼용처리 배지에 지속적으로 계대 배양 하였던 식물체 가운데 배양 180일이 경과되었을 때 전체 식물체의 20-23%가 캘러스를 통해 희고 굵은 뿌리가 형성되어 캘러스유도 및 shoot 분화에 적합하였던 배지가 뿌리 분화에도 가장 효과적이었다(Photo. 2C). 이들 뿌리에서 캘러스와 shoot가 반복적으로 형성되기도 하였으며(Photo.
또한, 배양 30일부터 60일 사이에 형성된 캘러스 양을 비교하였을 때 대조구는 치상체당 180-200 mg 정도였으나 10%-20% coconut water 첨가구에서는 절편당 평균 400-500 mg정도로 증식되었으며, 특히 10% coconut water 첨가구에서 형성된 캘러스가 거듭되는 계대 배양에도 활력을 유지하여 증식효과가 있었다. Coconut water가 첨가되지 않은 대조구에서 개체당 평균 5.
또한 할미꽃의 조직배양에서 절편체의 부위에 따라 형성된 캘러스는공통적으로 페놀성 물질이 배출되기 때문에 적당한 기간을 두고 계대 배양을 해주어야 캘러스가 생존할 수 있었다. 이런 번거로움을 줄이기 위해 배지 내 형성된 캘러스를 2.0 mg/L PVP와 1.0 mg/L BA를 혼용 처리하여 페놀성물질의 제거 효과를 가져왔다고 하였는데(Yoon et al., 2006)본 실험에서는 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L BA 혼용 처리 배지에 coconut water를 0, 10% 및 20% 첨가하여 캘러스의 증식력과 분화된 식물체의 신장 등 생육을 조사한 결과 무처리에서 발생된 캘러스(25%)에 비해 10%, 20% coconut water를 첨가하였을 때 각각 65%, 50%의 캘러스 발생율을 나타내 탁월한 효과가 인정되었으며 또한 캘러스에서 식물체 분화에도 영향을 미쳐 20% coconut water 처리는 무처리구에서 치상 체 당 평균 5.2개의 shoot가 분화된 것과 비교한 결과 1.4배 이상증수 효과가 있었고 10% coconut water 처 리 시에는 치상체당 평균 12.9개 shoot가 분화되어 거의 2.5 배의 증수 효과가 인정되었다. 한편, 캘러스를 30일간의 배양 기간을 두고 계대 배양하므로 페놀성물질이 배지 내에 잠재할 수 있어 캘러스 증식이나 shoot 분화에 영향을 주었는데 coconut water를 처리하므로 캘러스 증식력이 빨라 무처리구에 비해 계대 배양 기간이 대폭 단축됨으로써 배지 내 페놀성물질이 잔존할 수 없도록 하는 효과를 가져올 뿐만 아니라 shoot 또는 shoot bud의 신장에도 탁월한 효과가 있어 배지 내 coconut water 첨가는 유용한 첨가제로 생각된다.
적합배지에 10% coconut water를 첨가하여 30일마다 계대배양 하므로 캘러스 증식률, 신초분화율 및 신초 신장이 현저히 증가되었는데, 그 결과 절편체당 평균 12.9개의 shoot bud를 분리할 수 있었다. 할미꽃 기내 유도된 식물체에서 뿌리는 쉽게 분화되지 못하였으나 2.
육안으로 구별이 가능한 상태로 변화하였다. 즉 배지내 D 2, 4- 와 kinetin, 2, 4-D와 TDZ 처리구에서는 처리농도에 관계없이 황색, 또는 회색빛을 띈 흰색의 점액성 캘러스가 형성되었으며 0.5 mg/L 2, 4-D와 1.0 mg/L kinetin 혼용처리 구에서는 총치상체의 10%에서 점액성 캘러스가 형성되어 2, 4-D와 kinetin 처리에서는 가장 양호한 반응을 보였다. 한편, 2, 4-D와 TDZ 혼용 처리 시치상한 절편에서 캘러스 형성은 10% 이하의 수준으로 발생되었으며 특히 2D , 4- 와 kinetin 그리고 2, 4-D와 TDZ가 각각 2.
초기 배양 30일 경 캘러스 분화율을 조사한 결과 coconut water 첨가시대 조구(25%)에 비해 캘러스 분화가 양호하였는데 10%, 20% coconut water를 배지에 첨가한 경우 캘러스 분화율은 각각 65%, 50%로서 세처리 중 10% coconut water가 캘러스 분화에 가장 효과적이었다.
특히 0.5, 1.0 및 2.0 mg/L 씩 각각 NAA와 BA를 혼용처리 하였을 경우 (Fig. 1), 대체적으로 초기 캘러스 형성이나 shoot 분화에 별로 차이가 없었으나 배양기간이 경과함에 따라 캘러스에 변화가 일어나기 시작하였는데 0.5 mg/L 및 2.0 mg/L BA 처리구에서 일부 캘러스는 배양 35일 경부터 활력이 없는 갈 색 캘러스로 변하여 증식이 감소되었고 동일 배지에 30일 간격으로 2회계대배양 하였을 때는치상한 절편의 23% 및 12%만이 생존할 수 있었다. 그러나 0.
0 mg/L kinetin 혼용처리 구에서는 총치상체의 10%에서 점액성 캘러스가 형성되어 2, 4-D와 kinetin 처리에서는 가장 양호한 반응을 보였다. 한편, 2, 4-D와 TDZ 혼용 처리 시치상한 절편에서 캘러스 형성은 10% 이하의 수준으로 발생되었으며 특히 2D , 4- 와 kinetin 그리고 2, 4-D와 TDZ가 각각 2.0 mg/L 씩 혼용 처리된 곳에서 치상한 절편은 2-3% 수준으로 반응을 보여 본 실험에 사용된 식물생장 조절제로서 부적합하였다. 그러나 0.
후속연구
또한 할미꽃의 기내 뿌리 분화는 다른 식물에 비해 용이하지 않아 복잡한 계대배양 과정을 통해서 이루어지고 있음이 윤 등(2006)에 의한 보고에서도 알 수 있었다. 따라서 완전한 식물체를 생산하기 위해 기내 뿌리 분화에 대한 적합한 배지 및 식물 생장조절물질에 대한 연구가 필요하다고 생각된다.
참고문헌 (9)
Jung, S.J., J.H. Jeong, E.S. Yoon and Y.E Choi. 2007. Plant regeneration from callus and adventitious root segments of Pulsatilla koreanaNakai. J. Plant Biotechnol 34(2):153-159
Ko, J.A. andH.S. Kim. 2006.Microspore-derived embryogenesis and plant regeneration from anther culture of Pusatilla cernua var. koreana. Kor. J.Hort. Sci. Technol 24(2):290-295
Lee, W.K., H.W. Choi and J.W. Bang. 2004. Karyotype analysis of five species of genus Pusatilla. Korean J. Medicinal Crop Sci.12(6)490-493
Sang, C.K., E.H. Kim and H.Y.Kim. 1993. Germination and life span of Pusatilla cernua var. koreana seeds. Kor. J. Plant Tiss. Cult. 23(6):349-354
Sang, C.K., B.J. Choi and J.C. Koh. 1996. Effect of storage humidity and temperature on seed germination of pasque flower(Pusatilla cernua var. koreana). J. Kor. Soc. Hort.Sci. 37(3):447-450
Ye, W.C., B.X. Ou., N.N. Ji., S.X. Zaho., T. Ye., M.A. Mckervey and P. Stevenson. 1995. Patensin, a saponin from Pulsatilla patens var. multifida. Phytochemistry 39:937-939
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