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문제 정의
- 따라서 본 연구는 할미꽃 유전자원유지 및 확보를 위해정단분열조직을 배양함으로 효율적 기내번식 체계를 확립 코자 실시 되었다.
제안 방법
- MS(Murashige and Skoog, 1962) 기본 배지에 식물 생장조절물질을 첨가하지 않거나, 2, 4-D와 kinetin, NAA 와 BA, NAA와 TDZ를 동일 수준(0.5-2.0 mg/L)으로 처리하여 캘러스 및 shoot를 유도하였고, 캘러스 및 식물체 재분화에 효과적이었던 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L BA 배지에 10% 및 20% coconut water를 첨가하여 정단 분열조직 유래 형성된 캘러스 및 shoot 형성에 미치는 coconut water 효과를 조사하였다.
- 기내에서 형성된 할미꽃shoot를 2, 4-D, NAA 및 IBA 를 각각 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0 및 5.0 mg/L 단용 처리하거나 캘러스 유도에 효과적이었던 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L BA 혼용 처리된 MS배지에 180일간 계대 배양한 후 뿌리 분화를 조사하였다. 할미꽃의 shoot를 2, 4-D, NAA 및 IBA 단용 배지에 계대 배양 한 결과 shoot로부터 직접 뿌리는 분화되지 않았고 초기 배양에서와 같이 2, 4-D 처리 구에서는 담황색 점액성 캘러스가, NAA 및 IBA 처리구에서는 희고 단단하면서 부스러지기 쉬운 캘러스가 형성된 후 캘러스를 통해 뿌리가 분화되었다.
- 배양 30, 60, 90일 후정단분열조직 유래 캘러스를 2개씩 선발하여 tert-Butyl Alcoh이에 고정, 상법에 따라 파라핀으로 포매한 후 shoot 분화현상을 현미경 하에서 검경하였다.
- 배지 내 첨가한 식물생장 조절물질의 종류와 관계없이 모든 치상한 절편은 배양 1주일 후부터 팽대와 캘러스를 형성하기 시작하였으나 배양 3주 경부터 팽대된 절편 및 증식된 캘러스는 배지 내 첨가된 식물생장 조절물질의 종류에 따라 육안으로 구별이 가능한 상태로 변화하였다. 즉 배지내 D 2, 4- 와 kinetin, 2, 4-D와 TDZ 처리구에서는 처리농도에 관계없이 황색, 또는 회색빛을 띈 흰색의 점액성 캘러스가 형성되었으며 0.
- 엽원기를 1-2 매 부착한 할미꽃의 정단 분열 조직을 MS 배지에 2, 4-D와 kinetin, 2, 4-D와 TDZ, NAA와 BA, NAA 와 TDZ를 각각 0.5, 1.0, 2.0 mg/L 수준으로 혼용 처리한 후 90일간 배양한 결과는 Fig. 1과 같다.
- 엽원기를 3-4매 붙여 채취된 정단분열 조직을 70% 에탄올에 30초간 침지하고 7% calcium hypochlorite 수용액에 10분간 소독과 멸균수로 4-5회 수세한 다음 현미경 하에서 정단분열 조직과 1-2 매 엽원기를 붙여 절취한 후 배양 배지에 치싱하였으며 22 ± TC와 50 umol-m-2-s-1, 16/8h 광주기로 조절한 생장상에서 배양하였다.
- 치상 후 10일 간격으로 정단분열 조직 유래 캘러스와 shoot 를 육안으로 관찰하였고 배양 90-120일경에는 캘러스로부터 shoot 재분화수를 조사하였다. 한편, 분화된 shoot에서 뿌리분화를 유도하기 위해 MS 배지에 2, 4-D, NAA 및 IBA를 농도별(0, 0.
- 캘러스 증식 및 shoot 생장에 미치는 coconut water의 효과를 조사하기 위해 할미꽃정단 분열 조직유래 캘러스 형성에 효과적이었던 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L BA가 혼용 처리된 MS 배지에 10%, 20% coconut water를 첨가하였다(Fig. 2).
- shoot 재분화수를 조사하였다. 한편, 분화된 shoot에서 뿌리분화를 유도하기 위해 MS 배지에 2, 4-D, NAA 및 IBA를 농도별(0, 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0 mg/L) 단용또는 BA와 혼용처리한 후 뿌리 분화에 미치는 생장조절물질 효과를 조사 하였다.
- 할미꽃의 정단 분열조직 배양에 의한 기내 효율적 미세번식에 미치는 식물생장 조절물질의 효과를 조사하기 위해 2.4- D, NAA, kinetin, TDZ와 BA를 혼용 처리한 MS 배지에 정단분열 조직을 배양하였다. 배지 내 2, 4-D와 kinetin, 2.
대상 데이터
- 전북 무주지역에 자생하고 있는 할미꽃을 분양받아 화분에 옮겨본 대학 온실에서 재배관리하였으며 순화 1주일 후부터 정단분열 조직을 배양 재료로 이용하였다 .
성능/효과
- 0 mg/L 이상 고농도 배지에서는 shoot로부터 캘러스 증식은 물론 계대 배양된 shoot도 갈변, 고사하여 뿌리 분화에 부적합하였다. 2.0 mg/L NAA 처리구에서는 담황색의 캘러스를 통해 담갈색의 굵은 뿌리가 다수 발생되어 본 실험의 오옥신 단용처리 가운데 가장 효과적이었다. 그러나 할미꽃 캘러스 유도 및 shoot 분화에 효과적이었던 0.
- 1A). 30일 간격으로 callus를 동일 배지에 계대 배양한 결과 배양 60일 경에는 증식된 캘러스에서 단단한 돌기 및 shoot 원기가 형성되기 시작하였고 (Photo. 1B), 이들 돌기는 배양 90 일경에는 치상한 절편의 62%가 육안으로도 구분되는 shoot 또는 shoot bud로 분화되었다 (Photo. 1C).
- 2A). Coconut water 첨가로 캘러스로부터 multiple shoot 및 shoot bud 분화가 현저하게 빨랐으며 배양 60일경에는 shoot 길이가 0.5-1.0 cm 크기로신장되어 기내 생장이 왕성하여 10% coconut water는 할미꽃 배양시 식물체증식에 효과적인 첨가물질로 생각되었다.
- 유지하여 증식효과가 있었다. Coconut water가 첨가되지 않은 대조구에서 개체당 평균 5.2개의 shoot bud를 분리할 수 있었고, 10% coconut water 첨가시 평균 12.9개 (Photo. 2B), 20% coconut water 첨가는 7.2개로 10% coconut water는 절편 당부정 신초 증식에 탁월한 효과가 있었다. 또한 10% coconut water 첨가 시 shoot 길이가 대조구에 비해 0.
- 그러나 NAA와 BA 모든 처리구에서는 배양 초기부터 담녹색 및 담황색의 팽대한 치상절편에서 단단하고 부스러지기 쉬운 배 발생적 캘러스가 형성되었고 이어서 shoot 가 분화되어 본 실험 중 할미꽃정단유래 캘러스유도에 적합하였다. 특히 0.
- , 2006). 그러나 본 실험에서 분리된 shoot에서 직접 뿌리가 분화되지는 않았으며 캘러스를 통해서만 뿌리가 분화되었는데 2, 4-D, IBA 및 NAA 단용 처리 시 2.0 mg/L NAA가 뿌리 분화에 적합하였으나 0.5 mg/L NAA 와 1.0 mg/L BA와 혼용처리 시 형성된 캘러스에서 배양 130여일이 경과된 후 굵고 담갈색의 뿌리가 다수 분화되어가장 효과적이었다. 이들 shoot와 뿌리가 동시에 분화된 개체를 동일 배지에 배양함으로써 multiple shoot와 더불어 다량의 뿌리를 획득할 수 있었다.
- 0 mg/L NAA 처리구에서는 담황색의 캘러스를 통해 담갈색의 굵은 뿌리가 다수 발생되어 본 실험의 오옥신 단용처리 가운데 가장 효과적이었다. 그러나 할미꽃 캘러스 유도 및 shoot 분화에 효과적이었던 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L BA 혼용처리 배지에 지속적으로 계대 배양 하였던 식물체 가운데 배양 180일이 경과되었을 때 전체 식물체의 20-23%가 캘러스를 통해 희고 굵은 뿌리가 형성되어 캘러스유도 및 shoot 분화에 적합하였던 배지가 뿌리 분화에도 가장 효과적이었다(Photo. 2C). 이들 뿌리에서 캘러스와 shoot가 반복적으로 형성되기도 하였으며(Photo.
- 또한, 배양 30일부터 60일 사이에 형성된 캘러스 양을 비교하였을 때 대조구는 치상체당 180-200 mg 정도였으나 10%-20% coconut water 첨가구에서는 절편당 평균 400-500 mg정도로 증식되었으며, 특히 10% coconut water 첨가구에서 형성된 캘러스가 거듭되는 계대 배양에도 활력을 유지하여 증식효과가 있었다. Coconut water가 첨가되지 않은 대조구에서 개체당 평균 5.
- 또한 할미꽃의 조직배양에서 절편체의 부위에 따라 형성된 캘러스는공통적으로 페놀성 물질이 배출되기 때문에 적당한 기간을 두고 계대 배양을 해주어야 캘러스가 생존할 수 있었다. 이런 번거로움을 줄이기 위해 배지 내 형성된 캘러스를 2.0 mg/L PVP와 1.0 mg/L BA를 혼용 처리하여 페놀성물질의 제거 효과를 가져왔다고 하였는데(Yoon et al., 2006)본 실험에서는 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L BA 혼용 처리 배지에 coconut water를 0, 10% 및 20% 첨가하여 캘러스의 증식력과 분화된 식물체의 신장 등 생육을 조사한 결과 무처리에서 발생된 캘러스(25%)에 비해 10%, 20% coconut water를 첨가하였을 때 각각 65%, 50%의 캘러스 발생율을 나타내 탁월한 효과가 인정되었으며 또한 캘러스에서 식물체 분화에도 영향을 미쳐 20% coconut water 처리는 무처리구에서 치상 체 당 평균 5.2개의 shoot가 분화된 것과 비교한 결과 1.4배 이상증수 효과가 있었고 10% coconut water 처 리 시에는 치상체당 평균 12.9개 shoot가 분화되어 거의 2.5 배의 증수 효과가 인정되었다. 한편, 캘러스를 30일간의 배양 기간을 두고 계대 배양하므로 페놀성물질이 배지 내에 잠재할 수 있어 캘러스 증식이나 shoot 분화에 영향을 주었는데 coconut water를 처리하므로 캘러스 증식력이 빨라 무처리구에 비해 계대 배양 기간이 대폭 단축됨으로써 배지 내 페놀성물질이 잔존할 수 없도록 하는 효과를 가져올 뿐만 아니라 shoot 또는 shoot bud의 신장에도 탁월한 효과가 있어 배지 내 coconut water 첨가는 유용한 첨가제로 생각된다.
- 적합배지에 10% coconut water를 첨가하여 30일마다 계대배양 하므로 캘러스 증식률, 신초분화율 및 신초 신장이 현저히 증가되었는데, 그 결과 절편체당 평균 12.9개의 shoot bud를 분리할 수 있었다. 할미꽃 기내 유도된 식물체에서 뿌리는 쉽게 분화되지 못하였으나 2.
- 육안으로 구별이 가능한 상태로 변화하였다. 즉 배지내 D 2, 4- 와 kinetin, 2, 4-D와 TDZ 처리구에서는 처리농도에 관계없이 황색, 또는 회색빛을 띈 흰색의 점액성 캘러스가 형성되었으며 0.5 mg/L 2, 4-D와 1.0 mg/L kinetin 혼용처리 구에서는 총치상체의 10%에서 점액성 캘러스가 형성되어 2, 4-D와 kinetin 처리에서는 가장 양호한 반응을 보였다. 한편, 2, 4-D와 TDZ 혼용 처리 시치상한 절편에서 캘러스 형성은 10% 이하의 수준으로 발생되었으며 특히 2D , 4- 와 kinetin 그리고 2, 4-D와 TDZ가 각각 2.
- 초기 배양 30일 경 캘러스 분화율을 조사한 결과 coconut water 첨가시대 조구(25%)에 비해 캘러스 분화가 양호하였는데 10%, 20% coconut water를 배지에 첨가한 경우 캘러스 분화율은 각각 65%, 50%로서 세처리 중 10% coconut water가 캘러스 분화에 가장 효과적이었다.
- 특히 0.5, 1.0 및 2.0 mg/L 씩 각각 NAA와 BA를 혼용처리 하였을 경우 (Fig. 1), 대체적으로 초기 캘러스 형성이나 shoot 분화에 별로 차이가 없었으나 배양기간이 경과함에 따라 캘러스에 변화가 일어나기 시작하였는데 0.5 mg/L 및 2.0 mg/L BA 처리구에서 일부 캘러스는 배양 35일 경부터 활력이 없는 갈 색 캘러스로 변하여 증식이 감소되었고 동일 배지에 30일 간격으로 2회계대배양 하였을 때는치상한 절편의 23% 및 12%만이 생존할 수 있었다. 그러나 0.
- 0 mg/L kinetin 혼용처리 구에서는 총치상체의 10%에서 점액성 캘러스가 형성되어 2, 4-D와 kinetin 처리에서는 가장 양호한 반응을 보였다. 한편, 2, 4-D와 TDZ 혼용 처리 시치상한 절편에서 캘러스 형성은 10% 이하의 수준으로 발생되었으며 특히 2D , 4- 와 kinetin 그리고 2, 4-D와 TDZ가 각각 2.0 mg/L 씩 혼용 처리된 곳에서 치상한 절편은 2-3% 수준으로 반응을 보여 본 실험에 사용된 식물생장 조절제로서 부적합하였다. 그러나 0.
후속연구
- 또한 할미꽃의 기내 뿌리 분화는 다른 식물에 비해 용이하지 않아 복잡한 계대배양 과정을 통해서 이루어지고 있음이 윤 등(2006)에 의한 보고에서도 알 수 있었다. 따라서 완전한 식물체를 생산하기 위해 기내 뿌리 분화에 대한 적합한 배지 및 식물 생장조절물질에 대한 연구가 필요하다고 생각된다.
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