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문제 정의
- 재분화 체계 확립이 절실히 요구된다. 물레나물에 대한 조직배양에 관한 연구는 아직까지 보고된 바 없으며 본연구에서는 개화기를 중심으로 약 배양을 실시하였던 바다량의 식물체를 얻었기에 화뢰의 저온처리 및 식물 생장조절물질이 약 유래 캘러스 및 식물체 재분화에 미치는 효과를 보고하는 바이다.
제안 방법
- 2.0 mg/L 2, 4-D 단용처리에 의해 약유래 형성된 캘러스를 분리하여 캘러스의 지속적 증식 및 다수의 부 정신 초를 유도하기 위해 0.1 mg/L 2, 4-D와 1.0 mg/L BA 혼용처리, BA 및 TDZ를 각각 1.0, 2.0, 3.0, 5.0 mg/L 씩 단용처리한 배지에 30일 간격으로 계대 배양하여 신초 재분화에 미치는 cytokinin 효과를 조사하였다. 1.
- MS(Murashige and Skoog, 1962) 및 1/2MS 기본 배지에 식물 생장조절물질을 첨가하지 않거 나, 2, 4-D(1.0, 2.0, 3.0 mg/L)단용처리, 0.1 mg/L 2, 4-D와 1.0 mg/L BA, 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L BA 및 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L TDZ 를 혼용 처리한 8조합 배지에서 약배양 반응여부를 조사하였고, 형성된 캘러스는 0.1 mg/L 2, 4-D와 1.0 mg/L BA 혼용처리된 1/2MS 배지에서 60일간 계대배양 하였다. 한편, 증식된 캘러스는 BA와 TDZ를 1.
- 1). 개화 1주일 전의 화뢰 내 약을 분리하여 기본배지별 배양 90일까지 약 배양 변화를 관찰한 결과 MS 배지보다 1/2MS 배지에서 캘러스 형성율이 높았으며 따라서 기본 배지는 1/2MS 배지로 선정하였고 2, 4-D(1.0, 2.0, 3.0 mg/L) 단용 및 0.1 mg/L 2, 4-D와 1.0 mg/L BA, 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L BA 또는 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L TDZ를 혼용처리 하였다. 물레나물의 약은 극히 작고 치상당시 노랑색을 띄었으나 배양기일이 경과됨에 따라 담갈색으로 변하였다.
- 그러나 3.0 mg/L 이상 2, 4-D를 처리한 경우 오히려 캘러스 형성이 저조하였으며 배양 90일 경부터는 농갈색, 흑색으로 변한 후 고사하였다. 특히 2.
- 물레나물 약배양에 있어서 약 유래 캘러스 유도에 미치는 배지 및 식물생장조절물질의 효과를 조사하기 위해 MS 및 1/2MS 기본배지에 2, 4-D, NAA, BA, TDZ를 단용 또는 혼용 처 리한 후 120일간 배양하였다(Fig. 1). 개화 1주일 전의 화뢰 내 약을 분리하여 기본배지별 배양 90일까지 약 배양 변화를 관찰한 결과 MS 배지보다 1/2MS 배지에서 캘러스 형성율이 높았으며 따라서 기본 배지는 1/2MS 배지로 선정하였고 2, 4-D(1.
- 전북대학교 학술림 포장에 식재되어 있는 물레나물에서 개화 1주일 전(6월 20일경) 화뢰(크기 10-15 mm)를 채취하여 5 ℃ 냉장고에 0, 8일 및 15일간 저온처리 하였으며 치상전 70% 에탄올에 30초간 침지하고 7% calcium hypochlorite 수용액에 10분간 소독과 멸균수로 4-5회 수세한 다음 배지에 치싱하여 22 ±1C 와 50 umol . m-2 .
- 초기 캘러스 형성율 및 형성된 캘러스로부터 신초 분화는 10일 간격으로 현미경하에서 관찰하였고 배양 120일경에는 캘러스로부터 shoot 재분화 수를 육안으로 조사하였다.
- 0 mg/L BA 혼용처리된 1/2MS 배지에서 60일간 계대배양 하였다. 한편, 증식된 캘러스는 BA와 TDZ를 1.0, 2.0, 3.0, 5.0 mg/L 씩 처리한 1/2MS 배지에 계대배양 후 신초분화에 미치는 BA 와 TDZ 효과를 조사하였다.
대상 데이터
- 본 재료인 물레나물(Hypericum ascyron L.)은 고주나물 (Hypericum erectum Thunberg), 서양에서 불리는 성 요한의 꽃으로 불리는 St. John's wort (Hypericum perforatum L.) 와 등과 같이 물레나물과에 속하나 이들 식물들이 함유하고 있는 hypericin 함량을 비교하였을 때 hypericine 고추나물의 꽃과 잎의 작고 검붉은 점에 집중되어 있으며 St. John's wort 에도 이런 검붉은 점이 있는데 반해 물레나물에서는 관찰되어지지 않았다고 하였고(Kim et al., 2005), RAPD 분석을 통한 한국산 물레나물속(Hypericum) 식물에서의 유연관계를 분석한 결과 고추나물 이 동일과에 속한 물레나물보다 St. John's wort와 유연관계가 더 가까운 것으로 나타났다고 한다(Kim et al., 2005). 이와 같이 동일 과에 속하는 식물일지라도 함유된 성분에서도 차이가 있듯이 조직배양을 함에 있어서도 배양 절편 부위에 따라 요구되는 식물생장조절물질은 상이한 것으로 나타났다.
성능/효과
- 0 mg/L 씩 단용처리한 배지에 30일 간격으로 계대 배양하여 신초 재분화에 미치는 cytokinin 효과를 조사하였다. 1.0 mg/L TDZ 처리에서 단 1개의 신초가 분화된 것을 제외하고 TDZ 첨가된 모든 배지에서 캘러스는 검고 단단하여 더 이상 증식이 되지 않아 TDZ 처리는 물레나물 약유래 캘러스에서 신초 재분화에 효과가 거의 없었다.
- 1.0과 2.0 mg/L BA 처리에서 캘러스는 배지 면에 접한 부위부터 점차 갈변되었으나 일부 캘러스에서는 담황색 및 담녹색 캘러스가 증식되어 곧바로 shoot로 재분화하였는데(Photo. 1C, 1D), 특히 3.0 mg/L BA 처리구 에서 캘러스는 거의 모두 캘러스로부터 shoot가 왕성하게 분화되어 본 실험에서 가장 효과적 이었다(Photo. 1E).
- 1.0과 2.0 mg/L BA 처리에서는 담갈색 캘러스로부터 녹색 캘러스가 형성되었고 곧이어 shoot가 분화되었고, 특히 3.0 mg/L BA 처리구에서 캘러스는 거의 모두 shoot 가 왕성하게 분화되어 본 실험에서 가장 효과적이었다.
- 2, 4-D가 첨가된 배지내에서 약은 약벽을 통하거나 약내부에서 팽대와 단단한 캘러스가 형성되었으며 약유래 캘러스형성율은 1.0 mg/L과 2.0 mg/L 2, 4-D 단용처리에서는 30%와 52.6%이었고 0.1 mg/L 2, 4-D와 1.0 mg/L BA 혼용처리 시에는 25%이었으나, 3.0 mg/L 2, 4-D 단용 처리 구에서는 19.8%정도가 형성되어 물레나물의 약배양시 2, 4-D는 캘러스 형성에 필요한 물질로 생각되었다.
- 물레나물의 약은 극히 작고 치상당시 노랑색을 띄었으나 배양기일이 경과됨에 따라 담갈색으로 변하였다. NAA 와 BA 및 NAA와 TDZ 혼용처리에서는 초기 약벽에서 담황색의 단단한 갤러스가 형성되기 시작하여 배양 90일 경에는 전체치상수의 12.7%와 10.6%의 캘러스가 각각 형성되었는데 2, 4-D단용 및 BA와 혼용에 비해 캘러스 형성에는 부적합 하였다.
- 그러나 5C 냉장고에서 8일간 또는 15일간 전처리한 후배 양한 약에서는 대조구에 비해 약들이 오랫동안 생존해있으면서 약벽 또는 약내에서 캘러스가 배양 2주 후부터 형성되기 시작하여 배양 60일경에는 처리별로 각각 79.8% 와 42.7%의 캘러스 형성율을 보여 대조구의 25% 보다 월등한 효과가 있었다. 특히 5C 에서 8일간 처리한 화뢰에서 약들은 배양전 상태가 양호하였으나 15일간 처리한 화뢰 내 일부 약들은 중앙부위쪽 일부 약을 제외하고는 저온장해를 입어 기내배양에서도 그 효과가 나타난 것으로 생각되며 따라서 물레나물의 약배양에는 5C 의 8일간이 가장 효과적인 저온처리기간으로 생각되었다.
- , 1996) 본 실험의 물레나물의 약도 5C에서 8일간 및 15일간 처리하여 배양한 결과 두 처리구모두 대조구에 비해 약 및 캘러스의 생육이 오랫동안 왕성하게 진행되었으며 발생된 캘러스의 활력도 장기간 요하는약배양 기간동안 비슷한 속도로 유지할 수 있어 저온효과가 인정되었다. 그러나 5C 에서 15일간의 처리는 배양전약 상태에 피해가 되었으며 이로 인해 배양 중 8일 처리에 비해 효과가 적은 것으로 생각되어 물레나물의 약 배양에 있어서 5C의 8일간 저온전처리는 캘러스 형성과 식물체재 분화에 효과적인 범위로 생각되었다.
- , 2006). 그러나 본 실험의 물레나물 약유래 캘러스로부터 신초 및 다신초를 분화시키기 위해 0.1 mg/L 2, 4-D와 1.0 mg/L BA 혼용처리, BA 및 TDZ를 각각 1.0, 2.0, 3.0, 5.0 mg/L 씩 단용 처리한 배지에 30일 간격으로 계대 배양하여 신초 분화에 미치는 cytokinin 효과를 조사한 결과 TDZ 처 리구에서는 단 1개의 신초가 1.0 mg/L TDZ처리에서 분화되었을 뿐 고추나물의 배양에서와 같이 TDZ 효과는 기대할 수 없었다.
- 물레나물의 약배양에서 저온처리 하지 않은 약을 배양하였을 때 배양 중 약은 쉽게 갈변되었고 형성되는 캘러스의 활력도 저온처리구와 비교하였을 때 현저하게 떨어져 저온처리에 의한 약과 형성된 캘러스 생육에 효과가 뚜렷하였다. 한편, 식물에 따라서는 저온처리 온도와 기간이 캘러스 및 배형성에 영향을 주는데, 개구리자리의 경우 1, 5, 10℃ 의 처리 중 각 온도별 10일간 처리가 효과적이었으며 특히 10C의 10일처리는 캘러스유도 및 배발생에 가장 탁월하였으며 분화된 식물체에서 화뢰가 형성되기도 하였다(Lee et al.
- 백합 약을 1C에서 10일간, 10C에서 3일간 저온 처리하여 극소수 약에서 callus 및 배 형성되었고(Lee et al., 1992), 백색칼라 약을 5C에서 6일간 처리하므로 무처리및 10C 처리구에 비해 캘러스 발생속도가 30일 가량 빨랐으며 재분화된 식물체 생육도 왕성하여 가장 효과적이라 하였는데(Ko et al., 1996) 본 실험의 물레나물의 약도 5C에서 8일간 및 15일간 처리하여 배양한 결과 두 처리구모두 대조구에 비해 약 및 캘러스의 생육이 오랫동안 왕성하게 진행되었으며 발생된 캘러스의 활력도 장기간 요하는약배양 기간동안 비슷한 속도로 유지할 수 있어 저온효과가 인정되었다. 그러나 5C 에서 15일간의 처리는 배양전약 상태에 피해가 되었으며 이로 인해 배양 중 8일 처리에 비해 효과가 적은 것으로 생각되어 물레나물의 약 배양에 있어서 5C의 8일간 저온전처리는 캘러스 형성과 식물체재 분화에 효과적인 범위로 생각되었다.
- , 1996). 백합의 경우도 5.0 mg/L 2, 4-D 단용 및 1.0 mg/L씩 2, 4-D와 kinetin이 혼용 처리되었을 때 기관분화성 캘러스는 발생 되었으나 0.5 mg/L NAA와 1.0 mg/L BA 혼용처리에서 callus에서 shoot가, 2.0 mg/L씩 NAA와 BA 혼용처리시에는 3-4매 잎이 부착된 다아체의 형성 및 소자구 분화에 양호하여 이와 같이 동일 식물에서 조차 캘러스 및 배발생과 식물체 재분화에 단계별로 요구되는 식물생장조절물질의 종류와 농도는 각각 달랐다.
- 부정 신초를 분리하여 식물생장조절물질이 첨가되지 않은 1/2MS 배지에 계대배양 한 결과 1주일 후부터 shoot 기부에서 희고 가는 뿌리가 다수 발생되었고, 외형적으로 정상적인 식물체가 재분화 되었다(Photo. 1).
- , 2005). 이와 같이 동일 과에 속하는 식물일지라도 함유된 성분에서도 차이가 있듯이 조직배양을 함에 있어서도 배양 절편 부위에 따라 요구되는 식물생장조절물질은 상이한 것으로 나타났다.
- 7%의 캘러스 형성율을 보여 대조구의 25% 보다 월등한 효과가 있었다. 특히 5C 에서 8일간 처리한 화뢰에서 약들은 배양전 상태가 양호하였으나 15일간 처리한 화뢰 내 일부 약들은 중앙부위쪽 일부 약을 제외하고는 저온장해를 입어 기내배양에서도 그 효과가 나타난 것으로 생각되며 따라서 물레나물의 약배양에는 5C 의 8일간이 가장 효과적인 저온처리기간으로 생각되었다.
- 화뢰의 저온 전처리가 약배양에 미치는 효과를 조사하기 위해 개화 1주일 전(6월 20일경) 1.0-1.5 cm 크기의 화뢰를 채취하여 5℃ 냉장고에서 8일 및 15일간 처리한 후 0.1 mg/L 2, 4-D와 1.0 mg/L BA 혼용 첨가된 1/2 MS 배지에 120일간 배양한 결과 캘러스형성 및 shoot 분화에 현저한 차이가 나타났다. 즉, 즉 저온처리하지 않은 대조구의 약은 약 벽이 팽대하거나 약격이 열개되면서 캘러스가 형성되다가 배양 30일이 경과되었을 때는 점차 갈변되기 시작하였으며 배양 기간이 경과됨에 따라 약내 캘러스가 모두 급속히 갈변되었다(Photo.
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