본 연구는 에탄올 생산 부산물인 주정박의 사료로서의 가치를 향상시키고 효소 활성을 유지하면서 아미노산이 다량 함유된 발효 사료를 개발하기 위한 고체 발효 조건을 최적화하는데 목적을 두었다. 사용된 균주의 pH에 대한 영향을 살펴본 결과, pH 4에서 효소 활성이 우수하였으며 또한 이 조건은 낮은 pH 조건이므로 잡균에 대한 오염도 예방 할 수 있어 본 실험의 최적 액체배양 조건임을 확인할 수 있었다. 고체 배양을 위한 배양 조건 탐색에서는 60%의 수분을 함유한 고체 배양에서 가장 좋은 효소 활성의 결과를 나타내었으며 적정 배지 조성을 위한 혼합 비율 탐색의 경우 밀기울 함량이 높고 DDG 함량이 낮을수록 효소 활성은 좋았으나 아미노산 함량은 낮은 반면, DDG 함량이 높고 밀기울 함량이 낮을수록 효소 활성은 낮았지만 아미노산 함량은 높은 결과를 나타내었다. 따라서 효소활성 ($\geqq$ 1,000 U/g) 및 아미노산 함량 ($\geqq$ 28%)이 적당한 고체 발효 배지 조성의 비율은 DDG와 밀기울이 1 : 4였다. 이렇게 해서 얻어진 결과로 약 1 ton 정도의 발효 사료 시제품을 생산하였으며 시제품의 효소활성과 조단백질 함량은 각각 1,024 U/g과 33.6%였다.
본 연구는 에탄올 생산 부산물인 주정박의 사료로서의 가치를 향상시키고 효소 활성을 유지하면서 아미노산이 다량 함유된 발효 사료를 개발하기 위한 고체 발효 조건을 최적화하는데 목적을 두었다. 사용된 균주의 pH에 대한 영향을 살펴본 결과, pH 4에서 효소 활성이 우수하였으며 또한 이 조건은 낮은 pH 조건이므로 잡균에 대한 오염도 예방 할 수 있어 본 실험의 최적 액체배양 조건임을 확인할 수 있었다. 고체 배양을 위한 배양 조건 탐색에서는 60%의 수분을 함유한 고체 배양에서 가장 좋은 효소 활성의 결과를 나타내었으며 적정 배지 조성을 위한 혼합 비율 탐색의 경우 밀기울 함량이 높고 DDG 함량이 낮을수록 효소 활성은 좋았으나 아미노산 함량은 낮은 반면, DDG 함량이 높고 밀기울 함량이 낮을수록 효소 활성은 낮았지만 아미노산 함량은 높은 결과를 나타내었다. 따라서 효소활성 ($\geqq$ 1,000 U/g) 및 아미노산 함량 ($\geqq$ 28%)이 적당한 고체 발효 배지 조성의 비율은 DDG와 밀기울이 1 : 4였다. 이렇게 해서 얻어진 결과로 약 1 ton 정도의 발효 사료 시제품을 생산하였으며 시제품의 효소활성과 조단백질 함량은 각각 1,024 U/g과 33.6%였다.
To enhance the value as a feedstuff of distiller's dried grain (DDG) and develop fermented feedstuff, we investigated the effects of the culture conditions affecting glucoamylase activity, such as pH in submerged culture and moisture content in solid-state culture. Also, we investigated the optimal ...
To enhance the value as a feedstuff of distiller's dried grain (DDG) and develop fermented feedstuff, we investigated the effects of the culture conditions affecting glucoamylase activity, such as pH in submerged culture and moisture content in solid-state culture. Also, we investigated the optimal mixing ratio of DDG and wheat bran for the production of fermented feedstuff containing high content of amino acids. In culture conditions for high fermented activity, pH and moisture were optimum at pH 4 and 60%, respectively. In the case of mixing ratio, the glucoamylase activity was decreased with increase of DDG content. On the other hand, the content of crude protein was increased slowly. For the development of fermented feedstuff, the optimal mixing ratio of DDG and wheat bran was 1 to 4. Finally, we could produce approximately 1 ton (dry matter) of trial product in incubator of pilot-scale. The glucoamylase activity and the crude protein content were 1,024 U/g and 33.6%, respectively.
To enhance the value as a feedstuff of distiller's dried grain (DDG) and develop fermented feedstuff, we investigated the effects of the culture conditions affecting glucoamylase activity, such as pH in submerged culture and moisture content in solid-state culture. Also, we investigated the optimal mixing ratio of DDG and wheat bran for the production of fermented feedstuff containing high content of amino acids. In culture conditions for high fermented activity, pH and moisture were optimum at pH 4 and 60%, respectively. In the case of mixing ratio, the glucoamylase activity was decreased with increase of DDG content. On the other hand, the content of crude protein was increased slowly. For the development of fermented feedstuff, the optimal mixing ratio of DDG and wheat bran was 1 to 4. Finally, we could produce approximately 1 ton (dry matter) of trial product in incubator of pilot-scale. The glucoamylase activity and the crude protein content were 1,024 U/g and 33.6%, respectively.
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문제 정의
shiro-usamii-c 고체 배양 시적 정 수분양이 필요한데 이는 균사 성장과 공기 공급에 영향을 주기 때문이다. 따라서 본 실험에서는 고체배지의 수분 함량에 따른 효소 활성의 차이를 살펴보았다. pH 4의 액체배지에서 배양된 액체배양액을 밀기울 고체배지에 혼합한 후 수분 함량이 각각 50, 55, 60, 65%인 혼합물을 조성하여 배양을 한 후각각의 배양물의 효소활성을 측정하였다 Table 2를 보면 수분함량이 60%일 경우 가장 높은 효소활성 (1, 304 U/g)을 나타내었으며, 그 이상 또는 그 이하의 경우 효소활성이 저하되는 결과를 나타내었다.
따라서 본 연구에서는 에탄올 생산 부산물인 주정박 가치를 극대화 시키고, 수입에 의존하고 있는 사료 시장에서보다 경쟁력 있는 효소활성 (glucoamylase activity)과 아미노산 함량이 높은 발효 사료 개발을 위하여 효소 생성능이 우수한 균주를 선별하고 균주의 배양 조건과 주정박과 밀기울의 최적 혼합비 등을 최적화하여 상업적 생산의 기초 자료를 제공하고자■ 한다.
본 연구는 에탄올 생산 부산물인 주정박의 사료로서의 가치를 향상시키고 효소 활성을 유지하면서 아미노산이 다량 함유된 발효 사료를 개발하기 위한 고체 발효 조건을 최적화 하는데 목적을 두었다. 사용된 균주의 pH에 대한 영향을 살펴본 결과, pH 4에서 효소 활성이 우수하였으며 또한 이 조건은 낮은 pH 조건이므로 잡균에 대한 오염도 예방 할 수 있어 본 실험의 최적 액체배양 조건임을 확인할 수 있었다.
제안 방법
Table 3과 같이 혼합한 배지의 수분은 40%이며 이 고체배지와 액체배양액을 2:1의 비율로 혼합하여 60%의 수분을 함유한배양 조건을 충족시킬 수 있었다. 32℃에서 65시간 배양 후 균사의 배양 상태를 확인하고, 실온에서 24시간 건조 후 효소 활성, 조단백질 함량, 아미노산 성분별 함량을 분석하였다.
DDG와 밀기울을 일정 비율 (0, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40% DDG)로 혼합한 고체배지에서 배양한 고체배양물의 효소 활성, 조단백질 함량 및 아미노산 성분의 차이를 확인하고 최적 혼합비율을 확인하기 위하여 Table 3과 같이 배지를 조성하였다. Table 3과 같이 혼합한 배지의 수분은 40%이며 이 고체배지와 액체배양액을 2:1의 비율로 혼합하여 60%의 수분을 함유한배양 조건을 충족시킬 수 있었다.
usamii mut. shiro-usamii 균주의 액체 배양의 효소 활성 최적화를 위해액체배지의 pH에 따른 고체배양에서 효소 활성의 영향을 실험하였다. 액체 배지의 pH를 5 N HC1 을 이용하여 pH 3, 4, 5, 6 으로 조절한 후 44시간 동안 액체배양을 하였고, 이 액체배양액을 다시 밀기울만으로 이루어진 고체배지에 접종하여 65시간동안 고체배양 후 효소활성을 측정하였다 그 결과를 Table 1에나타내었다.
shiro-usamii (KCTC 6954) 를 생물자원센터 유전자은행에서 분양받아 사용하였다. 균주배양용 평판 배지 및 포자 생성용 사면배지는 PDA (potato dextrose agar)배지를 사용하여 30℃에서 7일간 배양하였으며균주 활성 유지를 위하여 2주 간격으로 계대 배양하여 4℃에서보관하여 사용하였다.
고체배양 시 가장 고려되어야 할 부분인 잡균의 오염을 방지하기 위해서는 효소활성을 유지하면서 오염 방지를 위해 pH를 낮출 수 있는 범위를 선정하는 것이 가장 중요하다. 따라서 본 연구에서는 낮은 pH 조건에서 효소 활성을 유지할 수있는 pH 4를 최적 액체배지 조건으로 선정하였다.
배양이 완료되면 50℃ 미만에서 24시간 동안 건조하여 분쇄 후발효 사료를 생산하였다. 발효 사료 생산의 공정은 Fig. 1과 같으며 최종 생산된 제품의 효소활성 및 조단백질을 분석하였다.
발효 사료를 생산하기 위해서 500 L의 밀기울 액체배지를 함유한 4-KL Fermenter (Changhae ENG Ltd.)에서 액체배양을 하여 얻어진 배양액과 10-KL 처리 용량의 살균기 (Changhae ENG Ltd.)에서 살균된 밀기울과 DDG 혼합 배지 (1 ton; dry matter)를 혼합한 후 2.5 mxl5 mx4.5 m (WxLxH) 규모의 배양실에서 32 ℃ 로 수분을 공급하면서 65 시간 배양하였다. 배양이 완료되면 50℃ 미만에서 24시간 동안 건조하여 분쇄 후발효 사료를 생산하였다.
shiro-usamii 균주의 액체 배양의 효소 활성 최적화를 위해액체배지의 pH에 따른 고체배양에서 효소 활성의 영향을 실험하였다. 액체 배지의 pH를 5 N HC1 을 이용하여 pH 3, 4, 5, 6 으로 조절한 후 44시간 동안 액체배양을 하였고, 이 액체배양액을 다시 밀기울만으로 이루어진 고체배지에 접종하여 65시간동안 고체배양 후 효소활성을 측정하였다 그 결과를 Table 1에나타내었다. pH에 따른 효소 활성은 pH 4, 5, 6에서 비슷한결과를 보였으며, 그 중 pH 5에서 효소활성이 가장 우수하였는데 이는 glucoamylase의 경우 최적 활성 조건이 pH 5이므로액체배지의 pH가 효소활성에 영향을 미친 것으로 판단
효소활성이 우수하며 아미노산 함량이 우수한 발효 사료를 생산하기 위하여 pH 4의 액체 배지에서 배양한 액체배양액 500 L와 1 ton의 혼합배지 (20% DDG+80% 밀기울)를 혼합후 고체 배양하였다. 고체배양의 산업적 생산을 위하여 pilot scale로 32℃ 에서 수분을 공급하며 65시간 동안 배양하였으며 배양 완료 후 50℃미만에서 24시간 간접 건조하여 생산된발효 사료의 분석 결과 효소활성과 조단백질 함유량이 각각 1, 024 U/g, 33.
대상 데이터
곰팡이 중 Aspergillus usamii mut. shiro-usamii (KCTC 6954) 를 생물자원센터 유전자은행에서 분양받아 사용하였다. 균주배양용 평판 배지 및 포자 생성용 사면배지는 PDA (potato dextrose agar)배지를 사용하여 30℃에서 7일간 배양하였으며균주 활성 유지를 위하여 2주 간격으로 계대 배양하여 4℃에서보관하여 사용하였다.
이론/모형
Glucoamylase 효소 활성 측정은 기질용액 (1.25% soluble starch in 40 mM acetate buffer, pH 5) 80 mL을 60 ℃ 에서 10분간 예열하고 조효소액 10 mL를 첨가하여 60분간 반응 시킨 후 0.5 N NaOH 10 mL를 가하여 효소 반응을 정지시켜 효소 반응에 의하여 생성된 환원당의 양을 Somogyi법(19)으로 측정하여 효소활성을 측정하였다. Glucoamylase 1 Unit(U)은 60분에 환원당으로서 1 g의 glucose을 생성하는데 필요한 효소 양으로 정의하였다.
시료의 일반성분은 AOAC법(20)에 의하여 정량하였고, 수분함량은 105℃ 상압가열건조법, 조단백질은 semi-micro Kjeldahl 법으로 측정하였다 아미노산은 ni血hydrin법(21)을 이용한 amino acid auto analyzer (Amino acid analyzer S-433, Sykam co., Germany)를 사용하여 분석하였다.
성능/효과
액체 배지의 pH를 5 N HC1 을 이용하여 pH 3, 4, 5, 6 으로 조절한 후 44시간 동안 액체배양을 하였고, 이 액체배양액을 다시 밀기울만으로 이루어진 고체배지에 접종하여 65시간동안 고체배양 후 효소활성을 측정하였다 그 결과를 Table 1에나타내었다. pH에 따른 효소 활성은 pH 4, 5, 6에서 비슷한결과를 보였으며, 그 중 pH 5에서 효소활성이 가장 우수하였는데 이는 glucoamylase의 경우 최적 활성 조건이 pH 5이므로액체배지의 pH가 효소활성에 영향을 미친 것으로 판단된다. (24-25).
usamii mut. s血ro-uwmii에 의해 배양된 배양물의 아미노산 함량이 배양 전보다 2배 이상 증가하는 결과를 보여주었다(Table 5). 밀기울의 경우 발효 전과 후의 조단백, 조지방 등의 성분들이 증가하고 동물 생육에 필요한 각종 활성물질들의 비율이 증가되는 연구가 보고되었다(26).
사용된 균주의 pH에 대한 영향을 살펴본 결과, pH 4에서 효소 활성이 우수하였으며 또한 이 조건은 낮은 pH 조건이므로 잡균에 대한 오염도 예방 할 수 있어 본 실험의 최적 액체배양 조건임을 확인할 수 있었다. 고체배양을 위한 배양 조건 탐색에서는 60%의 수분을 함유한 고체배양에서 가장 좋은 효소 활성의 결과를 나타내었으며 적정 배지 조성을 위한 혼합 비율 탐색의 경우 밀기울 함량이 높고 DDG 함량이 낮을수록 효소 활성은 좋았으나 아미노산 함량은 낮은 반면, DDG 함량이 높고 밀기울 함량이 낮을수록 효소 활성은 낮았지만 아미노산 함량은 높은 결과를 나타내었다. 따라서 효소활성 (兰 1,000 U/g) 및 아미노산 함량 伝 28%) 이적당한 고체 발효 배지 조성의 비율은 DDG와 밀기울이 1 : 4 였다.
고체 배양하였다. 고체배양의 산업적 생산을 위하여 pilot scale로 32℃ 에서 수분을 공급하며 65시간 동안 배양하였으며 배양 완료 후 50℃미만에서 24시간 간접 건조하여 생산된발효 사료의 분석 결과 효소활성과 조단백질 함유량이 각각 1, 024 U/g, 33.6%이였다.
고체배양을 위한 배양 조건 탐색에서는 60%의 수분을 함유한 고체배양에서 가장 좋은 효소 활성의 결과를 나타내었으며 적정 배지 조성을 위한 혼합 비율 탐색의 경우 밀기울 함량이 높고 DDG 함량이 낮을수록 효소 활성은 좋았으나 아미노산 함량은 낮은 반면, DDG 함량이 높고 밀기울 함량이 낮을수록 효소 활성은 낮았지만 아미노산 함량은 높은 결과를 나타내었다. 따라서 효소활성 (兰 1,000 U/g) 및 아미노산 함량 伝 28%) 이적당한 고체 발효 배지 조성의 비율은 DDG와 밀기울이 1 : 4 였다. 이렇게 해서 얻어진 결과로 약 1 ton 정도의 발효 사료 시제품을 생산하였으며 시제품의 효소활성과 조단백질 함량은 각각 1, 024 U/g과 33.
pH 4의 액체배지에서 배양된 액체배양액을 밀기울 고체배지에 혼합한 후 수분 함량이 각각 50, 55, 60, 65%인 혼합물을 조성하여 배양을 한 후각각의 배양물의 효소활성을 측정하였다 Table 2를 보면 수분함량이 60%일 경우 가장 높은 효소활성 (1, 304 U/g)을 나타내었으며, 그 이상 또는 그 이하의 경우 효소활성이 저하되는 결과를 나타내었다. 발효 사료를 개발하기 위한 본 연구에서는 수분 함유량이 60%가 최적 조건임을 확인할 수 있었다.
목적을 두었다. 사용된 균주의 pH에 대한 영향을 살펴본 결과, pH 4에서 효소 활성이 우수하였으며 또한 이 조건은 낮은 pH 조건이므로 잡균에 대한 오염도 예방 할 수 있어 본 실험의 최적 액체배양 조건임을 확인할 수 있었다. 고체배양을 위한 배양 조건 탐색에서는 60%의 수분을 함유한 고체배양에서 가장 좋은 효소 활성의 결과를 나타내었으며 적정 배지 조성을 위한 혼합 비율 탐색의 경우 밀기울 함량이 높고 DDG 함량이 낮을수록 효소 활성은 좋았으나 아미노산 함량은 낮은 반면, DDG 함량이 높고 밀기울 함량이 낮을수록 효소 활성은 낮았지만 아미노산 함량은 높은 결과를 나타내었다.
2). 아미노산 성분 분석 결과(Table 4) DDG 함량이 20%일 경우 최대 아미노산 함량 (28.44%)을 나타내었고 축산사료의 가치에 영향을 미치는 라이신의 경우도 DDG 20% 함유 고체 배지 배양물에서 최대임을 나타내었다. 또한 최적혼합물 배지의 고체배양 전후의 구성 아미노산을 비교해보면 A.
밀기울의 경우 발효 전과 후의 조단백, 조지방 등의 성분들이 증가하고 동물 생육에 필요한 각종 활성물질들의 비율이 증가되는 연구가 보고되었다(26). 아미노산 함량 측면에서만 보면 원가가 저렴하고 아미노산 함량이 풍부한 DDG가 사료로서의 가치가 우수하나 본 연구의 목적인 발효 사료로서의 효소활성이 매우 떨어짐으로 최적 혼합 비율은 20% DDG 함유가 적당하다고 사료된다. 이때 효소 활성, 조단백질 함량 총 아미노산 함량은 각각 1, 019 U/g, 30.
따라서 효소활성 (兰 1,000 U/g) 및 아미노산 함량 伝 28%) 이적당한 고체 발효 배지 조성의 비율은 DDG와 밀기울이 1 : 4 였다. 이렇게 해서 얻어진 결과로 약 1 ton 정도의 발효 사료 시제품을 생산하였으며 시제품의 효소활성과 조단백질 함량은 각각 1, 024 U/g과 33.6%였다.
조단백질 함량은 DDG 비율이 증가할수록 28%에서 33%로 조금씩 증가하였으며, 효소활성은 고체배지 조성의 DDG 비율이 증가할수록 1, 600 (U/g)에서 500 (U/g)으로 크게 저하되었다(Fig. 2). 아미노산 성분 분석 결과(Table 4) DDG 함량이 20%일 경우 최대 아미노산 함량 (28.
후속연구
현재 주정박은 단순히 사료 원료의 대체 원료로 국한되어 인식되어 있는데, 발효 부산물로서의 우수성에 관한 연구가 필요하며 전 세계적으로 바이오에탄올 생산량 증가로 부산물 인주 정박의 생산량도 증가 할 것으로 보여 보다 체계적인 연구가 필요하다. 따라서 본 연구에서는 에탄올 생산 부산물인 주정박 가치를 극대화 시키고, 수입에 의존하고 있는 사료 시장에서보다 경쟁력 있는 효소활성 (glucoamylase activity)과 아미노산 함량이 높은 발효 사료 개발을 위하여 효소 생성능이 우수한 균주를 선별하고 균주의 배양 조건과 주정박과 밀기울의 최적 혼합비 등을 최적화하여 상업적 생산의 기초 자료를 제공하고자■ 한다.
참고문헌 (26)
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