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문제 정의
- 본 연구는 전분 가수분해효소인 α-amylase의 효소활성 저해를 통해 식후 혈당조절제 개발 가능성을 확인하고자 메밀의 꽃, 잎, 줄기 및 곡립을 부위별로 분류하고 각각의 시료를 물, 40%, 70%, 100% 에탄올로 추출하고 건조한 추출건조 물과 메밀건조 분말시료를 이용하여 in vitro에서 α-amylase 활성 저해율을 측정하였다.
- 본 연구에서는 항당뇨기능이 있는 소재를 찾고자 실시한 실험에서 우리가 일상적으로 섭취하는 식품 42종 중 α-amylase 저해활성이 비교적 높은 것으로 나타난 메밀을 부위별로 분류하고 용매별로 추출하여 in vitro에서 α-amylase 저해활성을 검토하고자 하였다.
제안 방법
- 메밀 꽃과 잎의 추출물과 분말시료의 경우 실험농도를 0.1%, 0.5%, 1%, 2.5%, 5%, 10%(w/w, starch basis)로 하였으며, α-amylase 저해제로 보고된(22,23) acarbose((주)한독약품)의 α-amylase 저해율을 시료와 같은 농도별로 병행하여 실시하였다.
- 메밀을 꽃, 잎, 줄기 및 곡립으로 분류하여 100%, 70%, 40% 에탄올 및 물을 용매로 하여 추출한 추출액을 건조하고 각각의 시료에서 α-amylase 활성 저해율을 측정하였다.
- 본 실험에서 사용된 시료는 강원도 평창군 봉평메밀특산단지에서 메밀종자(Fagopyrum esculentum)를 직접 파종하여 꽃이 만개한 70일 후에 채취하였으며 꽃, 잎, 줄기를 부위별로 분리하였다. 분리한 꽃, 잎, 줄기는 건조기에서 부위별로 건조하면서 최적의 건조상태를 파악한 다음 분쇄기로 분쇄하여 30 mesh의 채를 통과시켜 분말화하였다. 메밀 곡립은 봉평메밀특산단지에서 재배하여 수확 후 정선, 세척, 석발, 분류, 탈피, 제분하여 입도조정을 거쳐 제조한 곡립분말을 본 연구에 사용하였다.
- 위와 동일한 방법으로 시료를 가하지 않은 효소를 전분기질과 반응시키고 그 결과를 대조 구로 하여 시료의 효소활성 저해율을 계산하였다. 시약에 의한 영향을 배제하기 위해 시약 blank를 실시하였으며 시료의 당함유에 의한 영향을 배제하기 위해 시료 각각에 대한 blank를 실시하여 실험값에서 빼 주었다. 메밀 꽃과 잎의 추출물과 분말시료의 경우 실험농도를 0.
- 이 반응액에 5 mL의 증류수를 가하고 잘 혼합한 후 550 nm의 spectrophotometer(Beckmann, Germany)에서 흡광도를 측정하였다. 실험은 한 시료당 5회 실시하였다. 위와 동일한 방법으로 시료를 가하지 않은 효소를 전분기질과 반응시키고 그 결과를 대조 구로 하여 시료의 효소활성 저해율을 계산하였다.
- 위에서 얻은 메밀 꽃, 잎, 줄기, 곡립을 20배의 물, 15배의 40% 에탄올, 10배의 70% 에탄올, 5배의 100% 에탄올 용액과 각각 혼합하여 40°C에서 12시간 진탕 추출하였으며 이 과정을 2회 반복하여 용매별 가용성 물질을 추출하였다.
- 실험은 한 시료당 5회 실시하였다. 위와 동일한 방법으로 시료를 가하지 않은 효소를 전분기질과 반응시키고 그 결과를 대조 구로 하여 시료의 효소활성 저해율을 계산하였다. 시약에 의한 영향을 배제하기 위해 시약 blank를 실시하였으며 시료의 당함유에 의한 영향을 배제하기 위해 시료 각각에 대한 blank를 실시하여 실험값에서 빼 주었다.
- 이후 추출액을 원심분리(1500×g, 30분, 4°C)하고 진공농축, 냉동, 동결건조(-70°C, 72시간)하여 부위별, 용매별로 메밀의 꽃, 잎, 줄기 및 곡립 추출건조물을 제조하였다.
- 5%, 5%, 10%(w/w, starch basis)로 하였으며, α-amylase 저해제로 보고된(22,23) acarbose((주)한독약품)의 α-amylase 저해율을 시료와 같은 농도별로 병행하여 실시하였다. 한독약품의 acarbose를 함유하는 제품의 순도는 18.5%로 acarbose 함량으로 보았을 때 시료의 농도와 같은 %가 되도록 계산하여 실험하였다.
대상 데이터
- 분리한 꽃, 잎, 줄기는 건조기에서 부위별로 건조하면서 최적의 건조상태를 파악한 다음 분쇄기로 분쇄하여 30 mesh의 채를 통과시켜 분말화하였다. 메밀 곡립은 봉평메밀특산단지에서 재배하여 수확 후 정선, 세척, 석발, 분류, 탈피, 제분하여 입도조정을 거쳐 제조한 곡립분말을 본 연구에 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 시료는 강원도 평창군 봉평메밀특산단지에서 메밀종자(Fagopyrum esculentum)를 직접 파종하여 꽃이 만개한 70일 후에 채취하였으며 꽃, 잎, 줄기를 부위별로 분리하였다. 분리한 꽃, 잎, 줄기는 건조기에서 부위별로 건조하면서 최적의 건조상태를 파악한 다음 분쇄기로 분쇄하여 30 mesh의 채를 통과시켜 분말화하였다.
이론/모형
- 메밀 꽃, 잎, 줄기 및 곡립 추출건조물과 α-amylase와의 전처리는 Dunaif와 Schneeman의 방법을 이용하였고(20), α-amylase 활성은 Pesce와 Kaplan의 방법(21)으로 측정하였다.
성능/효과
- 본 실험 결과 추출건조물의 용매에 따라 효소활성 저해율은 다르게 나타났으며 전체적으로 볼 때 100% 에탄올> 40% 에탄올> 70% 에탄올> 물 순서로 나타났다.
- 40% 에탄올에서 추출한 메밀 꽃추출건조물, 잎추출건조물과 acarbose의 0.5% 시료농도에서 α-amylase 활성 저해율은 각각 92%, 70%, 80%이었으며, 꽃추출건조물은 2.5% 첨가시 99% 저해율을 보였다.
- 70% 에탄올추출건조물의 경우에서도 꽃과 잎이 81%, 57%로 줄기와 곡립보다 높았으나 다른 두 에탄올농도보다는 잎추출건조물의 활성 저해율이 비교적 낮게 나타났다. 40% 에탄올추출건조물도 꽃과 잎에서 각각 92%, 82%로 100% 에탄올추출물과 유사한 값을 보였다. 본 논문에서 제시하지는 않았지만 위와 같은 에탄올추출건조물의 α-amylase 활성 저해율은 메탄올추출건조물의 결과와도 유사하였다.
- 70% 에탄올에서 추출한 메밀 꽃추출건조물, 잎추출건조 물과 acarbose를 0.5% 첨가시 α-amylase의 활성 저해율은 각각 88%, 30%, 80%이었다.
- 메밀 꽃, 잎, 줄기 및 곡립의 에탄올추출건조물을 전분의 10%(w/w) 첨가했을 때 시료에 의한 α-amylase 활성 저해율은 100% 에탄올추출건조물의 경우 꽃, 잎, 줄기, 곡립 순으로 91%, 83%, 32%, 22%이었으며, 물추출물과 비교했을 때에는 꽃과 잎추출물의 경우 각각 38%, 28% 억제율이 증가하였다. 70% 에탄올추출건조물의 경우에서도 꽃과 잎이 81%, 57%로 줄기와 곡립보다 높았으나 다른 두 에탄올농도보다는 잎추출건조물의 활성 저해율이 비교적 낮게 나타났다. 40% 에탄올추출건조물도 꽃과 잎에서 각각 92%, 82%로 100% 에탄올추출물과 유사한 값을 보였다.
- 꽃추출건조물의 저해활성은 100% 에탄올에서와 유사한 결과이나 잎추출건조물의 저해 활성은 약간 낮은 경향을 보였다. Table 1에서와 같이 에탄올로 추출한 메밀 잎추출건조물의 수율은 100%, 70%, 40% 가 각각 13%, 25%, 31%로서 에탄올 농도가 낮을수록 수율이 증가하므로 비용과 효과를 고려할 때 에탄올 70%보다 40%를 이용하는 것이 바람직할 것으로 사료된다.
- 결과에 제시되지는 않았지만 효소활성의 50% 억제를 나타내는 시료농도인 IC50 으로 보면 100% 에탄올추출건조물에서 꽃은 8.3 μg/mL, 잎은 9.5 μg/mL로 acarbose의 10.2 μg/mL보다 낮은 수준이었다.
- 3). 그러나 건조분말의 활성 저해율은 100% 에탄올추출건조물과 40% 에탄올추출건조물의 0.5%～2.5% 시료농도에서 보여 주었던 효소저해율보다 현저하게 감소하였다. 본 실험 결과 추출건조물의 용매에 따라 효소활성 저해율은 다르게 나타났으며 전체적으로 볼 때 100% 에탄올> 40% 에탄올> 70% 에탄올> 물 순서로 나타났다.
- 꽃추출건조물을 0.5% 첨가시 α-amylase 활성 저해는 92%로 나타났으며 이러한 결과는 첨가량을 1%, 2.5%, 5%, 10% 증가시켰을 때에도 유사한 경향으로 나타났다.
- 2μg/mL보다 낮은 수준이었다. 꽃추출건조물의 저해활성은 100% 에탄올에서와 유사한 결과이나 잎추출건조물의 저해 활성은 약간 낮은 경향을 보였다. Table 1에서와 같이 에탄올로 추출한 메밀 잎추출건조물의 수율은 100%, 70%, 40% 가 각각 13%, 25%, 31%로서 에탄올 농도가 낮을수록 수율이 증가하므로 비용과 효과를 고려할 때 에탄올 70%보다 40%를 이용하는 것이 바람직할 것으로 사료된다.
- 5%, 5%, 10% 증가시켰을 때에도 유사한 경향으로 나타났다. 또한 acarbose를 0.5% 첨가했을 때 효소억제율은 메밀 꽃과 잎추출건조물보다 다소 낮았으나 1%, 2.5%, 5%, 10% 농도에 서는 메밀추출건조물과 유사한 결과를 보였다. 결과에 제시되지는 않았지만 효소활성의 50% 억제를 나타내는 시료농도인 IC50 으로 보면 100% 에탄올추출건조물에서 꽃은 8.
- 메밀 꽃, 잎, 줄기 및 곡립의 에탄올추출건조물을 전분의 10%(w/w) 첨가했을 때 시료에 의한 α-amylase 활성 저해율은 100% 에탄올추출건조물의 경우 꽃, 잎, 줄기, 곡립 순으로 91%, 83%, 32%, 22%이었으며, 물추출물과 비교했을 때에는 꽃과 잎추출물의 경우 각각 38%, 28% 억제율이 증가하였다.
- 메밀 꽃과 잎 건조분말의 α-amylase의 활성 저해율은 0.1%부터 10%까지 첨가량에 따라 비례적으로 증가하였다(Fig. 3).
- 메밀부위별 물추출건조물(10%, w/w, starch basis)의 α-amylase 활성 저해율은 꽃 66%, 잎 65%, 곡립 28%, 줄기 12% 순이었다.
- 물에서 추출한 꽃추출건조물의 α-amylase의 활성 저해 효과는 에탄올추출건조물이나 acarbose보다도 현저히 낮았다.
- 잎의 경우 100% 에탄올추출건조물에서 꽃과 비슷한 결과를 보였으며 40% 에탄올추출건조물에서는 꽃추출건조물보다 저해율이 다소 낮게 나타났다. 물추출건조물과 건조분말의 경우 에탄올추출물보다 꽃과 잎의 효소활성 저해율이 낮았다. 이러한 결과로 볼 때 메밀 꽃과 잎 추출건조물은 메밀 줄기 및 곡립 추출 건조물과 비교해서 효소활성 저해율이 높게 나타났으며, 물추출이나 건조분말보다 100%, 40% 에탄올을 이용했을 때 추출건조물의 효소 저해율이 더욱 큰 것으로 나타나 이들 추출건조물은 식후 혈당조절제로 이용 가능성이 기대되는 소재로 사료된다.
- 물추출건조물의 경우 꽃과 잎 추출건조물의 α-amylase 활성 저해율이 곡립과 줄기 추출건조물보다 높게 나타났다.
- 본 실험에서의 결과에 의하면 지금까지 당뇨의 유용한 소재로 보고된 바 있는 메밀곡립보다 메밀 꽃과 잎이 α-amylase inhibitor로서의 효과가 더욱 큰 것으로 확인되었다.
- 우리나라에서 보고된 α-amylase 저해효능이 있는 물질 중 70% 에탄올로 추출한 말채나무 추출물의 α-amylase 저해율은 98.8%를 보였으며 IC50은 acarbose가 5 μg/mL, 말채나무 추출물이 120 μg/mL이었다.
- 이 실험에 사용된 4가지 추출 용매에서 추출한 추출건조물의 수율은 잎> 꽃> 줄기> 곡립 순이었다.
- 특히 물에서 추출한 0.5% 꽃추출건조물은 100% 에탄올 추출물에서 보여주었던 효소저해율보다 40% 감소하였다.
후속연구
- 본 실험에서의 결과에 의하면 지금까지 당뇨의 유용한 소재로 보고된 바 있는 메밀곡립보다 메밀 꽃과 잎이 α-amylase inhibitor로서의 효과가 더욱 큰 것으로 확인되었다. 따라서 이들 성분이 무엇인가를 규명하기 위한 추후의 연구가 필요하며, 식후 혈당조절제로서의 그 유용성을 확인하기 위해서는 in vivo 에서 혈당 저하효과에 관한 연구가 필요한 것으로 사료된다.
- 물추출건조물과 건조분말의 경우 에탄올추출물보다 꽃과 잎의 효소활성 저해율이 낮았다. 이러한 결과로 볼 때 메밀 꽃과 잎 추출건조물은 메밀 줄기 및 곡립 추출 건조물과 비교해서 효소활성 저해율이 높게 나타났으며, 물추출이나 건조분말보다 100%, 40% 에탄올을 이용했을 때 추출건조물의 효소 저해율이 더욱 큰 것으로 나타나 이들 추출건조물은 식후 혈당조절제로 이용 가능성이 기대되는 소재로 사료된다.
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