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문제 정의
- 77%로 유압식 균질기를 통과시켰을 때 에멀젼의 포접 효율은 높았으나 두 처리구 모두 매우 우수한 에멀젼을 형성하지는 못하였다. 본 실험에서는 포접 효율을 보고자 한 것이 아니고 에멀젼의 열 안정성을 확인하고자 하는 것이 목적이었기 때문에 포접 효율을 높이기 위한 유화제 선택에 대한 연구는 더 필요하다.
- 본 실험에서는 혈관계 질환 및 심혈관계 질환의 예방 및 항산화 효과가 우수한 메밀의 성분 중 루틴 및 polyphenol을 추출하기 위하여 메밀을 발아하여 루틴 함량을 높여 루틴 및 polyphenol 성분을 추출하고, 루틴이 가열에 의해 감소된다는 문제점을 해결하기 위해 루틴과 polyphenol이 다량 함유된 발아 메밀 추출물을 에멀젼으로 제조하여 열에 대해 불안정한 루틴에 열 안정성을 부여하여 그 활용도를 높이는데 목표가 있다.
가설 설정
- 1)Stability of emulsion passed through homo mixer.
- 2)Values with different superscript letters (a-f) in the same column are significantly different at α=0.05.
- 2)Values with different superscript letters are significantly different at α=0.05.
- 2)Values with different superscript letters in the same column are significantly different at α=0.05.
- 3)Values with different superscript letters (A-C) in the same row are significantly different at α=0.05.
- B: water contain 2% acetic acid.
제안 방법
- Homo mixer를 이용하여 균질한 액 1 L를 취하여 homo mixer를 통과시킨 에멀젼 시료로 사용하였다. Homo mixer로 균질한 액을 유압식 균질기를 이용하여 250 kg/cm2 압력에서 3분간 유압 균질하여 에멀젼을 제조하였다. 발아 메밀 농축액의 포접효율은 아래 식을 이용하여 계산하였다.
- 발아 메밀로부터 polyphenol 추출은 일자별 추출과 대량 추출로 나눠지는데, 일자별 추출에서는 재배한 메밀을 2일 간격으로 추출하였다. 각 재배 방법별 메밀 싹을 1 g씩 칭량하여 100℃의 물에서 30초간 blanching 한 후 시료 1 g당 15 mL의 50% 주정을 혼합하여 test tube에 넣어 50℃에서 150분간 초음파 추출하고 진공 여과기를 이용하여 1차 추출액을 제조하였고, 추출액에 함유된 polyphenol 함량을 측정하였다. 이때 실험은 4회 반복하여 평균과 표준편차로 표시하였다.
- 발아 메밀에서 루틴을 추출하는 방법은 6 cm 발아 메밀을 처리별로 1 g씩 취하여 초음파 처리하여 추출하였다. 각 처리 방법은 발아 후 파쇄한 처리구, 발아 후 100℃에서 30초간 blanching 한 후 파쇄한 처리구, 발아 후 100℃에서 30초간 blanching 한 후 건조하여 분말로 한 처리를 시료의 처리 방법으로 하였다. 각 시료의 처리 방법에 50% ethanol과 95% ethanol을 이용하여 150분간 초음파 처리하여 여과한 액을 루틴의 HPLC 분석용 시료로 사용하였다.
- 각각의 추출방법별로 제조한 발아 메밀 추출물을 membrane filter(0.45 μm)로 여과한 다음 HPLC(YoungLin 9001, Younglin Instrument, Anyang, Korea)로 분석을 수행하였다.
- 균질기 종류를 달리하였을 때 제조된 에멀젼의 열처리 온도와 시간에 대한 안정성을 반응표면분석을 통하여 경향을 분석하였다(Table 9). Ilangantileke 등(19)은 R2 값이 적어도 0.
- 대량 추출에서는 얻어진 메밀 싹을 모두 칭량하여 100℃의 물에서 30초간 blanching 한 후 얻어지는 시료 무게의 3배에 해당되는 50% 주정을 혼합하여 500 mL 비커에 넣고 50℃에서 150분간 초음파 추출하고 진공 여과기를 이용하여 1차 추출물을 얻고, 1차 추출물의 잔여물에 2배에 해당하는 양의 주정을 혼합하여 다시 50℃에서 150분간 초음파 추출하고 진공 여과하여 2차 추출액을 얻었다. 1차 추출액과 2차 추출액을 함하여 진공농축기를 이용하여 고형분 함량을 60%로 하여 냉장 보관하면서 에멀젼 제조에 사용하였다.
- 메밀은 총 3가지 방법으로 재배하였다. 우선 공통적으로 겉껍질을 제거한 메밀을 2시간 물에 불린 다음 채반에 탈지면과 냅킨을 깔고 그 위에 깔아준 후 20℃인큐베이터에서 재배하는 방법, 상온에서 재배기에 재배하는 방법과 스티로폼 상자에 흙을 깔고 그 위에 뿌려 재배하는 방법을 사용하였다.
- 메밀을 발아시키는 방법으로는 전 실험의 결과를 고려하여 흙 재배 방법을 선택하여, 50% ethanol을 이용하여 50℃에서 150분간 대량 추출하여 고형분 함량이 60%가 되도록 농축한 발아 메밀 추출액을 에멀젼 제조에 사용하였다. 에멀젼의 발아 메밀 추출액의 포접 효율은 에멀젼을 원심분리 한 후 상등액을 여과하여 polyphenol 함량을 측정하여 포접 효율을 측정하였다.
- 본 실험에서 발아 메밀 농축액의 에멀젼 제조 방법은 Kim 등(17)의 방법을 응용하여 제조하였다. 발아 메밀 추출 농축액을 이용한 에멀젼은 대두레시틴(2%), 50% ethanol과 물(1:1) 혼합물, 60% 고형분을 함유한 발아 메밀 추출 농축액(고형분 함량이 전체 유화액의 1%가 되도록 함), glycerin(Almax-2070 2%)을 비커에 넣고 homo mixer를 이용하여 4,000 rpm에서 10분간 균질하였다. Homo mixer를 이용하여 균질한 액 1 L를 취하여 homo mixer를 통과시킨 에멀젼 시료로 사용하였다.
- 발아 메밀 추출액 에멀젼의 열 안정성은 homo mixer를 통과한 유화액과 유압식 균질기를 통과시킨 두 가지 에멀젼의 열 안정성을 측정하였다. 에멀젼의 열 안정성 측정을 위한 실험 디자인은 반응표면 분석법(RSM)을 이용하였다.
- 발아 메밀로부터 polyphenol 추출은 일자별 추출과 대량 추출로 나눠지는데, 일자별 추출에서는 재배한 메밀을 2일 간격으로 추출하였다. 각 재배 방법별 메밀 싹을 1 g씩 칭량하여 100℃의 물에서 30초간 blanching 한 후 시료 1 g당 15 mL의 50% 주정을 혼합하여 test tube에 넣어 50℃에서 150분간 초음파 추출하고 진공 여과기를 이용하여 1차 추출액을 제조하였고, 추출액에 함유된 polyphenol 함량을 측정하였다.
- 발아 메밀에서 루틴을 추출하는 방법은 6 cm 발아 메밀을 처리별로 1 g씩 취하여 초음파 처리하여 추출하였다. 각 처리 방법은 발아 후 파쇄한 처리구, 발아 후 100℃에서 30초간 blanching 한 후 파쇄한 처리구, 발아 후 100℃에서 30초간 blanching 한 후 건조하여 분말로 한 처리를 시료의 처리 방법으로 하였다.
- 메밀 발아 수율은 메밀 종자 40 g에서 재배 방법을 각각 달리하여 얻어진 메밀 싹의 g을 백분율(%)로 하여 3반복한 결과를 평균과 편차로 표시하였다. 발아 일자에 따른 메밀싹의 길이는 재배 방법에 따라 발아한 메밀 싹 20개를 무작위로 표본 추출하여 길이를 평균과 편차로 표시하였다.
- 본 실험에서 발아 메밀 농축액의 에멀젼 제조 방법은 Kim 등(17)의 방법을 응용하여 제조하였다. 발아 메밀 추출 농축액을 이용한 에멀젼은 대두레시틴(2%), 50% ethanol과 물(1:1) 혼합물, 60% 고형분을 함유한 발아 메밀 추출 농축액(고형분 함량이 전체 유화액의 1%가 되도록 함), glycerin(Almax-2070 2%)을 비커에 넣고 homo mixer를 이용하여 4,000 rpm에서 10분간 균질하였다.
- 메밀을 발아시키는 방법으로는 전 실험의 결과를 고려하여 흙 재배 방법을 선택하여, 50% ethanol을 이용하여 50℃에서 150분간 대량 추출하여 고형분 함량이 60%가 되도록 농축한 발아 메밀 추출액을 에멀젼 제조에 사용하였다. 에멀젼의 발아 메밀 추출액의 포접 효율은 에멀젼을 원심분리 한 후 상등액을 여과하여 polyphenol 함량을 측정하여 포접 효율을 측정하였다.
- 5 mL를 취하여 phenol 정량법과 같은 방법으로 발색시킨 후 765 nm에서 흡광도를 측정하여 phenol 함량으로 하였다. 열 안정성은 열처리에 의해 노출된 polyphenol 함량을 측정하여 아래와 같은 식을 이용하여 열 안정성을 측정하였다.
- 온도와 시간을 달리하여 처리한 에멀젼을 15,000 rpm에서 10분간 원심분리 한 다음 상등액을 수거한 후 수거한 상등액 0.5 mL를 취하여 phenol 정량법과 같은 방법으로 발색시킨 후 765 nm에서 흡광도를 측정하여 phenol 함량으로 하였다. 열 안정성은 열처리에 의해 노출된 polyphenol 함량을 측정하여 아래와 같은 식을 이용하여 열 안정성을 측정하였다.
- 메밀은 총 3가지 방법으로 재배하였다. 우선 공통적으로 겉껍질을 제거한 메밀을 2시간 물에 불린 다음 채반에 탈지면과 냅킨을 깔고 그 위에 깔아준 후 20℃인큐베이터에서 재배하는 방법, 상온에서 재배기에 재배하는 방법과 스티로폼 상자에 흙을 깔고 그 위에 뿌려 재배하는 방법을 사용하였다. 인큐베이터와 흙에서 재배하는 방법은 하루에 한 번만 촉촉이 젖을 정도의 물만 주었고, 재배기에서 재배하는 경우에는 2일에 한 번 물을 갈아주었다.
대상 데이터
- 발아 메밀 추출 농축액을 이용한 에멀젼은 대두레시틴(2%), 50% ethanol과 물(1:1) 혼합물, 60% 고형분을 함유한 발아 메밀 추출 농축액(고형분 함량이 전체 유화액의 1%가 되도록 함), glycerin(Almax-2070 2%)을 비커에 넣고 homo mixer를 이용하여 4,000 rpm에서 10분간 균질하였다. Homo mixer를 이용하여 균질한 액 1 L를 취하여 homo mixer를 통과시킨 에멀젼 시료로 사용하였다. Homo mixer로 균질한 액을 유압식 균질기를 이용하여 250 kg/cm2 압력에서 3분간 유압 균질하여 에멀젼을 제조하였다.
- 각 처리 방법은 발아 후 파쇄한 처리구, 발아 후 100℃에서 30초간 blanching 한 후 파쇄한 처리구, 발아 후 100℃에서 30초간 blanching 한 후 건조하여 분말로 한 처리를 시료의 처리 방법으로 하였다. 각 시료의 처리 방법에 50% ethanol과 95% ethanol을 이용하여 150분간 초음파 처리하여 여과한 액을 루틴의 HPLC 분석용 시료로 사용하였다.
- 5 mL를 시험관에 넣은 다음 혼합하여 실온에 30분간 방치한 후 765 nm에서 흡광도를 측정하였다. 루틴은 polyphenol 화합물인 flavonoids의 일종이므로 본 실험에서는 polyphenol 정량을 위한 표준물질로 rutin을 사용하였다. 이때 실험은 4회 반복하여 평균과 표준편차로 표시하였다.
- 메밀은 2013년산 겉껍질을 제거한 메밀을 시장에서 구입하였고, 실험에 사용된 표준물질로서 루틴은 Acros Organics사(Pittsburgh, PA, USA)로부터 구입하였으며, 메밀에서 루틴 및 polyphenol을 추출하기 위하여 사용한 50% 주정은 (주)내국양조(Nonsan, Korea) 제품을 사용하였다. 유화제는 대두레시틴(Lipoid Co.
- 발아 메밀 추출 농축액의 에멀젼 제조에 사용된 유화제로는 친유성 유화제로 식품산업에서 저렴하며 안전한 것으로 인정되어 오래 전부터 사용된 천연 유화제로 알려진 대두레시틴과 친수성 유화제로는 Almax-2070을 사용하였다. Almax-2070은 글리세린지방산에스테르로써 HLB 값이 3.
- 유화제는 대두레시틴(Lipoid Co., Ltd., Köln, Germany)과 Almax2070(Ilshin Wells Co., Ltd., Seoul, Korea)을 사용하였다.
데이터처리
- 각 시료 및 처리 간의 유의성 검정은 SPSS 프로그램(ver 21, IBM Company, Chicago, IL, USA)을 이용하여 분산분석 후 Duncan's multiple range test를 실시하였으며(P<0.05), 반응표면분석은 Minitab 14 프로그램(Minitab Inc., State College, PA, USA)을 이용하여 분석하였다.
- 메밀 발아 수율은 메밀 종자 40 g에서 재배 방법을 각각 달리하여 얻어진 메밀 싹의 g을 백분율(%)로 하여 3반복한 결과를 평균과 편차로 표시하였다. 발아 일자에 따른 메밀싹의 길이는 재배 방법에 따라 발아한 메밀 싹 20개를 무작위로 표본 추출하여 길이를 평균과 편차로 표시하였다.
- 각 재배 방법별 메밀 싹을 1 g씩 칭량하여 100℃의 물에서 30초간 blanching 한 후 시료 1 g당 15 mL의 50% 주정을 혼합하여 test tube에 넣어 50℃에서 150분간 초음파 추출하고 진공 여과기를 이용하여 1차 추출액을 제조하였고, 추출액에 함유된 polyphenol 함량을 측정하였다. 이때 실험은 4회 반복하여 평균과 표준편차로 표시하였다.
- , Palo Alto, CA, USA), 이동상으로 A용매는 2% acetic acid를 함유한 45% acetonitrile, B용매는 2% acetic acid를 함유한 증류수를 선형농도구배(Table 1)를 이용하여 유속은 1 mL, 시료 주입량은 20 μL, 온도는 25℃, 분석 파장은 355 nm에서 분석하였다(15). 정량은 검량선을 이용하여 실시하였으며, 모든 실험은 4반복하여 평균과 표준편차로 표시하였다.
이론/모형
- 에멀젼의 encapsulation 정도를 빨리 확인할 수 있는 방법으로 phenol 정량법(16)을 이용하여 분석하였다. Polyphenol 성분 정량은 발아 추출물 0.
- 발아 메밀 추출액 에멀젼의 열 안정성은 homo mixer를 통과한 유화액과 유압식 균질기를 통과시킨 두 가지 에멀젼의 열 안정성을 측정하였다. 에멀젼의 열 안정성 측정을 위한 실험 디자인은 반응표면 분석법(RSM)을 이용하였다. 이때 RSM 조건은 Table 2에 표시하였다.
- 정량적인 인자인 열처리 시간과 온도, 반응변수인 열 안정성 사이의 관계를 모형화하기 위하여 중심합성(central composite)법을 이용하여 반응표면분석을 실시한 후 그 결과를 Table 8에 표시하였다. 열 안정성을 분석한 결과 homo mixer만을 통과한 에멀젼은 유압식 균질기를 통과한 에멀젼에 비하여 열에 대하여 불안정한 것을 알 수 있었다.
성능/효과
- 유화는 homo mixer를 통과한 후 에멀젼을 일부 수집하고, 나머지는 유압식 균질기를 통과시켜 에멀젼을 제조하였다. Homo mixer와 유압식 균질기를 각각 통과시킨 에멀젼의 포접 효율을 측정한 결과(Table 7) homo mixer와 유압식 균질기를 통과한 에멀젼의 포접 효율은 각각 65.92%와 67.77%로 유압식 균질기를 통과시켰을 때 에멀젼의 포접 효율은 높았으나 두 처리구 모두 매우 우수한 에멀젼을 형성하지는 못하였다. 본 실험에서는 포접 효율을 보고자 한 것이 아니고 에멀젼의 열 안정성을 확인하고자 하는 것이 목적이었기 때문에 포접 효율을 높이기 위한 유화제 선택에 대한 연구는 더 필요하다.
- 각 발아 방법에 따른 polyphenol 함량을 측정한 결과, 재배 방법에 따른 차이가 있었으며, 재배 일수 경과에 따라 polyphenol의 함량이 증가하였고 8일째부터 유의차를 나타내며 높아지는 것을 알 수 있었다. 본 실험의 방법과 일치하지는 않지만 Maeng 등(3)과 Kim 등(18)은 메밀 종자에서보다 메밀 싹에서 rutin의 함량이 10배 이상 증가한다고 보고하였고, 본 실험 결과에서도 발아에 의해 polyphenol 함량이 증가한 것을 기초로 하여 메밀 종자보다 발아를 통하여 얻은 메밀 싹을 이용하는 것이 루틴 함량 혹은 polyphenol 함량을 높이는 데 효과적인 것을 알 수 있었다.
- 유압식 균질기를 통과한 에멀젼은 온도가 올라가고 시간이 지나면 안정성이 감소하기는 하지만 homo mixer를 통과한 에멀젼에 비하여 시간에 대하여는 유사하게 안정성이 떨어지지만 온도에 대하여는 65℃와 90℃ 사이에서 비교적 서서히 안정성이 감소하는 경향을 나타내었다. 따라서 메밀에서 추출물의 열 안정성 유지를 위해서는 유압식 균질기를 통과하여 encapsulation 효율을 높이는 것이 열 안정성 유지에 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 확인 결과 95% ethanol을 이용해 직접 추출하는 것보다 50% ethanol을 이용해 추출하는 것이 효율적이었다(Table 5). 또한 루틴 추출 효율은 발아 메밀을 blanching 후 파쇄하여 50% ethanol을 이용해 추출하는 것이 가장 효율적인 것을 알 수 있었다. Choung(15)이 메밀 경엽과 줄기를 50℃ 화력건조기에 건조한 후 분쇄하여 50% ethanol로 50℃에서 추출시간을 180분으로 하였을 때 634.
- 루틴은 각각 50% ethanol과 95% ethanol을 이용하여 초음파 추출법으로 실험을 하여 루틴 함량이 가장 높은 추출 방법을 확인하였다. 확인 결과 95% ethanol을 이용해 직접 추출하는 것보다 50% ethanol을 이용해 추출하는 것이 효율적이었다(Table 5).
- 각 재배 방법에 따라 발아한 일자별 메밀 싹의 polyphenol 함량을 비교한 결과는 Table 6과 같다. 메밀을 인큐베이터를 이용하여 발아 일수별로 polyphenol 함량을 측정하였을 때, 메밀 종자일 때 0.99 mg/g이며 2일과 4일 후에는 각각 3.47 mg/g, 12.32 mg/g을 나타내어 메밀 종자일 때보다 6일째에서 polyphenol 함량이 약 8배 증가하였으나 이 기간 이후로는 곰팡이가 발생하여 측정이 불가능하였다. 재배기를 이용하여 발아 일자별로 polyphenol 함량을 측정하였을 때 2일, 4일, 6일 후에는 각각 0.
- 발아 일자에 따른 메밀 싹의 길이는 재배 방법에 따라 발아한 메밀을 cm로 측정한 값으로 Table 4와 같다. 발아 방법에 따른 싹의 길이는 흙 재배 방법이 가장 우수하였고, 재배기 방법이 가장 늦은 것을 알 수 있었다. 인큐베이터를 이용하여 발아할 때에는 곰팡이가 자주 피어 메밀 발아 방법으로는 타탕하지 않음을 알 수 있다.
- 인큐베이터를 이용하여 발아할 때에는 곰팡이가 자주 피어 메밀 발아 방법으로는 타탕하지 않음을 알 수 있다. 본 실험 결과에서는 흙을 이용하여 발아할 때 발아 수율도 높고 싹의 길이도 가장 길어 흙 재배 방법의 효율이 좋은 것을 알 수 있었다.
- 정량적인 인자인 열처리 시간과 온도, 반응변수인 열 안정성 사이의 관계를 모형화하기 위하여 중심합성(central composite)법을 이용하여 반응표면분석을 실시한 후 그 결과를 Table 8에 표시하였다. 열 안정성을 분석한 결과 homo mixer만을 통과한 에멀젼은 유압식 균질기를 통과한 에멀젼에 비하여 열에 대하여 불안정한 것을 알 수 있었다. 그 이유는 homo mixer만을 통과한 에멀젼은 엉성하게 유화가 이루어진 상태이기 때문에 유압식 균질기를 통과하여 에멀젼이 단단하게 형성된 것보다 외부 조건에 쉽게 변화하는 것으로 판단된다.
- 1에서 homo mixer를 통과한 에멀젼은 온도가 올라가고 시간이 지나면 급속한 속도로 안정성이 감소하는 경향을 나타내었다. 유압식 균질기를 통과한 에멀젼은 온도가 올라가고 시간이 지나면 안정성이 감소하기는 하지만 homo mixer를 통과한 에멀젼에 비하여 시간에 대하여는 유사하게 안정성이 떨어지지만 온도에 대하여는 65℃와 90℃ 사이에서 비교적 서서히 안정성이 감소하는 경향을 나타내었다. 따라서 메밀에서 추출물의 열 안정성 유지를 위해서는 유압식 균질기를 통과하여 encapsulation 효율을 높이는 것이 열 안정성 유지에 효과가 있음을 알 수 있었다.
- 이들의 결과에서 볼 때, 본 실험 결과 발아 메밀을 blanching 후 파쇄하여 50% ethanol을 이용해 추출한 결과 값이 890.8 μg/g으로 Choung(15)의 실험 결과보다 약 1.4배 루틴 함량이 더 많았음을 알 수 있었다.
- 32 mg/g을 나타내어 메밀 종자일 때보다 6일째에서 polyphenol 함량이 약 8배 증가하였으나 이 기간 이후로는 곰팡이가 발생하여 측정이 불가능하였다. 재배기를 이용하여 발아 일자별로 polyphenol 함량을 측정하였을 때 2일, 4일, 6일 후에는 각각 0.88 mg/g, 0.71 mg/g으로 떨어지다가 6일 후에는 1.19 mg/g, 8일 후에는 3.14 mg/g으로 polyphenol 함량이 메밀 종자일 때보다 약 3배로 증가하였다. 재배기를 이용하여 발아하였을 경우 다른 발아 방법들에 비해 polyphenol 함량이 다소 적은 경향이 보였다.
- Table 9에 표시한 이차 다항식(second order polynomials)에서 각각의 변인 앞에 있는 상수는 변인의 중요성을 나타내는 것으로 상수의 숫자 값이 클수록 최적화에 우세한 영향을 미친다는 것을 의미한다(20). 표시된 반응표면분석 결과 homo mixer를 통과한 에멀젼과 유압식 균질기를 통과한 에멀젼 두 처리의 이차 다항식에서 열처리 시간에 해당하는 상수의 값이 각각 17.1338과 36.0722로 열처리 온도 상수 값보다 더 큰 것을 알 수 있었고, 이 결과는 열처리 온도가 높은 것보다 열처리 시간이 길수록 에멀젼의 안정도는 낮아진다고 예측할 수 있다.
- 루틴은 각각 50% ethanol과 95% ethanol을 이용하여 초음파 추출법으로 실험을 하여 루틴 함량이 가장 높은 추출 방법을 확인하였다. 확인 결과 95% ethanol을 이용해 직접 추출하는 것보다 50% ethanol을 이용해 추출하는 것이 효율적이었다(Table 5). 또한 루틴 추출 효율은 발아 메밀을 blanching 후 파쇄하여 50% ethanol을 이용해 추출하는 것이 가장 효율적인 것을 알 수 있었다.
- 재배기를 이용하여 발아하였을 경우 다른 발아 방법들에 비해 polyphenol 함량이 다소 적은 경향이 보였다. 흙을 이용하여 재배한 발아 메밀을 발아 일수별로 polyphenol 함량을 측정했을 때, 메밀 종자일 때 0.99 mg/g, 2일, 4일, 6일, 8일에서 각각 3.04 mg/g, 2.90 mg/g, 5.12 mg/g, 10.66 mg/g으로 8일 후에는 메밀 종자 polyphenol 함량이 약 11배 증가하였다.
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