인간 HepG2 세포에서 더덕 및 도라지 에틸아세테이트 분획물의 항산화 효과에 의한 세포보호 효과 Cytoprotective Effect by Antioxidant Activity of Codonopsis lanceolata and Platycodon grandiflorum Ethyl Acetate Fraction in Human HepG2 Cells원문보기
이 연구의 목적은 더덕 및 도라지 에틸아세테이트 분획물(CLEA나 PGEA)이 다양한 항산화 시스템을 가동시켜 sodium nitroprusside(SNP)에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대항하여 세포를 보호해 줄 수 있을지 연구하는 것이다. 0.5 mM의 SNP를 HepG2 세포주에 24시간 동안 노출시켰을 때 세포 생존율이 감소하였으나, CLEA와 PGEA 천처리에 의해 SNP 노출에 의한 세포 생존율 감소가 저해되었다. 또한 항산화 시스템들 발현에 미치는 CLEA와 PGEA의 영향을 RT-PCR로 알아보았다. Catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD) 그리고 metallothionein (MT)-1A mRNA 수준이 CLEA를 세포에 24시간 동안 처리한 후 증가하였고, Mn superoxide dismutase, catalase, G6PD, MT-1A 와 MT-2A mRNA 수준이 PGEA 처리에 의해 증가하였다. 우리는 CLEA와 PGEA가 아마 다양한 항산화 시스템들을 증가시키는 간접적인 항산화 효과를 나타내며, 이들 효과들이 산화적 스트레스로부터 세포를 보호해 줄 것이라 추정하였다.
이 연구의 목적은 더덕 및 도라지 에틸아세테이트 분획물(CLEA나 PGEA)이 다양한 항산화 시스템을 가동시켜 sodium nitroprusside(SNP)에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대항하여 세포를 보호해 줄 수 있을지 연구하는 것이다. 0.5 mM의 SNP를 HepG2 세포주에 24시간 동안 노출시켰을 때 세포 생존율이 감소하였으나, CLEA와 PGEA 천처리에 의해 SNP 노출에 의한 세포 생존율 감소가 저해되었다. 또한 항산화 시스템들 발현에 미치는 CLEA와 PGEA의 영향을 RT-PCR로 알아보았다. Catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD) 그리고 metallothionein (MT)-1A mRNA 수준이 CLEA를 세포에 24시간 동안 처리한 후 증가하였고, Mn superoxide dismutase, catalase, G6PD, MT-1A 와 MT-2A mRNA 수준이 PGEA 처리에 의해 증가하였다. 우리는 CLEA와 PGEA가 아마 다양한 항산화 시스템들을 증가시키는 간접적인 항산화 효과를 나타내며, 이들 효과들이 산화적 스트레스로부터 세포를 보호해 줄 것이라 추정하였다.
The objective of this study was to determine whether Codonopsis lanceolata or Platycodon grandiflorum ethyl acetate fraction (CLEA or PGEA) protect cells against sodium nitroprusside (SNP)-induced oxidative stress via the expression of various antioxidant systems. The HepG2 cells exposed for 24 hr t...
The objective of this study was to determine whether Codonopsis lanceolata or Platycodon grandiflorum ethyl acetate fraction (CLEA or PGEA) protect cells against sodium nitroprusside (SNP)-induced oxidative stress via the expression of various antioxidant systems. The HepG2 cells exposed for 24 hr to 0.5 mM SNP showed a reduction in the cell viability by an MTT assay. Pretreatment with CLEA and PGEA resulted in an inhibition of SNP-induced cell death. In addition, the effects of CLEA and PGEA on the expression of antioxidant systems via RT-PCR analyses was assessed. The levels of catalase (CAT), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and metallothionein (MT)-1A mRNA were increased after 24 hr of CLEA exposure. The levels of Mn superoxide dismutase CAT, G6PD, MT-1A, and MT-2A mRNA were increased after PGEA treatment. In conclusion, CLEA and PGEA exert indirect antioxidant effects, perhaps via the induction of a variety of antioxidant systems which, may protect cells against oxidative stress.
The objective of this study was to determine whether Codonopsis lanceolata or Platycodon grandiflorum ethyl acetate fraction (CLEA or PGEA) protect cells against sodium nitroprusside (SNP)-induced oxidative stress via the expression of various antioxidant systems. The HepG2 cells exposed for 24 hr to 0.5 mM SNP showed a reduction in the cell viability by an MTT assay. Pretreatment with CLEA and PGEA resulted in an inhibition of SNP-induced cell death. In addition, the effects of CLEA and PGEA on the expression of antioxidant systems via RT-PCR analyses was assessed. The levels of catalase (CAT), glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) and metallothionein (MT)-1A mRNA were increased after 24 hr of CLEA exposure. The levels of Mn superoxide dismutase CAT, G6PD, MT-1A, and MT-2A mRNA were increased after PGEA treatment. In conclusion, CLEA and PGEA exert indirect antioxidant effects, perhaps via the induction of a variety of antioxidant systems which, may protect cells against oxidative stress.
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문제 정의
따라서 세포 내 항산화 방어시스템을 증가시킬 수 있는 항산화 물질 탐색 연구에서 쥐의 간과 인간의 간세포인 HepG2 세포를 모델로 사용하고 있으며(25-27) 본 연구에서도 더덕 및 도라지를 70% 에탄올로 추출한 후 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물로 계통 분획하여 얻은 시료 중 폴리페놀 함량이 가장 높았던 에틸아세테이트 분획물이 HepG2 세포내 내인성 방어 시스템을 증가시켜 산화적 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있는지 주요 항산화 유전자 발현 및 세포 생존율을 측정함으로써 알아보았다. 또한 이들 항산화 활성 탐색을 통해 천연 기능성 식의약 소재개발을 위한 기초 자료를 얻고자 하였다.
이 연구의 목적은 더덕 및 도라지 에틸아세테이트 분획물(CLEA 나 PGEA)이 다양한 항산화 시스템을 가동시켜 sodium nitroprusside(SNP)에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대항하여 세포를 보호해 줄 수 있을지 연구하는 것이다. 0.
가설 설정
Catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD) 그리고 metallothionein (MT)-1A mRNA 수준이 CLEA를 세포에 24시간 동안 처리한 후 증가하였고, Mn superoxide dismutase, catalase, G6PD, MT-1A 와 MT2A mRNA 수준이 PGEA 처리에 의해 증가하였다. 우리는 CLEA 와 PGEA가 아마 다양한 항산화 시스템들을 증가시키는 간접적인 항산화 효과를 나타내며, 이들 효과들이 산화적 스트레스로부터 세포를 보호해 줄 것이라 추정하였다.
제안 방법
Table 2와 같은 조건에서 SOD1, SOD2, CAT, GPx, GR, GCS, hGSTA1, G6PD, MT-1A 및 MT-2A의 mRNA 의 발현 정도를 측정하였고, 18S를 내부 표준 유전자로 사용하였다. PCR 최종 산물은 0.002% ethidium bromide가 첨가된 1.2% agarose gel에 100V에서 30분간 전기영동 한 후 image analysis wokrstation(SlimlineTM series, Spectra Services Inc., Ontario, NY, USA)를 이용하여 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 SigmaGel(Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA) 소프트웨어에 의해 분석 정량하였다.
실험에 사용한 primer 염기서열은 출판되어진 것을 사용하였고(29), Table 1에 나타내었다. Table 2와 같은 조건에서 SOD1, SOD2, CAT, GPx, GR, GCS, hGSTA1, G6PD, MT-1A 및 MT-2A의 mRNA 의 발현 정도를 측정하였고, 18S를 내부 표준 유전자로 사용하였다. PCR 최종 산물은 0.
각 유전자 발현을 알아보기 위하여 PCR을 실시하였다. 실험에 사용한 primer 염기서열은 출판되어진 것을 사용하였고(29), Table 1에 나타내었다.
, Ontario, NY, USA)를 이용하여 유전자 발현 정도를 알아보았다. 그 밴드의 강도를 SigmaGel(Jandel Scientific, San Rafael, CA, USA) 소프트웨어에 의해 분석 정량하였다.
즉, 각 well에 MTT 용액(5 mg/ mL)을 FBS와 항생제가 첨가되어 있지 않은 MEM 배지의 10분의 1을 가해주고, 5% CO2와 37℃에서 4시간 더 배양하여 MTT 를 환원시켜 생성된 formazan이 배지에 따라 나가지 않도록 배지를 조심스럽게 제거하였다. 남아 있는 배지를 완전히 제거하기 위해 실온에서 30분간 방치한 후 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 이용하여 용해시킨 시료를 Micro-Reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 시 공시료는 DMSO로 하였고, 세포의 생존율은 다음과 같이 계산하였다.
더덕 및 도라지 에틸아세테이트 추출물이 세포내 항산화 방어 시스템인 4개의 주요 효소들(SOD1, SOD2, CAT와 GPx), glutathione 대사에 관여하는 효소들(GR, GCS, hGSTA1과 G6PD) 및 그 외의 항산화 유전자(MT-1A와 MT-2A)의 mRNA 발현에 미치는 영향력을 RT-PCR로 알아본 결과를 Fig. 2-4에 나타내었다. 더덕 에틸아세티이트 분획물을 100 µg/mL로 투여 시 CAT의 mRNA 의 수준이 시료를 첨가하지 않은 대조군에 비해 유의적으로 증가하였으나 SOD1, SOD2 및 GPx의 mRNA는 유의적으로 변하지 않 았다.
정상적인 조건의 세포 내에서 생성된 활성산소종은 간조직에 풍부한 내인성 항산화제에 의해 소거될 수 있다(24). 따라서 세포 내 항산화 방어시스템을 증가시킬 수 있는 항산화 물질 탐색 연구에서 쥐의 간과 인간의 간세포인 HepG2 세포를 모델로 사용하고 있으며(25-27) 본 연구에서도 더덕 및 도라지를 70% 에탄올로 추출한 후 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 그리고 물로 계통 분획하여 얻은 시료 중 폴리페놀 함량이 가장 높았던 에틸아세테이트 분획물이 HepG2 세포내 내인성 방어 시스템을 증가시켜 산화적 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있는지 주요 항산화 유전자 발현 및 세포 생존율을 측정함으로써 알아보았다. 또한 이들 항산화 활성 탐색을 통해 천연 기능성 식의약 소재개발을 위한 기초 자료를 얻고자 하였다.
5 mM의 SNP를 HepG2 세포주에 24시간 동안 노출시켰을 때 세포 생존율이 감소하였으나, CLEA와 PGEA 천처리에 의해 SNP 노출에 의한 세포 생존율 감소가 저해되었다. 또한 항산화 시스템들 발현에 미치는 CLEA와 PGEA의 영향을 RT-PCR로 알아보았다. Catalase, glucose-6-phosphate dehydrogenase(G6PD) 그리고 metallothionein (MT)-1A mRNA 수준이 CLEA를 세포에 24시간 동안 처리한 후 증가하였고, Mn superoxide dismutase, catalase, G6PD, MT-1A 와 MT2A mRNA 수준이 PGEA 처리에 의해 증가하였다.
세척한 RNA는 건조 후 0.1% DEPC 증류수 995 µL에 용해하여 분광광도계(GE healthcare, Pischaway, NJ, USA)로 흡광도를 측정하여 RT-PCR에 이용하였다.
1은 HepG2 세포에 더덕 및 도라지 에틸아세테이트 추출물을 처리한 후 세포내에서 NO를 생성시키는 SNP를 처리하여 산화적 스트레스를 유발시켰을 때 세포 생존율에 미치는 영향을 나타내었다. 아무 것도 처리하지 않은 무처리군, SNP를 처리한 대조군 그리고 대조군에 더덕 및 도라지 에틸아세테이트 분획물을 농도별로 처리한 실험군을 비교하였다. 그 결과 무처리군의 세포 생존율을 100%라고 보았을 때, 대조군의 세포 생존률은 52.
배양이 끝난 세포의 생존율은 Chung 등(28)이 사용한 MTT 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 즉, 각 well에 MTT 용액(5 mg/ mL)을 FBS와 항생제가 첨가되어 있지 않은 MEM 배지의 10분의 1을 가해주고, 5% CO2와 37℃에서 4시간 더 배양하여 MTT 를 환원시켜 생성된 formazan이 배지에 따라 나가지 않도록 배지를 조심스럽게 제거하였다. 남아 있는 배지를 완전히 제거하기 위해 실온에서 30분간 방치한 후 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 이용하여 용해시킨 시료를 Micro-Reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
남아 있는 배지를 완전히 제거하기 위해 실온에서 30분간 방치한 후 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 이용하여 용해시킨 시료를 Micro-Reader(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도 측정 시 공시료는 DMSO로 하였고, 세포의 생존율은 다음과 같이 계산하였다.
대상 데이터
더덕 및 도라지 에틸아세테이트 추출물 처리에 의한 세포내 산화적 스트레스 억제효과 더덕 및 도라지를 70% 에탄올로 추출 후 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물층으로 계통분획하여 폴리페놀 함량을 측정한 결과 에틸아세테이트 층이 가장 많이 함유하고 있었다(결과미제시). 따라서 폴리페놀 함량이 가장 높았던 에틸아세 테이트 층을 실험에 사용하였다. 그리고 더덕 및 도라지의 70%에탄올 추출물의 수율은 각각 37.
본 실험에 사용한 더덕(Codonopsis lanceolata)과 도라지(Platycodon grandiflorum)는 2007년 구룡제약(주)(Cheolwon, Korea)으로 부터 분말형태로 제공받아 시료 100 g에 10배의 70% 에탄올을 가하여 80℃에서 8시간 동안 환류냉각하면서 3회 추출 후 뜨거운 상태에서 감압 여과하여 동결건조시켰다. 분획물의 제조는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물층으로 계통분획한 후 에틸아세테이트 층만 농축 및 동결 건조하여 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
분리한 total RNA를 이용하여 cDNA를 합성하는 역전사 과정에서는 Reverse Transcription System(Invitrogen)을 사용하였다. 즉, 먼저 oligo(dT)15 primer(500 µg/mL) 1 µL와 dNTP mix(10 mM each) 1 µL를 동일량 섞어 PCR 튜브에 넣고 추출한 RNA와 RNase-free 증류수로 최종 부피가 12 µL가 되도록 맞추고 65℃에서 5분 동안 끓인 후 즉시 얼음에서 냉각시켰다.
본 실험에 사용한 더덕(Codonopsis lanceolata)과 도라지(Platycodon grandiflorum)는 2007년 구룡제약(주)(Cheolwon, Korea)으로 부터 분말형태로 제공받아 시료 100 g에 10배의 70% 에탄올을 가하여 80℃에서 8시간 동안 환류냉각하면서 3회 추출 후 뜨거운 상태에서 감압 여과하여 동결건조시켰다. 분획물의 제조는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물층으로 계통분획한 후 에틸아세테이트 층만 농축 및 동결 건조하여 냉동고에 보관하면서 실험에 사용하였다.
인간 간암세포인 HepG2(hepatoblastoma, KCLB No. 88065)는 Korea Cell Line Bank(Seoul, Korea)로부터 구입하여 실험에 사용하였다. HepG2 세포는 24 well plate에 5×104 cells/mL 농도로1 mL씩 각 well에 첨가하여 5% CO2와 37℃ 조건에서 48시간 동안 배양시킨 후 예비실험을 통해 세포 생존율에 영향을 미치지 않는 시료의 농도범위에서 MEM 배지에 농도별로 녹인 시료 1 mL씩 첨가하여 다시 24시간 동안 배양하였다.
데이터처리
NS=Not significantly (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.
a-bMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.
a-cMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.
a-dMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range test.
통계처리 실험 결과는 mean±SD로 표시하였으며 SPSS 프로그램(Version 10.0, SPSS, Chicago, IL, USA)을 이용하여 분산분석(ANOVA)을 실시하였고, 각 측정 평균값 간의 유의성은 p<0.05 수준으로 던컨의 다중범위시험법(Duncan’s multiple range test)으로 검증하였다.
이론/모형
배양이 끝난 세포의 생존율은 Chung 등(28)이 사용한 MTT 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 즉, 각 well에 MTT 용액(5 mg/ mL)을 FBS와 항생제가 첨가되어 있지 않은 MEM 배지의 10분의 1을 가해주고, 5% CO2와 37℃에서 4시간 더 배양하여 MTT 를 환원시켜 생성된 formazan이 배지에 따라 나가지 않도록 배지를 조심스럽게 제거하였다.
성능/효과
이 연구의 목적은 더덕 및 도라지 에틸아세테이트 분획물(CLEA 나 PGEA)이 다양한 항산화 시스템을 가동시켜 sodium nitroprusside(SNP)에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대항하여 세포를 보호해 줄 수 있을지 연구하는 것이다. 0.5 mM의 SNP를 HepG2 세포주에 24시간 동안 노출시켰을 때 세포 생존율이 감소하였으나, CLEA와 PGEA 천처리에 의해 SNP 노출에 의한 세포 생존율 감소가 저해되었다. 또한 항산화 시스템들 발현에 미치는 CLEA와 PGEA의 영향을 RT-PCR로 알아보았다.
그 결과 무처리군의 세포 생존율을 100%라고 보았을 때, 대조군의 세포 생존률은 52.1%로 나타났으며 더덕 에틸아세테이트 분획물을 50 µg/mL 및 100 µg/mL의 농도로 각각 세포에 처리했을 때 HepG2 세포주의 생존율은 77.5% 및 91.4%로써 농도 의존적으로 증가하였다.
따라서 폴리페놀 함량이 가장 높았던 에틸아세 테이트 층을 실험에 사용하였다. 그리고 더덕 및 도라지의 70%에탄올 추출물의 수율은 각각 37.5% 및 44.7%이며 에틸아세테이트 분획물의 수율은 각각 1.9% 및 1.4%였다.
더덕 및 도라지 에틸아세테이트 추출물 처리에 의한 세포내 산화적 스트레스 억제효과 더덕 및 도라지를 70% 에탄올로 추출 후 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물층으로 계통분획하여 폴리페놀 함량을 측정한 결과 에틸아세테이트 층이 가장 많이 함유하고 있었다(결과미제시). 따라서 폴리페놀 함량이 가장 높았던 에틸아세 테이트 층을 실험에 사용하였다.
더덕과 도라지 에틸아세테이트 분획물이 glutathione 대사에 관여하는 효소들의 발현에 어떠한 영향을 미치는지 살펴본 결과, 모두에서 GR, GCS 및 hGSTA1 mRNA의 발현 수준은 유의적으로 변하지 않았으나 G6PD의 경우는 50 µg/ mL 및 100 µg/mL로 세포에 투여했을 때 대조군에 비하여 모두 유의적으로 증가하였다(Fig. 3).
05). 따라서 더덕 및 도라지에틸아세테이트 추출물 처리가 산화적 스트레스로부터 세포를 보호해 주었고, 이와 같은 효과는 저농도에서는 두 추출물이 유사한 결과를 나타냈으나, 고농도에서 도라지보다는 더덕이 더 효과적으로 산화적 스트레스에 의한 세포사멸을 억제하였다.
또한 도라지 에틸아세테이트 분획물을 50 µg/mL 및 100 µg/mL로 세포에 투여했을 때 MT-1A 및 MT2A의 mRNA의 수준이 모두 유의적으로 증가하였으나 더덕 에틸아세테이트 분획물의 경우에는 50 µg/mL로 처리하였을 경우에만 MT-1A의 mRNA 수준이 유의적으로 증가하였다(Fig. 4).
본 실험에서 더덕 에틸아세테이트 분획물 처리에 의해 세포내 G6PD, CAT 및 MT-1A mRNA의 발현 수준이 증가하였고, 도라지 에틸아세테이트 분획물의 경우에는 SOD2, CAT, G6PD, MT1A 및 MT-2A mRNA의 유전자 발현이 증가하였다. 따라서 더덕 및 도라지 에틸아세테이트 분획물은 세포내 항산화 방어 시스템을 가동시키므로 산화적 스트레스로부터 세포를 보호해 줄 것으로 추정된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
활성산소종의 문제점은 무엇인가?
우리나라는 65세 이상의 노인 인구가 증가하면서 노화를 포함한 각종 성인병 발생의 원인이 되고 있는 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)에 대한 관심이 높아지고 있다. 생체 내 정상적인 세포대사과정에서 생성되거나 여러 환경오염 및 화학물질의 노출 등에 의해 생성된 superoxide radical anion(O2•−), hydrogen peroxide(H2O2), hydroxyl radicals(OH•) 등은 체내에서 세포막 손상, DNA 변성, 지질 산화, 단백질 분해 등을 초래하여, 뇌혈관 질환, 암 및 심혈관계 질환 등과 같은 만성질환들의 발생을 초래할 위험성을 증가시키고 있다(1-7).
생체 내에 활성산소로부터 세포를 보호하기 위한 내인성 방어 시스템에는 무엇이 있는가?
그러나 생체 내에는 이러한 활성산소로부터 세포를 보호하기 위한 내인성 방어 시스템인 Cu/Zn superoxide dismutase(SOD1), Mn superoxide dismutase, catalase(CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase(GR), γ-glutamyl-cystein synthetase (GCS), human glutathione-S-transferase(hGSTA1), glucose-6-phosphate-dehydrogenase 및 metallothioneins(MT-1A, MT-2A) 등의 항산화 효소 및 단백질과 외인성 방어 시스템인 tocopherol, vitamin C, carotenoid, flavonoid, glutathione 그리고 합성 항산화제인 BHA, BHT, Troxol-C 등이 있다(8-10).
더덕은 어떤 성분을 많이 함유하고 있는가?
한편 천연자원 중에서 더덕(Codonopsis lanceolata)은 예로부터 식용 및 약용으로 널리 이용되고 있으며 한방에서 폐 기운을 돋워주고 가래를 없애주는 약제로 사용되어 강장, 해열, 거담, 해독 및 배농 등의 질병치료의 목적으로 사용되고 있다(13). 또한 더덕에는 saponin, inulin과 flavonoid 등의 성분을 많이 함유하고 있고 혈청 지질의 감소효과 및 항산화효과 등 여러 가지 생리활성이 있는 것으로 보고되었다(14-17). 도라지(Platycodon grandiflorum)는 한방에서 약재로 사용되기도 하고 일반식용으로도 널리 이용되고 있는 산채식품으로서 triterpenoid계 사포닌, 당질 및 섬유질을 함유하고 있다.
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