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문제 정의
- 본 실험에서는 나노입자화를 통한 생체활용성 증진효과의 탐색을 위해 천연 항발암제재 및 면역제재로 효과가 기대되는 브로콜리 추출물을 이용해 nanoparticle을 제조하였다. 브로콜리 추출 시료 중 초음파를 병행한 60℃ 물 추출 시료 50㎎을 1㎎/㎖의 농도로 증류수에 녹이고, 용매에 녹였다가 건조한 유상 5㎎과 섞은 후 초음파분산기 (VCX 500, Sonics & Materials, CT, USA)를 이용하여 상온에서 2시간 동안 균질화시켜 수용성 나노입자를 제조하였다.
- , 2006) 면에서도 점차 증가하는 추세이다. 하지만 활용가치가 높음에도 나노 기술과 천연물 소재의 fusion technology 기술이 전무한 상태이기 때문에 이러한 두 가지 기술을 접목시켜 새로운 기능성 소재화 및 유용성분의 기능성 증진 효과뿐만 아니라 생체에 적합성을 향상시킬 수 있는 천연 면역제재 개발을 위한 기초자료로 이용하고자 본 연구를 수행하였다.
제안 방법
- ATCC로부터 분양 받은 NK-92MI 세포를 α-MEM배지에 2 mM L-glutamine, 0.2 mM myoinositol, 20 mM folic acid, 10−4 M 2-mercaptoethanol, 12.5% FBS와 12.5% horse serum 첨가하고, 2 × 107 cells/㎖의 농도로 희석시켜 이용하였다.
- Cytokine 분비량 증가를 통한 면역증진 효과의 확인을 위해 면역 T세포의 생육도를 측정하고 cytokine 분비량과 생육 촉진 효과를 비교하였다. Fig.
- Cytokine은 IL-6와 TNF-α의 정량을 Chemicon (USA)사의 IL-6와 TNF-α 정량 kit를 사용하여 측정하였다.
- Hyaluronidase 억제효과는 Rooster Comb에서 형성된 N-acetylglucosamine의 양을 분광광도계로 측정하여 활성을 판단하였다. 0.
- NK 세포의 활성은 시료를 첨가한 면역 T세포의 배양액을 NK 세포에 첨가하여 나타나는 생육도의 변화를 첨가하지 않은 대조군과 비교하여 측정하였다. Table 2는 T세포에 각 시료를 첨가하여 배양한 후 그 배양액을 NK 세포에 첨가하였을 때 나타나는 NK 세포의 활성도를 조건별로 비교하여 나타낸 표이다.
- NK-92MI 세포를 24 well plate에 4~5 × 104 cells/㎖로 900㎕ 씩 분주하고 24시간 후 T세포의 상층액을 각 plate에 100㎕ 씩 투여하고 배양 48시간 후부터 6일 동안 생세포 수를 측정하여 NK-92MI 세포의 활성도를 확인하였다 (Yueran et al., 2003; Cecilia 2002).
- 5에 나타내었다. 각 시료는 5가지의 농도를 준비해서 각 농도에 따른 저해율을 구하여 나타내었다.
- 시료는 각각 10배의 증류수를 이용하여 60℃와 100℃에서 24시간동안 추출하였으며, 60℃ 추출물은 다시 초음파 발생기 (Ultrasonic extraction system, Asia industry, Incheon, Korea)를 이용하여 추출온도에서 60㎑의 초음파로 30분간 초음파 공정을 병행한 것을 이용하였다. 각 시료들은 감압여과 및 농축 후 동결건조를 통해 분말을 얻어 실험에 사용하였다.
- 각 추출공정을 통한 브로콜리 시료의 성분 차이를 알아보고자 천연물의 일반성분분석에 통상적으로 사용되는 고성능 액체 크로마토그래피 (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC)를 이용하여 각 추출공정을 통한 브로콜리 추출물의 peak를 얻고 공정간 상호 비교 분석을 시도하였다.
- 4M potassium tetraborate 100㎕를 반응 혼합물에 첨가하여 끓는 수조에서 3분간 배양시킨 후 냉각시켰다. 냉각시킨 반응물에 dimethyl aminobenzaldehyde 용액(p-dimethyl amino-benzaldehyde 4 g, 100% acetic acid 350㎖ 및 10 N HCl 50㎖ 혼합액) 3.28㎖를 반응 혼합물에 첨가하고 37℃ 수욕 상에서 20분간 배양한 후 585㎚서 흡광도를 측정하였다. 저해비율은 다음과 같이 계산하고, 효소의 활성을 50% 저해하는 농도를 구해 이를 IC50 값으로 한다.
- 면역기능 증강 효과는 인간 면역 세포인 T세포 (Jurkat)와 B 세포 (Raji)를 이용하여 검증하였다. 세포의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 면역기능 증강 효과는 24 well plate에 세포를 1.
- 면역세포 생육 증진 효과는 인간 면역 세포인 T세포 (Jurkat, ATCC, USA)와 B세포 (Raji, ATCC, USA)를 이용하여 검증하였다. 실험에 사용된 면역세포는 RPMI 1640배지에 10% heating-inactivated FBS를 첨가시켜 배양하였고, NK 세포는 α-MEM배지에 2 mM L-glutamine, 0.
- 본 실험을 통해 제조된 나노입자의 크기를 알아보기 위해 Image analzer (image pro-plus1) 프로그램을 이용하여 광학현미경으로 찍은 nano sample의 크기를 측정하였다.
- 브로콜리 추출 시료 중 초음파를 병행한 60℃ 물 추출 시료 50㎎을 1㎎/㎖의 농도로 증류수에 녹이고, 용매에 녹였다가 건조한 유상 5㎎과 섞은 후 초음파분산기 (VCX 500, Sonics & Materials, CT, USA)를 이용하여 상온에서 2시간 동안 균질화시켜 수용성 나노입자를 제조하였다.
- 세포의 생육은 10% FBS를 함유하는 RPMI 1640 배지를 이용하여 5% CO2, 37℃에서 배양하였으며, 면역기능 증강 효과는 24 well plate에 세포를 1.0×104 cells/㎖의 농도로 조절한 후 시료를 투여하여 8일 동안 배양하면서 매일 각 well의 세포 수를 hemacytometer로 측정하여 확인하였다 (Kwon et al., 2008; Lee et al., 2002).
- italica)는 2007년 03월 제주도에서 수확된 것을 제주도 제주시 소재 정우식품에서 지원받아 사용하였다. 시료는 각각 10배의 증류수를 이용하여 60℃와 100℃에서 24시간동안 추출하였으며, 60℃ 추출물은 다시 초음파 발생기 (Ultrasonic extraction system, Asia industry, Incheon, Korea)를 이용하여 추출온도에서 60㎑의 초음파로 30분간 초음파 공정을 병행한 것을 이용하였다. 각 시료들은 감압여과 및 농축 후 동결건조를 통해 분말을 얻어 실험에 사용하였다.
- 시료의 분석을 위해 HPLC 분석용 water에 각각 100 ppm의 농도로 시료를 조제하고 0.2㎛ syringe filter로 여과하여 injection volume 20㎕로 측정하였다. HPLC 기기는 BIO-TEK instrument (Italy)사 HPLC 500 series의 BIO-TEK 522 controller Pump와 BIO-TEK HPLC 535 UV Detector (214㎚)를 사용하였고, Column은 Alltech사의 Prevail C18 (5㎛, 4.
- 5㎎/㎖로 100㎕ 씩 첨가하여 다시 배양 (37℃, 5% CO2)하였다. 원심분리기를 이용하여 배양배지의 상층액을 취한 다음 450㎚에서 microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하여 얻어진 O.D.값을 표준물질을 이용해 작성한 표준곡선과 비교하여 cytokine의 양을 측정하였다 (Lim et al., 2008; Han et al., 1998).
- 이처럼 본 연구의 나노입자화는 통상적으로 식·의약분야에서 연구되어 오던 물질의 분쇄 및 미립화를 통한 나노화 연구와 달리 브로콜리로부터 추출된 천연 수용성 sulforaphane의 생체활용성을 증진시킬 수 있는 수용성 물질의 나노입자화 공정에 관한 것으로 효율적인 활성물질의 송달 및 이의 생체활용성 증진을 통한 브로콜리 수용성 추출물의 활성 증진 효과를 탐색하였다.
- 인간 T세포를 T-25 Flask에 배양하면서 sample을 투여한 후 증식정도를 관찰하면서 3~4번의 계대 배양 후 세포를 원심분리하여 상층액을 취하였다. NK-92MI 세포를 24 well plate에 4~5 × 104 cells/㎖로 900㎕ 씩 분주하고 24시간 후 T세포의 상층액을 각 plate에 100㎕ 씩 투여하고 배양 48시간 후부터 6일 동안 생세포 수를 측정하여 NK-92MI 세포의 활성도를 확인하였다 (Yueran et al.
- 활성성분을 포접한 나노캡슐을 음성 염색방법 (negative staining)으로 염색하고 EF-TEM으로 크기와 모양을 관찰하였다. 포스포텅스텐산 (phosphotungstic acid, pH 6.8, 0.1%) 용액과 나노캡슐이 1 : 1의 부피비율이 되도록 하여 1시간 동안 염색 시킨 후 폼바 (formvar)와 탄소필름 (carbon film)이 코팅 되어 있는 쿠퍼그리드 (copper grid) 위에 얇게 올려 24시간 동안 건조시켜 수분을 모두 제거한 뒤 EF-TEM, 120 kV에서 나노캡슐의 형상을 관찰 하였다.
- 활성성분을 포접한 나노캡슐을 음성 염색방법 (negative staining)으로 염색하고 EF-TEM으로 크기와 모양을 관찰하였다. 포스포텅스텐산 (phosphotungstic acid, pH 6.
대상 데이터
- HPLC 기기는 BIO-TEK instrument (Italy)사 HPLC 500 series의 BIO-TEK 522 controller Pump와 BIO-TEK HPLC 535 UV Detector (214㎚)를 사용하였고, Column은 Alltech사의 Prevail C18 (5㎛, 4.6 × 250㎜)을 사용하였다.
- 본 실험에 사용된 브로콜리 (Brassica oleracea var. italica)는 2007년 03월 제주도에서 수확된 것을 제주도 제주시 소재 정우식품에서 지원받아 사용하였다. 시료는 각각 10배의 증류수를 이용하여 60℃와 100℃에서 24시간동안 추출하였으며, 60℃ 추출물은 다시 초음파 발생기 (Ultrasonic extraction system, Asia industry, Incheon, Korea)를 이용하여 추출온도에서 60㎑의 초음파로 30분간 초음파 공정을 병행한 것을 이용하였다.
- 세포배양에 필요한 배지로 RPMI 1640과 Alpha minimum essential medium (α-MEM)은 Gibco (Grand Island, NY, USA)사로부터 구입하였고, hepes buffer는 Sigma (St. Louis, MO, USA)사에서 구입하여 사용하였다.
- 혈청은 Gibco의 fetal bovine serum과 horse serum을 이용하였고 gentamycin sulfate, trysin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였다. 세포염색을 위한 sulforthodamine B(SRB)는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
- 실험에 사용된 면역세포는 RPMI 1640배지에 10% heating-inactivated FBS를 첨가시켜 배양하였고, NK 세포는 α-MEM배지에 2 mM L-glutamine, 0.2 mM myoinositol, 20 mM folic acid, 10-4M2-mercaptoethanol, 12.5% fetal bovine serum (FBS)와 12.5% horse serum (Myelocult)을 첨가시켜 배양하였다.
- 6 × 250㎜)을 사용하였다. 이동상은 물과 메탄올 (50 : 50, v/v)의 혼합용액을 사용하였고, 유속은 0.40㎖/min로 흘려주었다.
- Louis, MO, USA)사에서 구입하여 사용하였다. 혈청은 Gibco의 fetal bovine serum과 horse serum을 이용하였고 gentamycin sulfate, trysin-EDTA는 Sigma사의 것을 사용하였다. 세포염색을 위한 sulforthodamine B(SRB)는 Sigma사로부터 구입하여 실험에 사용하였다.
데이터처리
- Each value were compared with control at P < 0.05 by Student t-test.
- 본 연구에서 실험값의 통계는 SPSS package program의 paired t-test로 검정하였으며 모든 실험값은 평균 ±표준오차 (Mean ± standard error)로 나타내었다.
성능/효과
- 3은 전자현미경을 통해 촬영된 브로콜리 나노입자를 image analzer를 이용하여 측정한 입자크기별 분포이다. 100㎚ 의 나노입자가 전체의 70% 이상으로 브로콜리 수용성 추출물 나노입자의 대부분이 100㎚ 이하의 크기로 균일하게 형성되었음을 확인할 수 있다. 일반적으로 나노입자는 200㎚ 이하의 크기에서 세포 침투성이 높은 것으로 알려져 있어 브로콜리 수용성 추출물 나노입자도 체내에서 높은 생체활용성을 보일 것으로 기대된다.
- Table 2는 T세포에 각 시료를 첨가하여 배양한 후 그 배양액을 NK 세포에 첨가하였을 때 나타나는 NK 세포의 활성도를 조건별로 비교하여 나타낸 표이다. 6일 동안 생육도를 관찰하였는데 5일과 6일째 100℃ 물 추출물을 제외한 모든 시료첨가 조건에서 대조군과 비교하여 증가된 생육도를 확인할 수 있었다. 가장 높은 활성을 나타낸 것은 나노입자로 6일째 13.
- 4의 (A)는 시간경과에 따른 T세포의 생육곡선으로 시료첨가 시점을 기준으로 6일째 최고 생육도를 나타내었다. 6일째 100℃ 물 추출물을 제외하면 모든 시료 첨가 조건에서 무첨가 대조군과 비교하여 생육도의 증가를 확인할 수 있었다. 측정을 통해 대조군에 비해 100℃ 물 추출물 첨가군이 3%, 초음파 병행 60℃ 물 추출물이 12%, 나노입자가 14%의 생육증진을 보인 것을 확인하였다.
- 2는 브로콜리 추출물을 함유하는 나노입자의 TEM micrograph이다. TEM micrograph를 분석한 결과 나노캡슐은 50~200㎚ 정도의 크기를 가진 구형의 입자임을 알 수 있으며, 실제로 DLS 등으로 나노캡슐의 크기를 분석하여 50~100㎚의 크기로 측정되었다.
- 가장 높은 활성을 나타낸 것은 나노입자로 6일째 13.0 × 104 cells/㎖를 나타내어 12.0 × 104 cells/㎖를 나타낸 대조군에 비해 약 8%의 활성 증가를 확인할 수 있었다.
- 각 시료 첨가에 따른 cytokine의 분비량은 면역세포의 생육도와 유사한 경향을 나타내었는데, B세포에서 IL-6와 TNF-α의 분비량을 살펴보면, 나노입자 첨가군이 6일째 각각 2.6 × 10−4 pg/cell과 2.1 × 10−4 pg/cell을 나타내며 무첨가 대조군에 비해 유의적으로 가장 높은 분비량을 나타내었고, 다음으로는 초음파 병행 60℃ 물 추출물이 각각 2.36 × 10−4 pg/cell과 2.20 × 10−4 pg/cell을 나타낸 것을 확인할 수 있었다.
- (B)와 (C)는 각각 100℃ 물 추출물과 초음파를 병행한 60℃ 물 추출물의 HPLC 분석 peak로서 각 추출 공정에 따른 용출 성분의 차이를 나타내었다. 결과로부터 (C)의 60℃ 초음파 공정이 L-sulforophane을 비롯한 다양한 성분의 용출을 가장 효율적으로 증진하였음을 확인하였다. 따라서 브로콜리의 유용활성 성분은 온도를 높이는 공정 보다는 초음파 공정을 통해 수율의 향상이 가능할 것으로 사료된다.
- 그중 가장 높은 활성을 나타낸 것은 나노입자로 4일째 9.7 × 104 cells/㎖를 나타내 무첨가 대조군의 7.2 × 104 cells/㎖에 비해 35%까지 T세포의 생육을 증가시키는 것으로 나타났다.
- 농도별 저해활성을 통해 모든 시료가 1,000㎍/㎖ 이하의 농도에서 IC50을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히 브로콜리 나노입자는 200㎍/㎖ 이하의 농도에서 IC50을 나타내었으며, 초음파를 병행한 60℃ 물 추출물도 약 400㎍/㎖의 IC50으로 hyaluronidase의 활성을 억제하는 것으로 나타났다.
- 생육도와 cytokine 분비량 측정을 통한 대부분의 조건에서 시료 첨가를 통해 대조군 보다 높은 활성을 나타내었으며, 나노입자, 초음파 병행 60℃ 물 추출물, 100℃ 물 추출물 순으로 높은 활성을 보였다. 또한 이상의 수치는 해당화의 뿌리 추출물을 통한 연구 (Lee et al., 2003) 등에서 보고된 면역세포 cytokine 분비와 유사한 수치로 브로콜리 추출물이 면역세포의 생육 증진 및 cytokine 분비량 증가를 통한 면역 활성 증진에 가능성이 있으며 초음파병행 추출 및 나노입자화 공정을 통한 추가적인 증진 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.
- 본 연구의 결과를 통해 브로콜리 추출물은 면역 활성을 나타내는 유용성분을 함유하고 있으며, 나노입자화 공정을 통해 면역활성의 증진이 가능함을 확인하였다. 또한 초음파 추출물을 나노입자화 하여 실시한 실험을 통해 나노입자가 높은 면역 활성을 나타냄에 따라, 나노입자화를 통해 적은 유용성분으로 높은 유용활성을 나타낼 수 있음을 확인하였다. 이는 나노입자화를 통해 유용성분이 200㎚ 이하로 분산됨에 따라 세포침투가 용이해지고 생체활용성이 증진되면서 적은 양으로 보다 높은 활성을 나타내는 것으로 사료된다.
- 본 연구의 결과를 통해 브로콜리 추출물은 면역 활성을 나타내는 유용성분을 함유하고 있으며, 나노입자화 공정을 통해 면역활성의 증진이 가능함을 확인하였다. 또한 초음파 추출물을 나노입자화 하여 실시한 실험을 통해 나노입자가 높은 면역 활성을 나타냄에 따라, 나노입자화를 통해 적은 유용성분으로 높은 유용활성을 나타낼 수 있음을 확인하였다.
- 6 × 10−4 pg/cell을 나타내며 다른 시료와 비교해 유의적으로 증가된 cytokine 분비량을 나타내었다. 생육도와 cytokine 분비량 측정을 통한 대부분의 조건에서 시료 첨가를 통해 대조군 보다 높은 활성을 나타내었으며, 나노입자, 초음파 병행 60℃ 물 추출물, 100℃ 물 추출물 순으로 높은 활성을 보였다. 또한 이상의 수치는 해당화의 뿌리 추출물을 통한 연구 (Lee et al.
- 이는 배양시간에 따른 T세포의 cytokine (TNF-α) 분비 경향과 유사한 결과로 브로콜리 추출물 및 나노입자의 첨가를 통해 인간 면역세포의 생육이 증진되고 이를 통해 면역세포로부터 분비되는 cytokine의 분비량도 증가됨을 확인한 결과이다.
- 브로콜리 추출 시료 중 초음파를 병행한 60℃ 물 추출 시료 50㎎을 1㎎/㎖의 농도로 증류수에 녹이고, 용매에 녹였다가 건조한 유상 5㎎과 섞은 후 초음파분산기 (VCX 500, Sonics & Materials, CT, USA)를 이용하여 상온에서 2시간 동안 균질화시켜 수용성 나노입자를 제조하였다. 이를 통해 제조된 나노입자는 수용성 추출물을 유상이 포집한 w/o 형식의 리포좀으로 구성되는데, 입도분석장치 (Dynamic Light Scattering, DLS) 및 image analyzer로 측정한 결과 제조된 나노입자는 50~300 ㎚의 범위로 형성된 것을 확인하였다.
- 6일째 100℃ 물 추출물을 제외하면 모든 시료 첨가 조건에서 무첨가 대조군과 비교하여 생육도의 증가를 확인할 수 있었다. 측정을 통해 대조군에 비해 100℃ 물 추출물 첨가군이 3%, 초음파 병행 60℃ 물 추출물이 12%, 나노입자가 14%의 생육증진을 보인 것을 확인하였다. 그중 가장 높은 활성을 나타낸 것은 나노입자로 4일째 9.
- 을 나타냄을 확인할 수 있었다. 특히 브로콜리 나노입자는 200㎍/㎖ 이하의 농도에서 IC50을 나타내었으며, 초음파를 병행한 60℃ 물 추출물도 약 400㎍/㎖의 IC50으로 hyaluronidase의 활성을 억제하는 것으로 나타났다. 이는 제주산 감태에서 분리한 tannin 화합물 연구 (Bu et al.
후속연구
- 결과로부터 (C)의 60℃ 초음파 공정이 L-sulforophane을 비롯한 다양한 성분의 용출을 가장 효율적으로 증진하였음을 확인하였다. 따라서 브로콜리의 유용활성 성분은 온도를 높이는 공정 보다는 초음파 공정을 통해 수율의 향상이 가능할 것으로 사료된다.
- , 2003)에서 높은 활성을 나타낸 석창포 등과 근사한 수치로 브로콜리 추출물이 hyaluronidase 저해를 통한 항염증 및 피부면역에 효과적으로 작용할 것으로 사료된다. 또한 브로콜리 추출물 내 활성성분 분리를 통해 보다 높은 활성도 기대가 가능할 것으로 사료된다.
- 이는 나노입자화를 통해 유용성분이 200㎚ 이하로 분산됨에 따라 세포침투가 용이해지고 생체활용성이 증진되면서 적은 양으로 보다 높은 활성을 나타내는 것으로 사료된다. 이와 같은 수용성 추출물의 나노입자화 및 브로콜리의 면역활성 탐색 연구는 아직 보고된 사례가 없어 본 연구를 기반으로 한 후속 연구를 통해 브로콜리의 기능성 탐색 및 천연 수용성 추출물의 나노입자화를 통한 기능성 증진 등 접목연구의 가능성을 기대할 수 있을 것으로 사료된다.
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