[논문]황기의 자외선에 의한 세포 손상을 막는 보호 효과

이진영; 박혜윤; 염명훈; 김덕희; 김한곤

황기의 자외선에 의한 세포 손상을 막는 보호 효과
The Protective Effects of Astragali Radix Against UV Induced Cellular Damage in Human Keratinocytes 원문보기

생약학회지, v.39 no.4 = no.155, 2008년, pp.300 - 304

이진영 (아모레퍼시픽 기술연구원 피부과학연구소 한방과학연구팀) , 박혜윤 (아모레퍼시픽 기술연구원 피부과학연구소 한방과학연구팀) , 염명훈 (아모레퍼시픽 기술연구원 피부과학연구소 한방과학연구팀) , 김덕희 (아모레퍼시픽 기술연구원 피부과학연구소 한방과학연구팀) , 김한곤 (아모레퍼시픽 기술연구원 피부과학연구소 한방과학연구팀)

Abstract ▼ AI-Helper

The root of Astragalus membranaceus Bunge (Leguminosae) has been used in the Korean oriental medicine for strengthening the vital energy. UV irradiation has been suggested as a major cause of photo aging in skin. In order to investigate protective effects against UV induced cellular damage, Astragali Radix was extracted with 70% ethanol and dissolved in DMSO. The protective effect was detected by MTT assay, LDH assay, and Comet assay in immortalized human keratinocyte cell line, HaCaT cell system after UV irradiation. Astragli Radix 70% EtOH extract reduced UV induced cellular damage in cell survival, membrane integrity and DNA damage.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

따라서 본 연구에서는 황기 70% EtOH 추출물이 자외선에 의한 손상 받는 피부 세포를 보호할 수 있는지를 확인하고자 자외선에 의한 세포 사멸과 세포막 손상, DNA 손상에 대한 영향을 평가하였다.
또한 이 연구들의 결과를 종합할 때 그 추출 용매와 방식에 따라서 다르기는 하지만 자체 항산화력이 강력하지는 않다. 본 연구에서는 황기 추출물을 직접 피부 배양 세포에 처리하여서 그 생물학적 반응을 보았다는 점에서 기존 연구와 다르다.
최근 장업계에서는 한방 화장품 시장 확대와 함께 한약재의 다양한 피부 생리 활성을 연구하고 이를 소재화 하고자 한다. 이런 관점에서 자외선에 의한 피부 손상을 억제할 수 있는지를 확인하여 제품 개발에 활용하고자 하였다.
UVA와 더불어서 피부 광노화를 일으키는 주범이기도 하다. 최근 장업계에서는 한방 화장품 시장 확대와 함께 한약재의 다양한 피부 생리 활성을 연구하고 이를 소재화 하고자 한다. 이런 관점에서 자외선에 의한 피부 손상을 억제할 수 있는지를 확인하여 제품 개발에 활용하고자 하였다.

제안 방법

부착 시킨다음 황기 추출물을 DMSO에 녹여서 세포 배양액 중 시료의 최종 농도가 10, 50, 100 µg/ml이 되도록 하였다. 24시간 전 처리를 한 후에 PBS로 1회 세척한 후에 각 well에 PBS 1ml을 넣고 자외선 조사등 아래 Kodacel filter를 설치하여 UVC가 제거된 UVB light만 세포에 조사되도록 하여 조사 시간에 따라서 UVB does를 조절하였다. 자외선 조사후에 바로 시료가 포함된 DMEM으로 세포배양 배지를 바꾸어주고 다시 20시간 더 배양한 후 각각의 세포 손상 지표들을 측정하였다.
따라서 세포막이 손상되면 세포가 죽지 않았다고 해도 정상적인 세포 활성을 가지기 어렵다. 본 실험에는 LDH assay를 이용해서 세포막 손상 정도를 확인하였다. 자외선 자극 및 황기 70% EtOH 추출물을 처리한 후에 세포 안에서 세포 밖 배양액으로 흘러나온 LDH만을 얻기 위해서 세포를 추가로 더 손상 시키지 않고 세포 배양액을 취하고 원심분리를 해서 혹시 들어있을지도 모를 세포와 그 파편까지 제거한 후에 LDH 효소반응을 수행하였다.
본 실험에서 사용된 황기 추출물은 70% EtOH 추출물로 황기의 주요 성분인 triterpenoids, isoflavonoids, polysaccharides을 대부분 포함하고 있으므로 손상 억제 활성을 가진 주성분을 찾기 위한 분획 실험을 진행하고 있다.
Comet assay의 분석은 이미지 분석 프로그램을 이용하여 DNA tails의 길이와 강도 등을 분석하기도 하나 DNA tails의 끌림 정도를 5단계로 나누어서 시각 점수화를 하기도 하며 tailed DNA와 non-tailed DNA의 비율로 분석하기도 한다. 본 실험에서는 5 단계 시각 점수화와 함께 tailed DNA와 non-tailed DNA의 비율로 분석하였다. 자외선을 조사하지 않은 실험군의 tailed DNA 비율이 6.
부착 시킨다음 황기 추출물을 DMSO에 녹여서 세포 배양액 중 시료의 최종 농도가 10, 50, 100 µg/ml이 되도록 하였다.
이를 98 well 시험판으로 옮겨서 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존율 계산은 시료와 자외선 처리를 하지 않은 비조사군 대조군을 100% 기준으로 잡고 시료 처리하지 않은 자외선 조사군을 음성대조군으로 잡아 시료 처리한 자외선 조사군의 % 저해율을 구하였다.
흡광도 보정을 위해서 490 nm에서 측정한 흡광도에서 690 nm 에서 측정한 흡광도를 빼준다. 세포막 보호율 계산은 시료와 자외선 처리를 하지 않은 비조사군 대조군을 100% 기준으로 잡고 시료 처리하지 않은 자외선 조사군을 음성대조군으로 잡아 시료 처리한 자외선 조사군의 % 보호율을 구하였다.
본 실험에는 LDH assay를 이용해서 세포막 손상 정도를 확인하였다. 자외선 자극 및 황기 70% EtOH 추출물을 처리한 후에 세포 안에서 세포 밖 배양액으로 흘러나온 LDH만을 얻기 위해서 세포를 추가로 더 손상 시키지 않고 세포 배양액을 취하고 원심분리를 해서 혹시 들어있을지도 모를 세포와 그 파편까지 제거한 후에 LDH 효소반응을 수행하였다. 따라서 본 실험에서 측정된 LDH 의 활성은 UVB 자극에 의한 세포막 손상 정도를 의미하게 된다.
24시간 전 처리를 한 후에 PBS로 1회 세척한 후에 각 well에 PBS 1ml을 넣고 자외선 조사등 아래 Kodacel filter를 설치하여 UVC가 제거된 UVB light만 세포에 조사되도록 하여 조사 시간에 따라서 UVB does를 조절하였다. 자외선 조사후에 바로 시료가 포함된 DMEM으로 세포배양 배지를 바꾸어주고 다시 20시간 더 배양한 후 각각의 세포 손상 지표들을 측정하였다.
자외선에 의한 세포 사멸 억제 효과 − 본 실험에서는 UVB를 이용하여서 피부 세포를 손상하는 모델을 이용하여 황기 70% EtOH 추출물 처리 농도에 따른 세포 생존 정도를 MTT 시약을 처리해 측정하였다.
자외선에 의해서 피부암이 유발되고 피부 노화를 근본적으로 유발하는 원인이기도 하다. 황기 70% EtOH 추출물 처리 농도에 따른 DNA 손상 보호 효과는 시각적으로 바로 확인 가능한 comet assay를 통해서 확인하였다. Comet assay의 분석은 이미지 분석 프로그램을 이용하여 DNA tails의 길이와 강도 등을 분석하기도 하나 DNA tails의 끌림 정도를 5단계로 나누어서 시각 점수화를 하기도 하며 tailed DNA와 non-tailed DNA의 비율로 분석하기도 한다.

대상 데이터

HaCaT 세포에서의 세포 손상 유발 및 시료 처리 − 사람 각질 형성 세포주인 HaCaT 세포15)는 독일암센터의 Dr. Fusenig의 허락을 받아 국립암센터 김수열 박사에게 분양받아 사용하였다.
기기는 ELISA reader (Molecular Devices, SpectraMax190), 광학 현미경 (Olympus, CKX41), 형광 현미경 (Zeiss, Axiovert200), 자외선 조사등 (Sankyo Denki, G15T8E ultraviolet 9K UVB), The Kodacel filter (Eastman Kodak) 등을 사용하였다.
시약 및 기기 − DMSO (Dimethyl Sulfoxide, D2650), MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide, M5655), In vitro toxicology assay kit Lactate Dehydrogenase based (TOX-7)은 Sigma (St. Louis. MO. USA) 제품을 사용하였으며, Comet assay실험에 사용된 CometAssay kit는 Trevigen (Gaithersgurg. ML. USA) 제품을 사용하였으며, 세포 배양에 사용된 DMEM (Dulbecco’s modified eagle’s medium), fetal bovine serum, penicillinstreptomycin 등의 시약은 Lonza (Walkeisuville. MD. USA) 제품을 사용하였다.
실험 재료 − 본 실험에 사용한 황기 (Astragali Radix)는 강원도 정선에서 재배한 4-5 년근을 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
마른 agarose에 SYBR Green I 희석액 (SYBR : TE buffer = 1: 10) 50 µl를 떨어뜨려서 DNA를 염색시킨다. 형광현미경으로 494 nm/512 nm filter에서 관찰하고 사진을 찍는다. Collins 등¹⁶⁾이 사용한 방법을 변형하여 코멧 상태를 시각 점수화를 진행한다.

성능/효과

기존의 황기 추출물 연구^1,2,9,13,14)에서 항 산화 활성은 시험관내에서 활성산소종을 제거하는 물질 자체 특성에 맞춰져 있으며 일부의 연구에서 동물 실험을 통해서 지질과산화가 억제됨³⁾을 보고하고 있다. 또한 이 연구들의 결과를 종합할 때 그 추출 용매와 방식에 따라서 다르기는 하지만 자체 항산화력이 강력하지는 않다. 본 연구에서는 황기 추출물을 직접 피부 배양 세포에 처리하여서 그 생물학적 반응을 보았다는 점에서 기존 연구와 다르다.
따라서 자외선에 의한 세포 손상 및 DNA 손상을 줄여주면 피부를 보호할 수 있다. 본 실험에서 황기 추출물은 세포 사멸 억제 효과를 보여주며 세포막 손상과 DNA 손상을 억제하여 자외선에 의한 피부 손상의 근본적인 원인을 억제할 수 있음을 보여주었다. 본 결과는 염증 유발 인자인 COX-2 효소 활성을 억제²⁾하고 면역 상태를 조절하는 IL-2, IL-4, IFN-γ 생성에 영향을 주며^17,18) 외과적 상처에 대한 치료 효과¹⁹⁾ 보고 등을 참고로 할 때 자외선 손상에서 유발되는 홍반을 억제하고 저하된 면역을 강화하고 손상을 빨리 회복하여 피부를 효과적으로 보호할 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구 결과 황기 추출물은 각질 형성 세포주 HaCaT에 자외선을 조사하여 유발되는 세포 사멸과 세포막 손상, DNA 손상을 줄이는 것으로 확인되었다. 피부는 과도한 자외선에 노출되면 활성 산소종(Reactive oxygen species)가 과도하게 생겨나 세포가 산화적 손상을 입게 된다.
황기와 같은 보기약(補氣藥)은 자음강화법(滋陰降火法)에서 음상부족(陰常不足)을 채우기 위해서 사용된다²⁰⁾. 본 연구 결과를 한의학적으로 재 해석해 보면 자외선에 의해서 피부가 손상되는 것을 육음(六淫)중 화사(火邪)에 의한 병리적인 상황으로 볼 수 있다. 자외선에 의한 활성 산소종을 직접적으로 제거하는 항 산화 활성을 실화(實火)를 내리는 것이라면 황기 추출물은 자외선에 의한 세포 손상을 막아 음화(陰火) 상태를 보충하게 되는 것이다.
본 실험에서는 5 단계 시각 점수화와 함께 tailed DNA와 non-tailed DNA의 비율로 분석하였다. 자외선을 조사하지 않은 실험군의 tailed DNA 비율이 6.0% 이고 시각 수치화에선 tail 없이 온전한 0 단계가 가장 많으나 자외선만 조사한 군은 69.6% 이고 시각 수치화에선 tail이 뚜렷이 나타나는 3 단계가 가장 많았다. 황기 70% EtOH 추출물 100 µg/ml 처리한 군은 22.
측정 결과, 자외선을 조사하지 않은 실험군을 기준으로 자외선만 조사한 군은 세포 사멸 율이 41.6% 이나 황기 70% EtOH 추출물을 50, 100, 200 µg/ml 로 각각 처리한 군의 세포 사멸율은 35.3%, 29.1%, 25.6%로 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었다.
측정 결과, 자외선을 조사하지 않은 실험군을 기준으로 자외선만 조사한 군은 세포막 손상 비율이 73.4% 이나 황기 70% EtOH 추출물을 25, 50, 100, 200 µg/ml으로 각각 처리한 군은 36.8%, 35.5%, 21.8%,7.6%로 농도 의존적으로 감소함을 알 수 있었다.

후속연구

본 결과는 염증 유발 인자인 COX-2 효소 활성을 억제2)하고 면역 상태를 조절하는 IL-2, IL-4, IFN-γ 생성에 영향을 주며17,18) 외과적 상처에 대한 치료 효과19) 보고 등을 참고로 할 때 자외선 손상에서 유발되는 홍반을 억제하고 저하된 면역을 강화하고 손상을 빨리 회복하여 피부를 효과적으로 보호할 수 있을 것으로 기대된다.
본 연구 결과들을 보아, 황기 추출물은 광 노화를 방지하거나 자외선 손상을 방어하는데 효과적으로 작용할 수 있으며 피부에서 화사(火邪)을 방어하는 한방 소재로 활용 될 수 있을 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	피부의 역할은?	피부는 외부에 노출되어 있으면서 외부 자극으로부터 신체를 보호하는 역할을 한다. 외부 자극 중 자외선은 광노화를 유발시키는 가장 큰 원인으로 알려져 있다.
	자외선으로 인해 직접적으로 DNA가 손상되면 pyrimidine dimers를 만들고 이중나사가 끊어지게되는데, 이것은 어떤 문제점을 발생시키는가?	자외선은 직접적으로 DNA를 손상시켜 pyrimidine dimers를 만들고 이중나사가 끊어지게 한다. 이는 이차 신호전달과정을 통해서 제1형 콜라겐의 합성을 저해하고 세포외기질을 분해하는 콜라게나아제를 유발하여 주름 생성을 촉진하게 된다. 또한 DNA 손상은 홍반과 면역 저하, 색소 침착을 유발하며 피부암의 원인이 되기도 한다. 따라서 자외선에 의한 세포 손상 및 DNA 손상을 줄여주면 피부를 보호할 수 있다.
	광노화된 피부의 특징은?	외부 자극 중 자외선은 광노화를 유발시키는 가장 큰 원인으로 알려져 있다. 광노화된 피부는 깊은 주름과 색소 침착, 두꺼운 피부 두께 등으로 특징지어지며, 표피의 기능 약화, 멜라닌 색소의 과도한 생성, 교원질 섬유의 변성과 분해 촉진 등에 의해서 나타나게 된다4). 자외선에 의한 세포 손상에서 시작되는 현상으로 DNA 손상의 경우 피부암까지 유발하는 것으로 알려져 있다5).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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