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문제 정의
- 그러나 국내 시장 유통품의 다수가 해방풍과 식방풍이 차지하고 있어 정확한 약재사용을 위한 기원 식물의 성분연구가 요구되고 있다. 이에 본 연구에서는 방풍의 품질평가를 위하여 기초적인 성분 자료를 제공하고자 방풍의 식물화학 성분을 분리하고자 하였다.
제안 방법
- 1 H NMR spectrum 에서 두 개의 특징적인 수소 [δ 7.94 (1H, d, J = 9.7 Hz, H-4), 6.22 (1H, d, J = 9.7 Hz, H-3)]를 통하여 이 화합물의 모핵이 coumarin임을 예상할 수 있었고, δ 1.31 (3H, s), 1.13 (3H, s)로 gem- (CH3)2을, δ 4.41 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1') 피크를 통해 당이 결합했음을 추정하였다.
- 13C NMR spectrum 에서 6개의 벤젠고리에 있는 탄소를 확인했고 1개의 carbonyl기를 δ 161.1 (C-2)에서 확인하였으며, δ 25.7, 24.9 피크를 통해 gem-(CH3)2기를 확인했다.
- E2-50-6을 순상 MPLC (Hexane : EtOAc = 50:1→1:1→EtOAc→MeOH)을 수행하여 8개의 소분획 (E2-50-6-1~E2-50-6-8)으로 나누었고, 이 중 E2-50-6-4를 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피 (MeOH)를 수행 해 화합물 11 (150 mg)을 분리 하였으며, 소분획 E2-50-8을 EtOH로 재결정해 화합물 12 (220 mg)을 분리 하였다.
- EtOAc 추출물 200 g을 소분하여 n-hexane과 EtOAc의 혼합액을 사용하여 극성에 따른 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하였으며 박층크로마토그래피를 통하여 비슷한 양상을 보이는 분획을 모아 7개의 분획 (E1-1 − E1-7) 으로 나누었다.
- HMBC spectrum으로부터 δ 3.77 (3H, s, 6-OCH3) 피크와 δ 146.5 (C-6) 피크의 correlation을 확인해 6번 위치에 결합한 methoxy기를 확인했고, δ 3.70 (3H, s, 3-OCH3) 피크와 δ149.2 (C-3) 피크의 correlation을 통해 C-3' 위치에 결합한 methoxy기를 확인했다.
- 건조한 방풍 10 kg을 세절하여 메탄올로 90분씩 3회 초음파 추출하였으며 이를 감압 건조하여 1.4 kg의 추출물을 얻었다. 이를 증류수에 현탁하여 극성순서에 따라 EtOAc와 n-BuOH로 분획하고, 이들 분획물들을 각각 감압농축하여 EtOAc 분획 (401 g), n-BuOH (162 g)의 분획물을 얻었다.
- 대분획 E2-10을 silica gel C.C. (EtOAC : MeOH = 10:1→MeOH)를 실시하여 박층크로마코그래피법에 따라 비슷한 형광을 보인 분획을 따로 모아 4개의 소분획 (E2-10-1~E2-10-4)을 얻었다.
- 또한 δ 5.41 (1H, d J = 4.5 Hz, H-3'), 4.40 (H, d, J = 4.5, H-2')의 수소 피크를 통해 furan ring을, δ 1.32, 1.30 (3H, s) 피크를 통해 gem-(CH3)2를 예상하였다.
- 방풍의 메탄올 추출물로부터 유기용매 분획법, 각종 컬럼 크로마토그래피법 및 재결정 방법을 이용하여 총 21종의 화합물을 분리하였다. 분리된 화합물의 계열은 9 종의 coumarin(3-9, 14, 19), 8 종의 chromone (1, 11, 12, 15, 16, 18, 20, 21), 3 종의 sterol (2,10,17), 1 종의 coumarolignan (13)이며 이 중 화합물 13은 미나리과에서 처음 분리 보고되는 것이며, 화합물 14 및 19는 방풍에서 처음 분리 보고되는 것이다.
- 소분획 E1-3을 RP-MPLC를 실시하여 14개의 소분획 (E1-3-1 − E1-3-14)으로 나누었으며 이중 E1-3-1에 소분획을 MeOH을 용출용매로 하여 Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 사용하여 화합물 3 (3 mg)을 분리하였으며, E1-3-2을 RP-HPLC (Water:MeCN=1:1)를 수행하여 화합물 4 (40 mg)를 분리하였다.
- 4 kg의 추출물을 얻었다. 이를 증류수에 현탁하여 극성순서에 따라 EtOAc와 n-BuOH로 분획하고, 이들 분획물들을 각각 감압농축하여 EtOAc 분획 (401 g), n-BuOH (162 g)의 분획물을 얻었다.
- 화합물 7-21의 분리 − EtOAc 추출물 201 g을 소분하여 n-hexane과 EtOAc의 혼합액을 사용하여 극성에 따른 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하였으며 박층크로마토그래피를 통하여 비슷한 형광을 보인 분획을 따로 모아 7개의 대분획 (E2-100, E2-50, E2-20, E-10, E2-5, E2-2, E2- M)으로 나누었다.
대상 데이터
- 방풍(건조중량 10.5 kg)은 영천시 소재의 옴니허브(주)에서 중국 내몽고산을 2007년 2월에 수입한 것을 사용하였으며, 동국대학교 이제현교수가 감정한 것을 사용하였다.
- 자외선 흡광은 Shimadzu UV-2101 Spectrophotometer을 이용하여 측정하였으며, 적외선 분광기는 Perkin Elmer 1710 spectrophotometer을 사용하였다. 선광도는 JASCO, DIP-100를, 분자량 측정을 위한 질량분석기로는 Finnigan LCQ ion-trap mass (ESI-MS) 와 JEOL JMS AX 505 WA Spectrometer (FAB-MS)를 사용하였고 핵자기공명 분광기로는 JEOL LA 300 Spectrometer (300 MHz), Bruker GPX 400 Spectrometer (400 MHz), Bruker AMX 500 Spectrometer (500 MHz)를 사용하였다. 성분 분리에 사용된 컬럼 크로마토그래피용 고정상은 Kieselgel 60 (40-63 µm, 230-400 mesh, Merck), Sephadex LH-20 (bead size 25-100 µm, Pharmacia) 및 HP-20 (bead size 250-600 µm, Mitsubishi Chemical Co.
- 성분 분리에 사용된 컬럼 크로마토그래피용 고정상은 Kieselgel 60 (40-63 µm, 230-400 mesh, Merck), Sephadex LH-20 (bead size 25-100 µm, Pharmacia) 및 HP-20 (bead size 250-600 µm, Mitsubishi Chemical Co.)를 사용하였으며, 박층크로마토그래피 측정은 Kieselgel 60 F254 (Merck)를 사용하였으며 발색은 아니스알데히드 황산 용액을 사용하였다.
- 자외선 흡광은 Shimadzu UV-2101 Spectrophotometer을 이용하여 측정하였으며, 적외선 분광기는 Perkin Elmer 1710 spectrophotometer을 사용하였다. 선광도는 JASCO, DIP-100를, 분자량 측정을 위한 질량분석기로는 Finnigan LCQ ion-trap mass (ESI-MS) 와 JEOL JMS AX 505 WA Spectrometer (FAB-MS)를 사용하였고 핵자기공명 분광기로는 JEOL LA 300 Spectrometer (300 MHz), Bruker GPX 400 Spectrometer (400 MHz), Bruker AMX 500 Spectrometer (500 MHz)를 사용하였다.
- 고속액체크로마토그래피용 컬럼은 J’sphere ODSH80 (250×10 mm ID, 4 µm, YMC) 및 YMC-Pack ProC18 RS (250×20 mm ID, 4 µm, YMC)을 사용하였다. 추출에 사용된 유기용매는 모두 일급시약으로 대정화학에서 구입하여 사용하였으며, HPLC 용 용매로 사용된 아세토니트릴과 물은 Fisher에서 구입하여 사용하였다.
성능/효과
- 13C NMR spectrum 에서 6개의 벤젠고리 탄소들을 확인했고, 1개의 carbonyl기를 확인했으며, δ 77.0 (C-5'), 76.9 (C-3'), 73.5 (C-2'), 70.0 (C-4'), 61.2 (C-6')에 위치한 탄소 및 1 H-NMR의 H-1' (1H, d, J = 7.8 Hz)을 통하여 결합한 당이 glucopyranose임을 확인할 수 있었다.
- 13C NMR spectrum에서 12개의 벤젠 고리를 구성하는 탄소들을 확인했고, 1개의 carbonyl기를 δ 160.8에서, δ 56.1, 56 피크를 통해 methoxyl기가 2개 있음을 확인할 수 있었다.
- 7) 식방풍과 해방풍의 기원식물은 각각 갯기름나물 Peucedanum japonicum Thunb.과 갯방풍 Glehnia littoralis Fr.
- HMBC spectrum에서 δ 5.41 (1H, d J = 4.5 Hz, H-2')의 수소 피크와 δ 25.7, 24.9 [gem-(CH3)2]의 탄소 피크가 서로 correlation 함을 확인하고, δ 5.41 (1H, d J = 4.5 Hz, H-2')피크와 δ 71.2 (C-4') 피크의 correlation을 확인하여 C-2에 결합된 isopropanol 기를 확인할 수 있었다.
- 이상의 결과를 문헌치와 비교하여 화합물 13의 구조를 8'-epicleomioscin A로 동정하였다.
- 8 (C-4') 피크의 correlation을 C-4' 와 결합한 gem-(CH3)2기를 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 문헌치와 비교하여 화합물 19 의 구조를 nodakenin 으로 동정하였다.11)
- 2 (C-4') 피크의 correlation을 확인하여 C-2에 결합된 isopropanol 기를 확인할 수 있었다. 이상의 결과를 종합하여 문헌치과 비교하여 화합물 14의 구조를 xanthoarnol로 동정하였다. 9,10)
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