The sodium bicarbonate cotransporter (NBC) protein is functionally expressed in salivary glands. In this experiment, we examined the role of NBC in $HCO_3^-$ formation in human parotid gland acinar cells. Intracellular pH (pHi) was measured in 2'-7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluoresce...
The sodium bicarbonate cotransporter (NBC) protein is functionally expressed in salivary glands. In this experiment, we examined the role of NBC in $HCO_3^-$ formation in human parotid gland acinar cells. Intracellular pH (pHi) was measured in 2'-7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein (BCECF)-loaded cells. Acetazolamide (0.1 mM) and 4,4'-diisothio cyanatostilbene-2,2'-disulphonic acid (DIDS, 0.5 mM) were used as specific inhibitors of carbonic anhydrase and NBC, respectively. The degree of inhibition was assessed by measuring the pHi recovery rate (${\Delta}pHi$/min) after cell acidification using an ammonium prepulse technique. In control experiments, ${\Delta}pHi$/min was $1.40{\pm}0.06$. Treatment of cells with 0.5 mM DIDS or 0.1 mM acetazolamide significantly reduced ${\Delta}pHi$/min to $1.14{\pm}0.14$ and $0.74{\pm}0.15$, respectively. Simultaneous application of DIDS and acetazolamide further reduced ${\Delta}pHi$/min to $0.47{\pm}0.10$. Therefore, DIDS and acetazolamide reduced ${\Delta}pHi$/min by 19% and 47%, respectively, while simultaneous application of both DIDS and acetazolamide caused a reduction in ${\Delta}pHi$/min of 67%. These results suggest that in addition to carbonic anhydrase, NBC also partially contributes to $HCO_3^-$ formation in human parotid gland acinar cells.
The sodium bicarbonate cotransporter (NBC) protein is functionally expressed in salivary glands. In this experiment, we examined the role of NBC in $HCO_3^-$ formation in human parotid gland acinar cells. Intracellular pH (pHi) was measured in 2'-7'-bis(carboxyethyl)-5(6)-carboxyfluorescein (BCECF)-loaded cells. Acetazolamide (0.1 mM) and 4,4'-diisothio cyanatostilbene-2,2'-disulphonic acid (DIDS, 0.5 mM) were used as specific inhibitors of carbonic anhydrase and NBC, respectively. The degree of inhibition was assessed by measuring the pHi recovery rate (${\Delta}pHi$/min) after cell acidification using an ammonium prepulse technique. In control experiments, ${\Delta}pHi$/min was $1.40{\pm}0.06$. Treatment of cells with 0.5 mM DIDS or 0.1 mM acetazolamide significantly reduced ${\Delta}pHi$/min to $1.14{\pm}0.14$ and $0.74{\pm}0.15$, respectively. Simultaneous application of DIDS and acetazolamide further reduced ${\Delta}pHi$/min to $0.47{\pm}0.10$. Therefore, DIDS and acetazolamide reduced ${\Delta}pHi$/min by 19% and 47%, respectively, while simultaneous application of both DIDS and acetazolamide caused a reduction in ${\Delta}pHi$/min of 67%. These results suggest that in addition to carbonic anhydrase, NBC also partially contributes to $HCO_3^-$ formation in human parotid gland acinar cells.
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문제 정의
따라서 본 연구에서는 타액의 완충능에 가장 중요한 역할을 하고 있는 중탄산이온이 인간 이하선 선포세포내에서 형성되는 기작에서, 지금까지 알려진 기존의 CO2의 확산에 의한 형성과 NBC를 통한 형성을 비교함으로서 NBC가 세포내 중탄산이온 형성에 기여하고 있는 정도를 비교 평가해 보고자 하였다.
, 2003). 본 연구는 사람 이하선 선포세포에서의 pH 회복기전을 밝혀본 것으로서 CO2 확산에 이은 탄산탈수소효소의 역할과 NBC의 역할을 직접 수치적으로 비교해 본 첫 번째 실험이라는 점에서 의의를 찾아 볼 수 있다.
, 2003). 본 연구에서는 이러한 pHi 회복율을 기준으로 중 탄산이온에 의한 pHi 완충능력을 평가하였다(Choi et al., 2006).
이번에는 탄산탈수소효소가 pHi 회복에 기여하는 정도를 평가해 보았다(FIg. 3). 본 실험에서는 0.
제안 방법
삼투질 농도는 약 300 mOsm 로 조정하였다. HCO3-함유용액 [HCO3--buffered solution (BBS)]은 정상 HEPES에서 25 mM NaCl을 같은 농도의 NaHCO3로 대체하였고, Na-free 용액은 정상 HCO3- buffer에서 NaCl을 NMDG-Cl (N- methyl -D-glucamine)로, NaHCO3를 choline-HCO3-로 대체하였다. NH4- 함유용액은 20 mM Na를 같은 농도의 NH4로 대체하였으며, 이상의 모든 HCO3- 완충 관류 용액들은 실험 전 5 % CO2- 95 % O2 가스를 10분간 흘린 후 실험에 사용되었다.
끝으로 DIDS와 acetazolamide를 동시에 처리해 보았다(Fig. 4). 이 경우 pHi 회복율은 0.
대조 실험 후 먼저 NBC가 pHi 회복에 기여하는 정도를 평가해 보았다(Fig. 2). DIDS는 음이온교환 억제제(anion exchanger inhibitor)이면서 NBC에 대한 특이억제제이다(Luo et al.
, 2004). 세포 내부를 산성화시키기 위해 20 mM NH4Cl로 약 1분간 관류시켰고, DIDS와 acetazolamide 등으로 전처리한 후 pH의 회복 속도를 관찰하였다. 실험 시 관류속도는 2 ml/min 정도로 하였으며, 실험의 전 과정 동안 정상 중탄산이온 완충용액(HCO3- buffer)은 안정 시 관류 용액으로 사용되었다.
인간 이하선 선포세포에 ammonium prepulse를 가하여 세포 내부를 산성화 시킨 뒤, 자극 이전으로 pH가 회복되는 속도를 측정하여 이를 대조군으로 사용하였다. 약 1분간의 NH4Cl prepulse 자극으로 세포내의 pH는 일시적인 상승 후 급 하강하고, Na free용액에서는 낮은 pHi가 유지된다.
3). 본 실험에서는 0.1 mM acetazolamide가 사용되었는데, 이는 탄산탈수소효소(carbonic anhydrase) 억제제로서 탄산이 수소이온과 중탄산이온으로 분해 되는 것을 막아준다(Beal, 1991; Novak et al., 1986). Acetazolamide도 DIDS와 마찬가지로 관찰 시점 2분전부터 관류시켰다.
데이터처리
실험결과에 대한 통계처리는 'student t-test' 를 사용하였고, p-value가 0.05 미만인 경우, 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였음.
이론/모형
세포내 pH 변화는 Photon Technology International system (South Brunswick, NJ, USA)을 이용해 측정되었다. BCECF의 형광은 미세형광측정법(microspectrofluorimetry)으로 측정하였는데, 440 nm와 490 nm의 파장을 이용하여 이들의 형광 비(ratio)를 측정하였다(Koo et al., 2006; Nguyen et al., 2004). 세포 내부를 산성화시키기 위해 20 mM NH4Cl로 약 1분간 관류시켰고, DIDS와 acetazolamide 등으로 전처리한 후 pH의 회복 속도를 관찰하였다.
분리된 단일 선포세포들을 다시 2 uM 2'-7'-bis(carboxyethyl)-5(6)- carboxyfluorescein (BCECF)로 30분간 실온에서 loading시켰고, 정상 HEPES 용액으로 세척 후 실험에 사용되기 전까지 얼음 위에서 보관되었다. 세포내 pH 변화는 Photon Technology International system (South Brunswick, NJ, USA)을 이용해 측정되었다. BCECF의 형광은 미세형광측정법(microspectrofluorimetry)으로 측정하였는데, 440 nm와 490 nm의 파장을 이용하여 이들의 형광 비(ratio)를 측정하였다(Koo et al.
성능/효과
즉 인간 이하선 선포세포의 중탄산이온 회복에서 NBC는 전체 pH 회복의 19 % 정도를, CO2 확산과 탄산탈수소효소는 47 % 정도를 담당하고 있음을 알 수 있다. DIDS와 acetazolamide를 모두 처리하였을 때 pHi 회복율은 대조군에 비해 33 % 수준이었다. DIDS와 acetazolamide을 동시 투여한 경우에도 일부 pHi의 회복이 관찰되는 사실은 CO2 확산과 NBC를 통한 중탄산이온의 회복이 인간 이하선 선포세포의 pH 회복 기전의 상당 부분을 담당하고 있는 것은 사실이나, 이 기전을 담당하는 또 다른 수송체(transporter)가 존재 하거나 다른 대사 작용(metabolism)이 있을 수 있음을 암시해 준다고 하겠다.
DIDS의 효과를 극대화하기 위해 본 실험에서는 관찰 시점 2분전부터 0.5 mM의 DIDS를 관류시켰으며, 실험 결과 pHi 회복율은 1.14 ± 0.14 (n=5) 로서, 이는 대조군에 비해 81 % 정도였다.
즉, 인간 이하선 선포세포내에서 자극 후 중탄산이온 형성과정에는 CO2 확산과, NBC를 이용한 중탄산이온의 세포내 이동, 이 두 경로가 모두 기여한다는 것이다. 그러나 이 실험에서 NBC의 억제제인 DIDS에 의한 pH 회복율의 감소 보다 탄산탈수소 효소 억제제인 acetazolamide에 의한 pH 회복율의 감소가 더 컸으므로 선포세포 내로의 중탄산이온 유입에는 NBC 보다는, 기존에 알려져 왔던 것처럼 CO2 확산 및 탄산탈수소효소에 의한 부분이 중탄산이온 형성에 더 큰 영향을 미치는 것을 확인 할 수 있었다. 즉 인간 이하선 선포세포의 중탄산이온 회복에서 NBC는 전체 pH 회복의 19 % 정도를, CO2 확산과 탄산탈수소효소는 47 % 정도를 담당하고 있음을 알 수 있다.
억제제 투여 후 자극 전 pH 회복까지 걸린 총 경과시간을 관찰한 실험에서, 대조군과 DIDS및 acetazolamide군 사이에 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 이러한 사실은 본 실험에서 사용된 pH 회복율 측정방법이 더 신뢰성이 있으며, 총 경과시간을 이용한 평가는 적절한 평가지수가 되지 못함을 말해준다.
즉 CO2 확산에 이은 탄산탈수소효소의 작용에 의한 HCO3- 형성이 NBC를 통한 HCO3- 세포내로의 수송 못지않게 빠른 시간 내에 이루어진다는 것이다. 이 실험 결과는 이하선 자극 시 안정 시에 비해 타액내의 중탄산이온 농도가 빠른 시간 내에 급격히 증가할 수 있는 것은 두 기전, 즉 CO2 확산에 이은 탄산탈수소효소의 작용에 의한 HCO3- 형성과 NBC를 통한 HCO3- 세포내로의 이동이 거의 동시에 작용하므로서 가능하다는 것을 보여주었다는 점에서 흥미롭다.
그러나 이 실험에서 NBC의 억제제인 DIDS에 의한 pH 회복율의 감소 보다 탄산탈수소 효소 억제제인 acetazolamide에 의한 pH 회복율의 감소가 더 컸으므로 선포세포 내로의 중탄산이온 유입에는 NBC 보다는, 기존에 알려져 왔던 것처럼 CO2 확산 및 탄산탈수소효소에 의한 부분이 중탄산이온 형성에 더 큰 영향을 미치는 것을 확인 할 수 있었다. 즉 인간 이하선 선포세포의 중탄산이온 회복에서 NBC는 전체 pH 회복의 19 % 정도를, CO2 확산과 탄산탈수소효소는 47 % 정도를 담당하고 있음을 알 수 있다. DIDS와 acetazolamide를 모두 처리하였을 때 pHi 회복율은 대조군에 비해 33 % 수준이었다.
후속연구
억제제 투여 후 자극 전 pH 회복까지 걸린 총 경과시간을 관찰한 실험에서, 대조군과 DIDS및 acetazolamide군 사이에 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 이러한 사실은 본 실험에서 사용된 pH 회복율 측정방법이 더 신뢰성이 있으며, 총 경과시간을 이용한 평가는 적절한 평가지수가 되지 못함을 말해준다. 그럼에도 불구하고 DIDS군과 acetazolamide 군에서의 결과는 지금까지 우리가 잘 알지 못했던 탄산탈수소효소의 작용시간을 DIDS와 비교해 볼 수 있다는 점에서 의미를 갖는다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
타액의 다양한 기능은 무엇인가?
타액은 점막을 적셔 구강 내를 부드럽게 해주고, 외부의 자극으로부터 점막을 보호해주며, 미각을 느낄 수 있게 하고, 소화를 도우며, 구강내의 산도를 조절하는 등 다양한 기능을 한다. 이러한 여러 기능 중에서 세균에 의해 형성된 산을 완충시켜 구강내의 pH를 중성인 7.
Sodium bicarbonate cotransporter는 무엇인가?
Sodium bicarbonate cotransporter (NBC)는 신장에서 pH 조절에 관여하는 세포막 수송체로서, 1997년에 Romero 등에 의해 최초로 클로닝 되었다 (Romero et al., 1997).
타액의 기능 중 완충능력은 어떤 기능인가?
타액은 점막을 적셔 구강 내를 부드럽게 해주고, 외부의 자극으로부터 점막을 보호해주며, 미각을 느낄 수 있게 하고, 소화를 도우며, 구강내의 산도를 조절하는 등 다양한 기능을 한다. 이러한 여러 기능 중에서 세균에 의해 형성된 산을 완충시켜 구강내의 pH를 중성인 7.0 안팎으로 적절히 유지시켜주는 완충능은 타액의 가장 중요한 기능 중의 하나이다. 이러한 완충능력은 주로 선포세포에서 분비되는 중탄산이온(HCO3-)에 의해 이루어진다.
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