GC 및 HPLC 비교분석에 기초한 차조기 종실내 tocotrienol 부재의 평가 Absence of Tocotrienol Form of Vitamin E in Purple Perilla (Perilla frutescens var. acuta Kudo) Seeds Confirmed by Comparative Analysis Using HPLC and GC원문보기
비타민 vitamin E 구성 성분으로 항산화, 항암, 고지혈증 개선 등 다양한 생리활성을 나타내는 tocotrienol이 국내산 차조기에서 보고된 바, 존재 여부 확인을 위하여 국내수집 6종, 일본수집 8종 등 총 14종의 차조기 유전자원과 들깨 종실을 대상으로 HPLC 및 GC, GC/MS 비교 분석을 수행 하였으며 그 결과는 다음과 같다. 1. 순상의 HPLC 이용시 차조기에서 4종의 tocopherol 및 ${\beta}-tocotrienol$, ${\gamma}-tocotrienol$과 매우 유사한 머무름 시간의 발견되었다. 2. 그러나 동일 시료를 GC로 재분석한 결과 13개 차조기 유전자원에서 모두 4종의 tocotrienol과 일치하는 물질은 발견되지 않았다. 3. GC 이용시 ${\delta}-tocotrienol$ 및 ${\gamma}-tocotrienol$과 유사한 머무름 시간의 peak가 검출되었으나 GC/MS를 이용하여 확인한 결과 tocotrienol이 아닌 것으로 확인되었다. 4. 이상의 HPLC 및 GC 비교분석결과에 기초할 때, 차조기에는 tocotrienol류의 vitamin E는 존재하지 않는 것으로 추정되었으며 GC를 이용한 vitamin E isomer 분석이 HPLC 이용시 발생가능한 유사 머무름시간대 물질을 tocotrienol로 판단하는 오류 방지에 효과적임을 알 수 있었다.
비타민 vitamin E 구성 성분으로 항산화, 항암, 고지혈증 개선 등 다양한 생리활성을 나타내는 tocotrienol이 국내산 차조기에서 보고된 바, 존재 여부 확인을 위하여 국내수집 6종, 일본수집 8종 등 총 14종의 차조기 유전자원과 들깨 종실을 대상으로 HPLC 및 GC, GC/MS 비교 분석을 수행 하였으며 그 결과는 다음과 같다. 1. 순상의 HPLC 이용시 차조기에서 4종의 tocopherol 및 ${\beta}-tocotrienol$, ${\gamma}-tocotrienol$과 매우 유사한 머무름 시간의 발견되었다. 2. 그러나 동일 시료를 GC로 재분석한 결과 13개 차조기 유전자원에서 모두 4종의 tocotrienol과 일치하는 물질은 발견되지 않았다. 3. GC 이용시 ${\delta}-tocotrienol$ 및 ${\gamma}-tocotrienol$과 유사한 머무름 시간의 peak가 검출되었으나 GC/MS를 이용하여 확인한 결과 tocotrienol이 아닌 것으로 확인되었다. 4. 이상의 HPLC 및 GC 비교분석결과에 기초할 때, 차조기에는 tocotrienol류의 vitamin E는 존재하지 않는 것으로 추정되었으며 GC를 이용한 vitamin E isomer 분석이 HPLC 이용시 발생가능한 유사 머무름시간대 물질을 tocotrienol로 판단하는 오류 방지에 효과적임을 알 수 있었다.
Lipid soluble vitamin E consists of tocopherols and tocotrienols depending upon double bonds in phytyl side chains attached to chromanol ring. Recent reports on antioxidative, anticancer, and cholesterol-lowering effects of tocotrienols have increased researches and commercialization of tocotrienols...
Lipid soluble vitamin E consists of tocopherols and tocotrienols depending upon double bonds in phytyl side chains attached to chromanol ring. Recent reports on antioxidative, anticancer, and cholesterol-lowering effects of tocotrienols have increased researches and commercialization of tocotrienols. Purple perilla (Perilla frutescens var. acuta Kudo) has been reported as a plant containing tocotrienols along with tocopherol forms of vitamin E based upon normal phase HPLC analysis. To confirm the existence or absence of tocotrienol form of vitamin E in purple perilla, comparative analysis using HPLC, GC/FID, and GC/MSD has been conducted for 14 purple perilla genetic accessions collected from Korea and Japan. Normal phase HPLC analysis showed ${\alpha}-$, ${\beta}-$, ${\gamma}-$, and ${\delta}-tocopherols$ along with peaks with retention times quite similar to ${\beta}-$ and ${\gamma}-tocotrienols$. Same purple perilla samples, analysed by GC exhibited ${\alpha}-$, ${\beta}-$, ${\gamma}-$, and ${\delta}-tocopherols$ quantitatively equivalent to HPLC results. However, no peaks for ${\beta}-$ and ${\gamma}-tocotrienols$ could be observed and unknown two peaks of similar retention times with ${\beta}-$ and ${\gamma}-tocotrienols$ were identified not corresponding tocotrienols by GC/MSD. These results suggest the absence of tocotrienol form of vitamin E in purple perilla as well as the necessity of using GC-based qualitative and quantitative vitamin E analysis to avoid misinterpretation of peaks with similar retention times as tocotrienol isomers when analysed by an HPLC.
Lipid soluble vitamin E consists of tocopherols and tocotrienols depending upon double bonds in phytyl side chains attached to chromanol ring. Recent reports on antioxidative, anticancer, and cholesterol-lowering effects of tocotrienols have increased researches and commercialization of tocotrienols. Purple perilla (Perilla frutescens var. acuta Kudo) has been reported as a plant containing tocotrienols along with tocopherol forms of vitamin E based upon normal phase HPLC analysis. To confirm the existence or absence of tocotrienol form of vitamin E in purple perilla, comparative analysis using HPLC, GC/FID, and GC/MSD has been conducted for 14 purple perilla genetic accessions collected from Korea and Japan. Normal phase HPLC analysis showed ${\alpha}-$, ${\beta}-$, ${\gamma}-$, and ${\delta}-tocopherols$ along with peaks with retention times quite similar to ${\beta}-$ and ${\gamma}-tocotrienols$. Same purple perilla samples, analysed by GC exhibited ${\alpha}-$, ${\beta}-$, ${\gamma}-$, and ${\delta}-tocopherols$ quantitatively equivalent to HPLC results. However, no peaks for ${\beta}-$ and ${\gamma}-tocotrienols$ could be observed and unknown two peaks of similar retention times with ${\beta}-$ and ${\gamma}-tocotrienols$ were identified not corresponding tocotrienols by GC/MSD. These results suggest the absence of tocotrienol form of vitamin E in purple perilla as well as the necessity of using GC-based qualitative and quantitative vitamin E analysis to avoid misinterpretation of peaks with similar retention times as tocotrienol isomers when analysed by an HPLC.
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문제 정의
, 2004a). 본 논문은 gas chromatography를 이용한 tocopherol 및 tocotrienol 동시분석법에 준하여 차조기종실 함유 vitamin E 분석을 수행한 결과 차조기 내에는 tocotrienol이 발견되지 않는 상이한 결과가 얻어졌기에 이를 보고하고자 한다.
제안 방법
시료의 분석 대상 성분과 머무름 시간이 중복되지 않는 campesterol을 internal standard로 사용하였다. GC/MS(HP 6890)의 경우 GC/FID에서와 동일한 조건을 유지하였고, mass spectrum을 이용한 peak의 동정을 위해 Wiley library 및 authentic standard를 mass spectrum의 비교용으로 사용하였다.
이러한 머무름 시간 재현성의 문제는 표준품의 경우에도 발생하고 특히 matrix가 복잡하고 정제가 미흡한 분석 시료의 경우에는 더욱 심하게 발생하는 현상으로 GC에 비교할 때 고정상에서의 분리 과정 중 확산이 크게 발생하는 HPLC의 특성에 기인한 것이다. 따라서 분석자들은 각 시료의 matrix별로 표준품의 머무름 시간의 변동 가감을 고려하여 시료 내 해당성분의 정성적 판단 및 정량적 분석을 수행하게 된다. Park et al.
비타민 vitamin E 구성 성분으로 항산화, 항암, 고지혈증 개선 등 다양한 생리활성을 나타내는 tocotrienol이 국내산 차조기에서 보고된 바, 존재 여부 확인을 위하여 국내수집 6종, 일본수집 8종 등 총 14종의 차조기 유전자원과 들깨 종실을 대상으로 HPLC 및 GC, GC/MS 비교 분석을 수행하였으며 그 결과는 다음과 같다.
반응이 종료된 시험관을 얼음이 채워진 수조에서 신속히 상온까지 온도를 낮춘 후, n-hexane 5 mL와 물 5 mL를 첨가하여 교반한 후, 4℃에서 1분간 1,000 rpm 속도로 원심분리하여 액-액분리를 수행하였다. 원심분리후 hexane층을 다른 시험관에 옮긴 후 다시 hexane 첨가, 교반, 원심분리, 액액 분리, hexane층 수집 등 일련의 과정을 2회 추가 반복하였다. 모아진 hexane 층을 5 mL의 증류수로 세척하는 과정을 3회 반복하고, 이를 Na2SO4층을 통과시켜 탈수한 후, 진공 농축기를 이용하여 용매를 제거하였다.
즉, GC(Varian 3800, USA)에 컬럼으로는 CP-SIL 8 CB(25 m × 0.25 mm, ID 0.4 μm)을 사용하였으며 oven 온도 조건은 220℃에서 290℃까지 분당 5℃씩 승온 후 28분간 유지하고 다시 300℃까지 승온하였다.
대상 데이터
Tocopherol 및 tocopherol의 표준품으로 CalBiochem사의 α-, β-, γ-, δ-tocotrienol kit 및 α-, β-, γ-, δ-tocopherol kit을 구입하여 사용하였으며 HPLC 이동상 조제를 위한 isooctane 및 ethyl acetate는 HPLC급(J. T. Baker, USA)을, acetic acid, DMP 및 기타 시약은 Sigma에서 구입하여 사용하였다.
시중에서 구입 가능한 차조기 종자의 경우 유전적, 분류학적 정보가 불분명한 제한이 있다. 따라서 정확한 유전적 배경의 차조기 종실의 취득을 위하여 차조기 유전자원 관리 포장에서 증식된 차조기를 분양받아 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 유전자원은 한국 수집종 6종과 일본 수집종 8종 등 차조기 14개 수집종, 그리고 비교를 위한 들깨 1종(만백깨) 등 총 15종이었다.
0 mL min-1의 유속으로 사용하였고, split ratio는 1/50이었다. 시료의 분석 대상 성분과 머무름 시간이 중복되지 않는 campesterol을 internal standard로 사용하였다. GC/MS(HP 6890)의 경우 GC/FID에서와 동일한 조건을 유지하였고, mass spectrum을 이용한 peak의 동정을 위해 Wiley library 및 authentic standard를 mass spectrum의 비교용으로 사용하였다.
따라서 정확한 유전적 배경의 차조기 종실의 취득을 위하여 차조기 유전자원 관리 포장에서 증식된 차조기를 분양받아 실험에 사용하였다. 실험에 사용된 유전자원은 한국 수집종 6종과 일본 수집종 8종 등 차조기 14개 수집종, 그리고 비교를 위한 들깨 1종(만백깨) 등 총 15종이었다.
즉, HPLC(S1201, Sykam, German)에 컬럼으로는 SupelcosilTM LC-Si(5 μm, 25 cm × 46 mm)을 사용하였으며 이동상은 isooctane/ethyl acetate/acetic acid/2,2,-dimethoxypropane(DMP)(98.15:0.9: 0.85:0.1)을 사용하였다.
이론/모형
HPLC 및 GC 분석용 시료의 조제는 Lee & Park(2004)에 따라 수행하였다.
HPLC를 이용한 tocopherol 및 tocotrienol 분석은 8종의 vitamin E 이성질체 분리가 가능한 순상의 방법(Park & Lee, 2004)에 따라 다음과 같이 실시하였다.
Tocopherol 및 tocotrienol 분석을 위한 GC의 조건은(Cho et al., 2007)에 준하여 다음과 같이 실시하였다. 즉, GC(Varian 3800, USA)에 컬럼으로는 CP-SIL 8 CB(25 m × 0.
성능/효과
1. 순상의 HPLC 이용시 차조기에서 4종의 tocopherol 및 β-tocotrienol, γ-tocotrienol과 매우 유사한 머무름 시간의 발견되었다.
2. 그러나 동일 시료를 GC로 재분석한 결과 13개 차조기 유전자원에서 모두 4종의 tocotrienol과 일치하는 물질은 발견되지 않았다.
3. GC 이용시 δ-tocotrienol 및 γ-tocotrienol과 유사한 머무름 시간의 peak가 검출되었으나 GC/MS를 이용하여 확인한 결과 tocotrienol이 아닌 것으로 확인되었다.
4. 이상의 HPLC 및 GC 비교분석결과에 기초할 때, 차조기에는 tocotrienol류의 vitamin E는 존재하지 않는 것으로 추정되었으며 GC를 이용한 vitamin E isomer 분석이 HPLC 이용시 발생가능한 유사 머무름시간대 물질을 tocotrienol로 판단하는 오류 방지에 효과적임을 알 수 있었다.
tocopherol류로는 HPLC에서와 동일하게 α-, β-, γ-, 및 δ-등 4종의 tocopherol이 모두 검출되었으나, tocotrienol류의 경우 α-, β-, γ-, 및 δ-tocopherol 모두 일치하는 peak가 검출되지 않았다.
본 보고서의 경우 유전자원관리센터를 통해 보존, 증식되고 있는, 유전적인 배경이 분명하게 동정된 차조기를 시료로 사용하였고, 또한 국내에서 수집된 6종 및 일본 수집 8종 등 비교적 다수의 차조기를 대상으로 분석을 수행한 바, 비록 더욱 많은 자생종 차조기에 포함되어 있을 수 있는 tocotrienol의 존재 유무에 대해 완전한 결론을 내림에는 미흡하나 일반적으로 국내, 혹은 일본에서 재배되고 있는 차조기 종실에는 tocotrienol이 존재치 않음을 추정할 수 있었다. 또한 vitamin E isomer 분석에 있어서는 tocotrienol과 매우 유사한 머무름 시간대의 미지물질이 존재하여 잘못된 정성적, 정량적 결과를 초래할 위험이 높아 분취 및 GC/MS, 혹은 LC/MS 등을 이용한 동정이 선행되어야할 필요가 있음을 알 수 있었다.
또한 대조(control)로써 들깨(품종명: 만백깨) 종실을 대상으로 HPLC 분석을 수행한 결과 기타 국내산 6종의 차조기 유전자원과 일치하는 경향의 chromatogram을 나타내었으며 특이한 peak는 발견되지 않았다.
그러나 정성적인 성분 분석의 경우 제한된 개수 시료를 대상으로 하였거나 유전적 배경이 불분명할 경우 신뢰성을 확보하기 어렵다. 본 보고서의 경우 유전자원관리센터를 통해 보존, 증식되고 있는, 유전적인 배경이 분명하게 동정된 차조기를 시료로 사용하였고, 또한 국내에서 수집된 6종 및 일본 수집 8종 등 비교적 다수의 차조기를 대상으로 분석을 수행한 바, 비록 더욱 많은 자생종 차조기에 포함되어 있을 수 있는 tocotrienol의 존재 유무에 대해 완전한 결론을 내림에는 미흡하나 일반적으로 국내, 혹은 일본에서 재배되고 있는 차조기 종실에는 tocotrienol이 존재치 않음을 추정할 수 있었다. 또한 vitamin E isomer 분석에 있어서는 tocotrienol과 매우 유사한 머무름 시간대의 미지물질이 존재하여 잘못된 정성적, 정량적 결과를 초래할 위험이 높아 분취 및 GC/MS, 혹은 LC/MS 등을 이용한 동정이 선행되어야할 필요가 있음을 알 수 있었다.
실제 이들 유사 머무름 시간대의 성분 동정을 위하여 동일 시료를 GC/MS에 다시 주입하고 Wiley library 및 vitamin E 표준품의 mass spectrum에 기초한 동정을 수행한 결과 δ-T3 및 β-tocotrienol 및 γ-tocotrienol 사이에 존재하는 peak들(Fig. 3. peak A and peak B)는 tocotrienol과는 매우 상이한 물질로 판정되었으며 모든 종류의 tocotrienol isomer 표준품과 일치하는 mass spectrum의 peak는 발견되지 않았다.
한편 tocotrienol류의 경우 α-tocotrienol과 δ-tocotrienol과 일치하는 머무름 시간대의 peak는 검출되지 않았으나 β-tocotrienol과 매우 유사한 머무름 시간을 나타내는 peak 및 γ-tocotrienol과 매우 일치하는 머무름 시간의 peak가 검출되었다. 이러한 양상은 시험에 사용된 국내 수집 6종 일본 수집 8종 등 전체 14개 수집종 차조기 모두에서 동일한 양상으로 나타났다.
이상의 결과를 종합할 때, GC를 이용할 경우 차조기 내에 tocotrienol이 존재하지 않는 것으로 판단되었는데, 이는 HPLC에서 β- 및 γ-tocotrienol로 간주된 성분이 검출된 것과는 반대되는 결과였다.
전체 8종의 vitamin E isomer 중에서 tocopherol류의 경우 α-, β-, γ-, 및 δ- 등 4종의 tocopherol이 검출되었다.
한편 tocotrienol류의 경우 α-tocotrienol과 δ-tocotrienol과 일치하는 머무름 시간대의 peak는 검출되지 않았으나 β-tocotrienol과 매우 유사한 머무름 시간을 나타내는 peak 및 γ-tocotrienol과 매우 일치하는 머무름 시간의 peak가 검출되었다.
한편 대조로 들깨인 만백깨 종실을 대상으로 GC 및 GC/MS분석을 수행한 결과 국내산 6종의 차조기 유전자원 및 일본산 차조기 유전자원과 일치하는 profile의 chromatogram을 나타내 tocotrienol의 존재가 검출되지 않았다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
비타민 E란?
비타민 E는 인체 신진대사에 필수적인 지용성 비타민으로 α-, β-, γ-, δ-tocopherol(T)과 α-, β-, γ-, δ-tocotrienol(T3) 등 8종류의 이성질체를 통칭한다. 이들 이성질체들은 공통적으로 chromanol ring을 갖고 있으며 여기에 결합하는 isoprenoid side chain의 이중결합 여부에 따라 tocopherol 및 tocotrienol로 나뉘고 또한 chromanol ring에 부착되는 methyl기의 위치와 개수에 따라 α-, β-, γ-, δ- 등의 isomer로 분류된다(Fig.
비타민 E를 tocopherol 및 tocotrienol로 나누는 기준은?
비타민 E는 인체 신진대사에 필수적인 지용성 비타민으로 α-, β-, γ-, δ-tocopherol(T)과 α-, β-, γ-, δ-tocotrienol(T3) 등 8종류의 이성질체를 통칭한다. 이들 이성질체들은 공통적으로 chromanol ring을 갖고 있으며 여기에 결합하는 isoprenoid side chain의 이중결합 여부에 따라 tocopherol 및 tocotrienol로 나뉘고 또한 chromanol ring에 부착되는 methyl기의 위치와 개수에 따라 α-, β-, γ-, δ- 등의 isomer로 분류된다(Fig. 1).
비타민 E의 이성질체들이 공통적으로 가지고 있는 것은?
비타민 E는 인체 신진대사에 필수적인 지용성 비타민으로 α-, β-, γ-, δ-tocopherol(T)과 α-, β-, γ-, δ-tocotrienol(T3) 등 8종류의 이성질체를 통칭한다. 이들 이성질체들은 공통적으로 chromanol ring을 갖고 있으며 여기에 결합하는 isoprenoid side chain의 이중결합 여부에 따라 tocopherol 및 tocotrienol로 나뉘고 또한 chromanol ring에 부착되는 methyl기의 위치와 개수에 따라 α-, β-, γ-, δ- 등의 isomer로 분류된다(Fig. 1).
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