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문제 정의
- (2014)의 연구결과에서도 naphthalene과 내부표준물질인 naphthalene-D8이 분리가 되지 않아 피크가 뭉쳐져 나온 것을 확인하였다. 따라서 naphthalene을 분석할 경우 naphthalene-D8이 포함된 내부표준물질은 사용하지 않는 것을 제안한다. Yoon et al.
- 본 연구에서는 US EPA에서 관리대상 물질로 선정한 16종 PAHs 화합물을 대상으로 GC/MS와 HPLC를 이용한 PAHs 분석 특성을 비교 검토하였다. 또한 농도 범위에 따른 기기의 분석 감도, 선형성 및 정밀도를 평가하여 저농도 PAHs를 분석하기 위한 최적의 기기 분석 방법을 제시하고자 한다.
- 본 연구에서는 US EPA에서 관리대상 물질로 선정한 16종 PAHs 화합물을 대상으로 GC/MS와 HPLC를 이용한 PAHs 분석 특성을 비교 검토하였다. 또한 농도 범위에 따른 기기의 분석 감도, 선형성 및 정밀도를 평가하여 저농도 PAHs를 분석하기 위한 최적의 기기 분석 방법을 제시하고자 한다.
제안 방법
- (1997)는 λ 320 nm / 533 nm(ex/em) 파장에서 20ppm 이상의 acenaphthylene은 FLD로 피크 확인이 가능하다고 보고하고 있지만 본 연구에서는 ppb 이하 수준의 극저농도 PAHs에 대한 분석 감도를 평가 하고자 하므로 acenaphthylene의 FLD 분석은 배제하였다.
- 6㎛)을 사용하였다. Acetonitrile과 증류수를 이용하여 시간에 따라 이동상의 비율을 조절하는 Gradient eluting system으로 분석하였으며, 유량은 1.0 mL/min으로 설정하였다. 오븐 온도는 30℃로 하여 이동상의 온도 변화에 따른 머무름 시간의 영향을 최소화 하였다(Table 3).
- GC/MS는 가스크로마토그래피(Agilent 7890A, USA)에 질량분석기(Agilent 5975C, USA)가 연결된 것을 이용하였고, 물질 분리를 위해 5% phenyl, 95%methylpolysiloxane이 충진된 HP-5MS(0.25 mm×60 m,0.25 um id)컬럼을 사용하였다.
- Group 1은 GC/MS로 검출이 되지 않아 Group 2의 농도부터 15단계(농도 범위: 0.0001~1.0 ㎍/mL)로 제작된 시료를 분석하여 검량선을 구하고 선형성을 평가하였다. Group 2에서는 naphthalene, acenaphthylene, acenaphthene 3종만 검출되었으며 0.
- HPLC는 Agilent사의 1260 Infinity LC system(USA)로 분석하였고, 자외/가시광선 흡광검출기(UV/VIS absorbance detector, UVD)와 형광검출기(Fluorescence detector, FLD)를 이용하여 검출한계 및 분해능을 비교하였다. 자외/가시광선 흡광검출기는 분석 시작점부터 종료시까지 254 nm로 일정하게 유지하고, 형광 검출기는 감도를 높이기 위해 물질별로 파장을 다르게 하였다.
- 시료는 EI(Electronic Ionization) mode를 이용하여 70 eV의 에너지로 이온화하였으며, 분석 감도를 향상시키기 위해 시료의 주입 비율(Split ratio)은 Splitless mode로 하였다. PAHs 16종의 혼합 표준용액을 먼저 SCAN mode로 분석하여 각각의 머무름 시간(Retention time)과 질량스펙트럼을 확인하고, 그 결과를 바탕으로 전구이온(Precursor ion)(m/z)을 설정하여 특정 질량을 가지는 이온만을 선택 하여 검출하는 SIM(Selected Ion Monitoring) mode를 이용하여 각 물질을 정량하였다. 운반기체로 사용한 헬륨은 순도 99.
- 검출기 외 컬럼이나 이동상(Mobile phase) 등 다른 조건들은 모두 동일하게 유지하였고 컬럼은 각 물질의 분리도(Resolution)를 향상시키기 위해 Agilent사의 PAH 전용 컬럼(C18-PAH column, 5 ㎛ ×250 mm, 4.6㎛)을 사용하였다.
- 검출기에 따른 감도 비교를 위해 물질별로 분석된 area를 이용하였고, FLD로 검출된 area를 UVD로 검출된 area로 나눠준 값으로 평가하였다. 물질마다 감도 차이는 있지만 본 연구에서는 검출기에 따라 크게 150배까지 차이가 발생하였는데, 특히 acenaphthene은 검출기에 따른 감도차가 가장 컸으며 naphthalene, fluorene, benzo(k)fluoranthene, benzo(a)pyrene은 20~50배까지 FLD가 감도가 높았다(Table 5).
- 기기별 PAHs 분석법 효율 확인을 위해 선형성, 분석 정밀도 및 검출한계(Limit of detection, LOD)를 평가하였다. 선형성은 PAHs 표준용액을 주입하여 얻어진 피크의 각 농도별 면적 비로 얻어진 검량선으로부터 직선식의 상관계수(R2)로 검토하였다.
- 본 연구에서는 저농도 PAHs 분석에 대한 최적의 방법을 찾기 위해 GC/MS와 HPLC를 이용하여 분석 특성을 비교 검토 하였으며, 결과를 요약하면 다음과 같다.
- 기기별 PAHs 분석법 효율 확인을 위해 선형성, 분석 정밀도 및 검출한계(Limit of detection, LOD)를 평가하였다. 선형성은 PAHs 표준용액을 주입하여 얻어진 피크의 각 농도별 면적 비로 얻어진 검량선으로부터 직선식의 상관계수(R2)로 검토하였다. 정밀도는 각 표준물질의 반복 측정에 의한 피크면적의 상대표준편차(Relative standard deviation, RSD)로 평가하였다.
- 25 um id)컬럼을 사용하였다. 시료는 EI(Electronic Ionization) mode를 이용하여 70 eV의 에너지로 이온화하였으며, 분석 감도를 향상시키기 위해 시료의 주입 비율(Split ratio)은 Splitless mode로 하였다. PAHs 16종의 혼합 표준용액을 먼저 SCAN mode로 분석하여 각각의 머무름 시간(Retention time)과 질량스펙트럼을 확인하고, 그 결과를 바탕으로 전구이온(Precursor ion)(m/z)을 설정하여 특정 질량을 가지는 이온만을 선택 하여 검출하는 SIM(Selected Ion Monitoring) mode를 이용하여 각 물질을 정량하였다.
- HPLC는 Agilent사의 1260 Infinity LC system(USA)로 분석하였고, 자외/가시광선 흡광검출기(UV/VIS absorbance detector, UVD)와 형광검출기(Fluorescence detector, FLD)를 이용하여 검출한계 및 분해능을 비교하였다. 자외/가시광선 흡광검출기는 분석 시작점부터 종료시까지 254 nm로 일정하게 유지하고, 형광 검출기는 감도를 높이기 위해 물질별로 파장을 다르게 하였다.
- 테스트 시료는 0.00001~1.0 ㎍/mL 농도 범위의 PAHs 표준 용액을 희석하여 총 21개의 시료를 제작하고 농도별로 4 단계의 그룹으로 나누어 테스트 하였고(Group 1: 0.00001~0.0001 ㎍/mL, Group 2: 0.0001~0.001 ㎍/mL, Group 3: 0.001~0.1 ㎍/mL, Group 4: 0.1~1.0 ㎍/mL), 모든 시료는 3 세트로 만들어 7회 반복 분석하였다.
대상 데이터
- EPA TO-13A에서 지정한 우선관리대상물질 16종(benzo(a)pyrene, naphthalene 등)을 대상으로 실험 하였고, 각 물질의 화학식, 분자량, 화학 구조 및 IARC 발암 등급은 Table 1과 같다.
- PAHs 시약은 Supelco(Sigma-Aldrich, USA)사의 16종 혼합 물질(EPA 610 Polynuclear aromatic hydrocarbon mixture)을 methanol과 acetonitrile을 이용하여 단계별로 희석하였다. 기기 감도 변화에 따른 보정을 위해acenaphthene-D10, chrysene-D12, naphthalene-D8, 1,4-dichlorobenzene-D4, perylene-D12, phenanthrene-D10 6종이 포함된 deuterated 물질(EPA 8270 Semivolatile internal standard mix, Sigma-Aldrich, USA)을 내부표준물질(Internal standard)로 사용하였다. 분석에 사용된 용매 methanol과 acetonitrile은 Sigma-Aldrich사의 HPLC grade(99.
- 기기 감도 변화에 따른 보정을 위해acenaphthene-D10, chrysene-D12, naphthalene-D8, 1,4-dichlorobenzene-D4, perylene-D12, phenanthrene-D10 6종이 포함된 deuterated 물질(EPA 8270 Semivolatile internal standard mix, Sigma-Aldrich, USA)을 내부표준물질(Internal standard)로 사용하였다. 분석에 사용된 용매 methanol과 acetonitrile은 Sigma-Aldrich사의 HPLC grade(99.9%)이며, 물질 희석 및 전처리 방법은 EPA TO-13A와 NIOSH 5506 방법을 참고 하였다.
- PAHs 16종의 혼합 표준용액을 먼저 SCAN mode로 분석하여 각각의 머무름 시간(Retention time)과 질량스펙트럼을 확인하고, 그 결과를 바탕으로 전구이온(Precursor ion)(m/z)을 설정하여 특정 질량을 가지는 이온만을 선택 하여 검출하는 SIM(Selected Ion Monitoring) mode를 이용하여 각 물질을 정량하였다. 운반기체로 사용한 헬륨은 순도 99.999%를 1.0 mL/min의 유속으로 흘려주었고, 시료는 1 ㎕를 주입하였다. 자세한 분석 조건은 Table 2와 같다.
데이터처리
- 정밀도는 각 표준물질의 반복 측정에 의한 피크면적의 상대표준편차(Relative standard deviation, RSD)로 평가하였다. 검출한계는 기기가 검출 가능한 가장 낮은 농도로 표준용액을 분석하여 시료량과 이에 대한 반응간의 선형회귀식(Linear Regression Equation)과 이 회귀 방정식의 표준오차(Standard error, SE)를 구하여 계산하였다(NIOSH, 1995).
- 정밀도 평가를 위해 15 단계(Group 2~4) 농도의 시료를 각각 7번 반복 분석하였고 결과는 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)로 정량화하였다. 저농도에서 상대표준편차가 고농도에 비해 상대적으로 높은 것으로 평가되었고, 고농도일수록 반복분석에 의한 변동 없이 신뢰성 높은 값을 도출하였다.
- 선형성은 PAHs 표준용액을 주입하여 얻어진 피크의 각 농도별 면적 비로 얻어진 검량선으로부터 직선식의 상관계수(R2)로 검토하였다. 정밀도는 각 표준물질의 반복 측정에 의한 피크면적의 상대표준편차(Relative standard deviation, RSD)로 평가하였다. 검출한계는 기기가 검출 가능한 가장 낮은 농도로 표준용액을 분석하여 시료량과 이에 대한 반응간의 선형회귀식(Linear Regression Equation)과 이 회귀 방정식의 표준오차(Standard error, SE)를 구하여 계산하였다(NIOSH, 1995).
성능/효과
- HPLC 시스템 가동시 FLD와 UVD의 동시 가동으로 FLD로 검출되지 않는 acenaphthylene은 별도의 추가 분석 없이 UVD로 확인이 가능하였다. 0.001 ㎍/mL 수준의 저농도에서 비교 대상 장비 모두 20% 이하의 정밀도를 보였으며, 개별물질의 검량선은 0.95 이상의 직선성을 나타내었다.
- FLD는 Group 1의 낮은 농도까지 검출이 가능하지만 dibenz(a,h)antracene, benzo(g,h,i)perylene, indeno(1,2,3)-pyrene 3종에 대해 감도가 낮았으며, 특히 benzo(g,h,i)-perylene과 dibenz(a,h)antracene은 UVD와 감도차이가 거의 없었다. Group 1의 상관계수는 0.
- 저농도의 PAHs를 동시분석하기 위해 가장 적합한 장비는 HPLC/FLD로 GC/MS보다 20~2000배까지 감도가 높았으며, UVD와 비슷한 감도를 가지는 물질도 있지만 최대 1500배까지 감도가 뛰어났다. HPLC 시스템 가동시 FLD와 UVD의 동시 가동으로 FLD로 검출되지 않는 acenaphthylene은 별도의 추가 분석 없이 UVD로 확인이 가능하였다. 0.
- UVD와 FLD 검출기 모두 피크 뭉침이나 머무름 시간이 겹치는 물질은 없었고, 같은 농도의 샘플에서 FLD 방법이 UVD 방법보다 높은 감도를 나타내는 것을 확인하였다. FLD에서는 16종 물질 중 acenaphtylene이 검출되지 않았는데, acenaphthylene은 형광검출법에 극히 낮은 감응도를 가지기 때문에 FLD로 분석하는 것은 불가능하여 UVD나 DAD(Diode Array Detector) 분석방법을 제시하고 있다(Williams et al.
- 내부표준물질 5종을 포함하여 총 21종에 대한 피크가 검출되었으며, 총 분석시간은 55분이 소요되었다.
- 검출기에 따른 감도 비교를 위해 물질별로 분석된 area를 이용하였고, FLD로 검출된 area를 UVD로 검출된 area로 나눠준 값으로 평가하였다. 물질마다 감도 차이는 있지만 본 연구에서는 검출기에 따라 크게 150배까지 차이가 발생하였는데, 특히 acenaphthene은 검출기에 따른 감도차가 가장 컸으며 naphthalene, fluorene, benzo(k)fluoranthene, benzo(a)pyrene은 20~50배까지 FLD가 감도가 높았다(Table 5). Chen et al.
- 하지만 산업 보건분야에서 극미량의 PAHs 분석방법에 대한 고찰이 부족한 실정이며, 분석 장비들에 대한 비교 데이터가 없었던 것이 사실이다. 본 연구는 분석 장비가 GC/MS와 HPLC에 한정되어 있고, matrix가 복잡한 실제 샘플 분석을 하지 못했다는 제한점이 있지만 PAHs의 분석에 필요한 기초 데이터를 제공했다는데 의의가 있다.
- 비교 대상 분석 장비 중 HPLC/FLD가 기기검출한계가 가장 낮았으며, GC/MS와 HPLC/UVD는 물질마다 감도가 높고 낮음에 차이가 있으나 naphthalene과 acenaphthene을 제외하고 HPLC/UVD가 분석 감도가 더 높았다.
- 상대적으로 불순물 함유가 적은 공기 중 샘플 분석에는 분석 감도를 최대화하기 위해 GC/MS보다 HPLC/FLD를 이용하는 것이 적합하며, FLD로 검출되지 않는 acenapthylene은 FLD와 UVD가 동시 분석이 가능하므로 UVD의 분석 데이터를 이용하는 것이 저농도의 PAHs 분석에 최적의 방법이라고 판단된다.
- 정밀도 평가를 위해 15 단계(Group 2~4) 농도의 시료를 각각 7번 반복 분석하였고 결과는 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)로 정량화하였다. 저농도에서 상대표준편차가 고농도에 비해 상대적으로 높은 것으로 평가되었고, 고농도일수록 반복분석에 의한 변동 없이 신뢰성 높은 값을 도출하였다.
- 저농도의 PAHs를 동시분석하기 위해 가장 적합한 장비는 HPLC/FLD로 GC/MS보다 20~2000배까지 감도가 높았으며, UVD와 비슷한 감도를 가지는 물질도 있지만 최대 1500배까지 감도가 뛰어났다. HPLC 시스템 가동시 FLD와 UVD의 동시 가동으로 FLD로 검출되지 않는 acenaphthylene은 별도의 추가 분석 없이 UVD로 확인이 가능하였다.
후속연구
- PAHs는 물질의 종류가 많을 뿐만 아니라 물질 특성으로 인해 분석이 까다로운 물질 중 하나이며, 특히 낮은 농도 수준에서는 정확한 분석을 위해 특성에 맞는 장비의 선정 및 조작이 필요하다. 본 연구는 산업보건학적 개념에서 PAHs의 공기 중 노출 평가를 위한 분석 방법에 초점을 두었으며, 산업보건분야의 분석 기술 기초자료로 활용될 수 있을 것이다.
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