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문제 정의
- 할 문제중의 하나이다. 따라서 본 연구에서는 BBB의 기능을 효과적으로 억제하는 약제로 알려진 mannitol을 사용하여 그 투여경로와 용량, 농도에 따른 BBB의 변화를 관찰하고자 하였다.
- 본 실험에서는 뇌에서 약제의 효과를 직접적으로 조절하는 mannitol의 다양한 역할과 특성에 대해 연구했다. mannitobe 뇌혈관질환 및 두개강 내 뇌압조절에 이용되는 약제로서 효과가 빠르게 나타나며, 일정시간이 지나면 원상태로 BBB의 기능이 회복된다는 점에서 의학적 효용이 매우 높은 약제라 할 수 있다[3].
- mannitobe 뇌혈관질환 및 두개강 내 뇌압조절에 이용되는 약제로서 효과가 빠르게 나타나며, 일정시간이 지나면 원상태로 BBB의 기능이 회복된다는 점에서 의학적 효용이 매우 높은 약제라 할 수 있다[3]. 본연구에서는 다양한 투여 경로를 통한 mannitol 의 주입이 BBB의 조절작용을 나타내는지에 대하여 EB 염색시료를 사용하여 관찰하였고, 그 투여량과 농도가 BBB의 조절에 영향을 나타낼 수 있는지를 알아보고자 하였다.
제안 방법
- Mannitol과 Evans blue의 주입경로에 따른 뇌 단면의 변화. A: ICA를 통해 mannitol과 Evans blue 염색시료를 주입한 후 관찰한 단면의 변화, B: femoral vein을 통해서 mannitol과 Evans blue 염색시료를 주입한 후 관찰한 단면의 변화, C: ICA를 통해 mannitol을 주입하고 femoral vein을 통해 EB 염색 시료를 주입한 경우에서 나타나는 단면의 변화.
- mannitol과 Evans blue의 주입경로에 따른 변화. A와 B: ICA를 통해 mannitol과 Evans blue 염색시료를 주입한 후 관찰한 배측(A)과 북측(B)의 변회. C와 D : femoral vein을 통해서 mannitol과 Evans blue 염색 시료를 주입한 후 관찰한 배측(C)과 북측(D)의 변화.
- A와 B: ICA를 통해 mannitol과 Evans blue 염색시료를 주입한 후 관찰한 배측(A)과 북측(B)의 변회. C와 D : femoral vein을 통해서 mannitol과 Evans blue 염색 시료를 주입한 후 관찰한 배측(C)과 북측(D)의 변화. E와 F : ICA를 통해 mannitol를 주입하고 femoral vein를 통해 EB염색 시료를 주입한 경우에서 나타나는 배측(E)과 복측(F)의 변화.
- Mannitol의 투여량에 위한 변화. Femoral vein을 통해 주입한 mannitol의 양을 각 2배와 4배로 늘린 후에 나타나는 변화를 관찰하였다. A와 B : 2배의 mannitol과 2배의 EB 염색시료를 주입한 쥐에서 배측(A)과 복측(B)의 변화.
- 그림 5. Mannitol 농도에 의한 변화, 20%의 mannitol을 femoral vein을 통해 주입한 경우에 나타난 배측(A)빛 복측(B)의 변화와 2M 농도의 mannitol을 femoral vein을 통해 주입했을때 나타난 배측(C)과 복측(D)의 변화를 비교하였다.
- 4) 에 paraformaldehyde# 4%의 농도로 흐|석한 후 관류고정을 실시하였다. 관류고정이 끝난 후 뇌를 적출하였으며 4% paraformaldehyde 고정액에 24시간 동안 후고정한 뒤 0.1 M PBS 에 sucrose 를 30%의 농도로 용해한 수용액에 24시간 담가두었다 그 후 sucrose 수용액에 침지된 뇌 조직의 외형을 살펴본 후 단면을 절단하여 관찰하였다.
- 첫 번째, 약물주입을 위해 external carotid artery(ECA) 삽관한 후 internal carotid artery(ICA) 를 통해서 mannitol 과 Evans Blue(EB)를 주입하여 EB에 의한 뇌의 변화를 살펴보는 조건, 두 번째, femoral vein만을 통해서 mannitol과 EB 염색시료를 주입하여 살펴보는 조건, 세 번째로는 ICA를 통해서는 mannitol을 주입하고 femoral vein을 통해 EB 염색시료를 주입하는 방법을 각각 2마리씩 수행하였다. 또한 manmitol의 투여량에 의한 변화나 농도에 의한 차이가 나타나는지 알아보기 위하여 두 번째 조건에서 주입되는 mannitol의 양을 2배와 4배로 늘리는 실험과 고농도(2 M)의 mannitol을 투여했을 때의 변화를 알아보았다.
- Mannitol과 Evans blue의 주입경로. 심장에서 common carotid artery (CCA)를 따라 상행하여 분지되는 internal carotid artery (ICA)와 external carotid artery (ECA)중에서 ECA에 PE-50 tube를 삽관하여 약물이 ICA를 톰해 뇌로 주입되도록 하였다.
- 첫 번째, 약물주입을 위해 external carotid artery(ECA) 삽관한 후 internal carotid artery(ICA) 를 통해서 mannitol 과 Evans Blue(EB)를 주입하여 EB에 의한 뇌의 변화를 살펴보는 조건, 두 번째, femoral vein만을 통해서 mannitol과 EB 염색시료를 주입하여 살펴보는 조건, 세 번째로는 ICA를 통해서는 mannitol을 주입하고 femoral vein을 통해 EB 염색시료를 주입하는 방법을 각각 2마리씩 수행하였다. 또한 manmitol의 투여량에 의한 변화나 농도에 의한 차이가 나타나는지 알아보기 위하여 두 번째 조건에서 주입되는 mannitol의 양을 2배와 4배로 늘리는 실험과 고농도(2 M)의 mannitol을 투여했을 때의 변화를 알아보았다.
- 한편 20% 농도의 mannitol 대신 고농도(2 M)의 mannitol을 femoral vein으로 주입하여 고농도의 mannitol 투여시 나타나는 BBB의 변화를 관찰하였다. [표 2]는 2 M 농도의 mannitc)l과 EB 염색시료가 femoral vein을 통하여 주입되더라도 뇌에서 나타나는 조직의 염색변화가 나타나지 않음을 보여준다.
대상 데이터
- )으로 마취한 후 준비된 3-way catheter(PE-50)# ECA를 통해 삽관하거나 femoral vein을 통해 삽관하고, 약물을 투여하였다. Mannitole 20% (대한 D-만니톨주사액 K.P., 대한약품공업, 안 산, 한국) 농도의 용액을 5 ml/kg로 사용하였으 며 각 실험에 사용된 mannitol 주사액은 37 ℃ 를 유지시켜 변성을 방지하였다. EB 염색시료는 식염수에 2%로 희석하여 1.
- 실험동물은 urethane(1.25 ㎎/㎏, i.p.)으로 마취한 후 준비된 3-way catheter(PE-50)# ECA를 통해 삽관하거나 femoral vein을 통해 삽관하고, 약물을 투여하였다. Mannitole 20% (대한 D-만니톨주사액 K.
- 암컷 백서 (Sprague-Dawley rat, 250-300 g) 12마리를 사용하였고, 모든 동물들은 활동에 적정한 온도(22±2 ℃)를 유지시켰으며, 12 시간씩 밤과 낮을 조절하여 사육하였다. 사료와 물은 자유롭게 공급되었으며 모든 실험은 연세대학교 의료원 동물실험윤리위원회의 기준에 따라 수행되었다.
성능/효과
- 다음으로 femoral vein을 통한 mannitol과 EB 염색시료의 투여량 변화에 따라 BBB의 역할이 변화하여 나타나는지에 대해 알아보기 위하여 2배의 mannitol과 2배의 EB 염색 시료를 주입하는 조건과 4배의 mannitol과 2배의 EB 염색시료를 주입하는 조건의 실험을 수행하였는데, 그 결과 femoral vein을 통해 주입된 mannitol의 양의 변화나 EB 염색시료의 주입량에 상관없이 EB 염색시료에 의한 뇌 조직에서의 염색효과는 나타나지 않았다(그림 4).
- Mannitol과 EB 염색시료를 ICA를 통해 주입한 경우, 뇌 조직에서 EB 염색시료에 의한 변화를 관찰할 수 있었다(그림 2의 A와 B 및 그림 3의 A). 또한 뇌 조직에서 나타나는 EB 염색시료에 의한 염색의 양상은 약물이 투여된 경로의 동측(ipsilateral side) 부위만이 염색되어 나타났으며, 대측(contralateral side) 부위에서는 염색이 나타나지 않음을 관찰했다. Mannitol이 femoral vein을 통해 주입된 경우에서는 뇌 조직에서의 EB 염색시료에 의한 염색은 나타나지 않았다(그림2의 C와 D 및 그림 3의 B).
- 정맥을 통해 주입된 EB 염색시료가 두개강 안쪽으로 침투한 결과는 ICA를 통한 mannitol의 주입이 femoral vein 을 통해 주입된 mannitol보다 BBB를 조절하는 효과를 증진시키는 것으로 볼 수 있기 때문이다. 또한, 높은 농도(2 M)의 고장수액 mannitol을 정맥을 통해 주입한 실험에서는 두개강 안쪽 뇌실 부위에 미량의 EB 염색시 료에 의한 조직의 염색이 나타났는데' 이는 신 장의 세뇨관에서 미처 여과되지 못한 mannitol이 BBB에서 미약하게나마 그 기능을 한 것으로 생각할 수 있다.
- 본 실험에서는 백서에서의 mannitol의 투여 경로와 투입량, 농도에 의해 BBB의 조절 능 력이 어떻게 변화하는지를 관찰하였으며, 결과 적으로 ICA를 통한 mannitol의 투여만이 효과적인 BBB의 조절작용을 나타냄을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 뇌에 작용하는 약물의 작 용이 BBB의 조절을 통해 가능함을 보여주었 고, 이는 다양한 연구 장면에서 두개강내 약물 의 전달이 인간의 감성을 비롯한 다양한 뇌기 능에 미치는 효과를 알아보는데 유용한 기초 자료가 될 수 있을 것으로 생각된다.
- 실험결과 ICA를 통한 mannitol과 EB 염색 시료의 투여는 효과적으로 BBB의 역할을 억제하여 뇌의 내부와 피질 부위를 염색시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 mannitol의 투여 후뇌에 분포하는 모세혈관(capillary)을 구성하는 내피세포(endothelial cell)의 구조가 변화되었으며, 그 결과 EB 염색시료가 두개강 안쪽으로 흡수될 수 있었음을 암시한다.
- 이러한 결과는 mannitol의 투여 후뇌에 분포하는 모세혈관(capillary)을 구성하는 내피세포(endothelial cell)의 구조가 변화되었으며, 그 결과 EB 염색시료가 두개강 안쪽으로 흡수될 수 있었음을 암시한다. 그러나 femoral vein을 통해 mannitol과 EB 염색시료를 투여했을 때에는 두개강 안으로의 EB 염색 시료의 침투가 나타나지 않았는데, 이는 femoral vein 을 통해 투여된 mannitole BBB를 효과적으로 변화시키지 못했음을 나타낸다.
- 결과로 나타났다. 이상의 결과는 mannitol의 투여경로에 따라 BBB의 변성이 일어났는가를 알 수 있는 주요한 근거가 될 수 있다.
- 이와 달리 mannitoK ICA를 통해 주입하고 EB 염색시료를 femoral vein을 통해 주입한 경우에는 뇌 조직에서의 염색이 나타났으며, 그 정도가 ICA를 통해 mannitol과 EB 염색시료가 주입된 경우보다 적은 중간 정도의 부분적인 변화를 관찰할 수 있었는데(그림 2의 E와 F 및 그림 3의 C), 이는 mannitol과 EB를 모두 ICA를 통해 주입한 집단과 비교해 볼 때 불완전한 염색의 결과로 나타났다. 이상의 결과는 mannitol의 투여경로에 따라 BBB의 변성이 일어났는가를 알 수 있는 주요한 근거가 될 수 있다.
- 표에서 볼 수 있는 바와 같이 동측(ipsilateral side) 이 온전히 염색된 경우는 ICA를 통하여 mannitol과 EB 염색시료가 주입된 경우 뿐이었으며, 이를 제외한 경우에서는 뇌에서의 EB 염색시료에 의한 염색이 불완전하게 나타나거나, 나타나지 않음을 관찰할 수 있었다. 또한 mannit 이이 ICA나 femoral vein 중 어느 곳으로 주입되더라도 대측 (contralateral side)에서의 염색효과는 전혀 관찰할 수 없었다.
후속연구
- 본 실험에서는 백서에서의 mannitol의 투여 경로와 투입량, 농도에 의해 BBB의 조절 능 력이 어떻게 변화하는지를 관찰하였으며, 결과 적으로 ICA를 통한 mannitol의 투여만이 효과적인 BBB의 조절작용을 나타냄을 알 수 있었다. 이러한 결과들은 뇌에 작용하는 약물의 작 용이 BBB의 조절을 통해 가능함을 보여주었 고, 이는 다양한 연구 장면에서 두개강내 약물 의 전달이 인간의 감성을 비롯한 다양한 뇌기 능에 미치는 효과를 알아보는데 유용한 기초 자료가 될 수 있을 것으로 생각된다.
- 즉 약물에 의해 조절되는 감성의 변화를 관찰하는 데에 있어서 보다 직접적이고 정확한 방법을 제공 할 수 있다. 이러한 특징은 외상에 의해 일어 나지 않는 다양한 뇌질환과 더 나아가 Alzheimer씨 병과 같은 심각한 질병의 치료방 법에도 적용할 수 있으며, BBB의 방해없이 치료 약제를 빠른 시간 안에 원하는 뇌 부위에 근접시킬 수 있는 장점을 가지기 때문에 사용이 어려웠던 다양한 약제들에 대한 임상 실험을 기대할 수 있다.
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