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문제 정의
- 이 연구는 다양한 염분조건에 노출된 둥근전복(H discus 决心/s)의 유리아미노산 변화를 분석함으로써 염분 변화에 반응하는 전복의 생리적 변화를 규명하였다.
- 이 연구는 염분 변화가 둥근전복(Haliotis discus discus)^\ 유리 아미노산(FAA) 조성에 미치는 영향을 조사하고자 염분 15, 20, 25, 30, 35, 40 psu에 각각 24 h, 48 h, 120 h 노출 시킨 후 총 13가지 FAA의 함량 변화를 HPLC를 이용하여 분석하였다. 시료 중 15 psu에 노출된 전복 전량기 24 h 이내 폐사하였고, 20 psu에 노출된 시료의 경우 전체 20 개체 중 8개체가 48 h 이내 사망하였다.
제안 방법
- 5°C, 염분 32〜33 psu에서 충분한 먹이(생다시마, 생미역)를 공급하며 60 L사각형 FRP (600x400x300 mm) 수조에 순치하였다. 실험조건은 (1) 대조구 35 psu, (2) 저염 stress 15 psu, 20 psu, 25 psu, 30 psu, (3) 고염 stress 40 psu로" 각각 설정하고, 각 수조당 20마리의 전복을 수용하였다. 사육수는 여과 해수를 사용하였고, 염분 조절은 증류수와 천일염을 이용하여 조절하였으며, 염분, 수온 및 용존산소(DO)를 측정하였다.
- FAA 분석을 위해 시료의 아가미를 적출하였으며, 5개체의 적출된 아가미들을 모아 한 실험구로 만들어 실험에 사용하였다. FAA 추출을 위하여 절단한 아가미 조직을 4°C 에서 초음파 분쇄기를 사용하여 균질화 시킨 후 원심분리 하였다. 단백질과 DNA를 침전시키기 위해 상등액에 10% trichloroacetic acid (TCA) 를첨가하였다.
- FAA 추출을 위하여 절단한 아가미 조직을 4°C 에서 초음파 분쇄기를 사용하여 균질화 시킨 후 원심분리 하였다. 단백질과 DNA를 침전시키기 위해 상등액에 10% trichloroacetic acid (TCA) 를첨가하였다. 원심분리 후, FAA를 함유한 상등액을 분리하였다.
- 원심분리 후, FAA를 함유한 상등액을 분리하였다. 분리된 FAA는 Ether로 수 회 세척하여 TCA를 제거한 후, HPLC (Vintage 2000, Oromtech)를 이용하여 아미노산 분석을 실시하였다. FAA 분석을 위하여 적정농도로 희석된 시료 1 mL와 100 卩L의 O-phthaldialdehyde-acetyl-L-cystein (OPA)ZN-acetyl L-cystein (NAC)를 2분간 교반하여 유도체화 한 후, 20(1L를 HPLC에 주입하였으며 이때 이동상(mobile phase)은 sodium acetate buffer와 methanol을 이용하였다.
- 실험조건은 (1) 대조구 35 psu, (2) 저염 stress 15 psu, 20 psu, 25 psu, 30 psu, (3) 고염 stress 40 psu로" 각각 설정하고, 각 수조당 20마리의 전복을 수용하였다. 사육수는 여과 해수를 사용하였고, 염분 조절은 증류수와 천일염을 이용하여 조절하였으며, 염분, 수온 및 용존산소(DO)를 측정하였다.
- 아미노산의 정성 분석을 위하여 표준 아미노산 시약 13종(Aspartic acid, Glutamic acid, Serine, Threonine, Glycine, Taurine, Alanine, Tyrosine, Valine, Methionine, Phenolic acid, Isoluecine, Leucine)을 HPLC 를 이용하여 분석하고, 여기서 얻어진 retention time에 따라 동일한 분석 조건에서 나타난 시료의 peak를 비교함으로써 아미노산을 동정하였다. 아미노산 정량은 아미노산 표준 시약을 0.25, 1.25, 2.5, 10nmo로 희석 한 후 각각의 농도에서 얻은 peak의 면적과의 상관식을 구하고 여기에 시료의 면적을 대입함으로써 최종 시료의 아미노산 농도(|imol/g dry tissue)를 정랑하였다.
- FAA 분석을 위하여 적정농도로 희석된 시료 1 mL와 100 卩L의 O-phthaldialdehyde-acetyl-L-cystein (OPA)ZN-acetyl L-cystein (NAC)를 2분간 교반하여 유도체화 한 후, 20(1L를 HPLC에 주입하였으며 이때 이동상(mobile phase)은 sodium acetate buffer와 methanol을 이용하였다. 아미노산의 정성 분석을 위하여 표준 아미노산 시약 13종(Aspartic acid, Glutamic acid, Serine, Threonine, Glycine, Taurine, Alanine, Tyrosine, Valine, Methionine, Phenolic acid, Isoluecine, Leucine)을 HPLC 를 이용하여 분석하고, 여기서 얻어진 retention time에 따라 동일한 분석 조건에서 나타난 시료의 peak를 비교함으로써 아미노산을 동정하였다. 아미노산 정량은 아미노산 표준 시약을 0.
- 염분 변화에 따른 시료의 FAA 분석을 위하여 실험시작 전 (Day 0), 실험시작 후 24시간(Day 1), 48시간(Day 2), 120시간 (Day 5) 마다 실험구별로 각각 5마리씩 무작위 선별하였다. FAA 분석을 위해 시료의 아가미를 적출하였으며, 5개체의 적출된 아가미들을 모아 한 실험구로 만들어 실험에 사용하였다.
대상 데이터
- FAA 분석을 위해 시료의 아가미를 적출하였으며, 5개체의 적출된 아가미들을 모아 한 실험구로 만들어 실험에 사용하였다. FAA 추출을 위하여 절단한 아가미 조직을 4°C 에서 초음파 분쇄기를 사용하여 균질화 시킨 후 원심분리 하였다.
- 실험 에 사용된 둥근 전복은 제주도 해양수산자원연구소에서 생산되었으며, 평균 각장 54.43±0.17mm, 중량 11.95±0.61 g이었다. 실험에 쓰인 전복은 실험환경에 적응할 수 있도록 실험 시작 전까지 수온 16.
성능/효과
- 30 psu에서 배양된 전복은 실험 기간 동안 모든 FAA 함량이 감소하는 것이 관찰되었다. 노출 Day 5 후 Taurine이 48.
- 시료 중 15 psu에 노출된 전복 전량기 24 h 이내 폐사하였고, 20 psu에 노출된 시료의 경우 전체 20 개체 중 8개체가 48 h 이내 사망하였다. FAA 중 Taurine, Glycine, Alanine의 함량이 가장 높았으며 , 이중 Taurine의 함량은 114 “mol/g dry tissue weight 로써 전체 FAA의 77%를 점유하였다. 저염 및 고염 환경에 노출된 시료의 FAA 함량은 분석 기간 동안 감소하는 경향을 나타냈다.
- 특히 이 같은 현상은 저염에 노출된 기간이 길어질수록 더욱 뚜렷한 경향이 관찰되었다. T:G ratio의 증가는 고염 실험구에서 저염에 노출시 만큼 증가하지는 않았으나 염분이 높은 환경에서도 시간이 경과함에 따라 증가하는 경향을 나타냈고 노출 시간이 지속 될수록 그 비율 또한 상승하였다.
- 반면 필수아미노산인 Methionine은 노출 48 h吊터 20, 25, 40 psu에서 검출되지 않았고 노출 120 h 후에는 대조구를 제외한 전 실험구에서 측정되지 않았다. Taurine 과 Glycine 비율(T:G ratio)은 저염 환경에 노출된 시료에서 높게 나타났으며, 저염에 노출된 기간이 길어질수록 더욱 뚜렷한 경향이 관찰되었다. 이 같은 현상은 염분이 높은 환경에서도 나타났고 노출 시간이 지속 될수록 그 비율은 상승하였다.
- 이는 저염분 실험구의 경우 Taurine 함량이 시간이 증가할수록 증가하고, 대조구 및 염분 함량이 비슷한 실험구(30 psu, 40 psu)의 경우에는 낮아진 것에 기인한다. Taurine을 제외한 다른 FAA 성분들은은 시간이 지날수록 점 점 낮아지는 경향을 보였지만, Taurine의 경우 저염 구에서 함량^ 증가하는 반대의 결과를 보였다. 또한, 대조 구에서도 FAA가 시간에 따른 변화를 보이며 감소하는 이유는 먹이 공급 중단에 따른 단백질 분해에 기인한 것으로 사료된다.
- 결론적으로 이번 실험에서 수행된 다양한 염분에 노출시킨전복의 FAA 조성의 경우, 저염에 노출시킨 실험구에서 실험 시간이 경과할수록 FAA의 함량이 증가하는 것으로 나타났다. 이중 Taurine이 급격히 상승하여 총 FAA의 80% 이상을 차지하였는데, 이는 둥근전복이 저염분의 환경 변화에 유지하기 위하여 Taurinei- 분비하는 것으로 사료된다.
- (2003)의 연구에서도 마찬가지로 참굴을 저염 실험 구로 옮겨 사육 하였을 때 Taurine 농도가 50% 이상 감소하였으며, 반대로 고염 실험구로 옮겨 사육 하였을 때는 Taurine 농도가 30% 이상 증가하는 것이 관찰되었다. 그러나 본 연구에서 둥근전복은 노출 1일 후 Taurine 농도는 저염에서 낮게 검출된 반면, 노출 기간이 길고 염분도가 낮을수록 Taurine의 농도가 증가하였다. 따라서 저염에 대한 Taurine 농도의 변화는 노출 기간과 염분도에 따라 변화하는 것으로 사료되며 노출 기간을 늘리는 등 삼투압 조절에 대한 Taurine의 역할을 규명하기 위한 보다 심도 있는 연구가 요구된다.
- 노출 Day 1 후 Taurine의 총량은 93.4 gmol/g dry tissue로 총 FAA 함량의 약 70%를 차지하였으며, Glutamic acid과 Alanine0) 각각 10.7 gmol/g dry tissue 과 8.2 gmol/g dry tissue 이었다. 다른 염분 처리구와는 상대적으로, 이 실험구에서는 노출 Day 5 이후 총 FAA 농도가 증가하였다.
- 8 μmol/ g dry tissue로 급격히 감소하였고, 이러한 현상은 다른 아미노산의 경우에서도 관찰되었다. 노출 Day 5 후 Taurine, Glycine 그리고 Alanine이 총 FAA의 95%를 차지하였다. Methionine, Phenylalanine 그리고 Leucine의 경우 노출 Day 2 이어 Day 5 이후에도 이 실험구에서는 검출되지 않았다(Table 3).
- 감소하는 것이 관찰되었다. 노출 Day 5 후 Taurine이 48.5 卩mol/g dry tissue로 총 FAA 중 80%를 차지하였으며, Alanine 과 Glycine이 각각 3.6 |imol/g dry tissue 과 2.9 卩mol/g dry tissue로 나타났다. 한편 Methionine은 노출 Day 5 후 검출되지 않았다.
- 5 卩mol/ g dry tissue로 다른 실험구들과 마찬가지로 총 FAA의 70%를 차지하고 있었다. 노출 시간이 경과함에 따라 각각의 아미노산 함량과 총 FAA 함량은 감소하는 경향을 보였으나 Taurine의 경우 노출 Day 2 과 Day 5 에 100.8 卩mol/g diy tissue, 122.3 卩mol/ g dry tissue으로 농도가 노출 Day 1 에 비해 증가하는 것을 관찰할 수 있었다. 특히 Methionine의 경우 노출 Day 2 이후 검출되지 않았다(Table 3).
- 노출 시간이 지남에 따라 총 FAA는 30 psu 염분 처리 구와 마찬가지로 급격히 감소하는 것을 관찰할 수 있었다. 이들 아미노산 중 Taurine 이 103.
- 다양한 염분에 노출된 전복의 FAA 함량은 저염분에 노출된 실험 구의 경우 시간이 경과함에 따라 전반적으로 대조구(35 psu) 및 대조구와 비슷한 염분(30 psu, 40 psu)에 노출된 실험 구보다 높아지는 경향이 관찰되었다. 이는 저염분 실험구의 경우 Taurine 함량이 시간이 증가할수록 증가하고, 대조구 및 염분 함량이 비슷한 실험구(30 psu, 40 psu)의 경우에는 낮아진 것에 기인한다.
- 5의 범위를 나타내어 수조간 실험 기간 동안 유사한 수질 조건을 나타내었다. 둥-근전복의 생존율은 염분 15 psu에 노출되었던 개체들이 입식 후 24시간 이내 전 개체가 사망하였으며, 염분 20 psu 의 실험구에서는 48시간 이내 8개체가 사망하였다. 그러나 다른 염분의 실험구에서는 실험 종료 시기인 5일 후까지 100% 생존율을 보였다.
- 둥근전복에서 Taurine, Glycine, Alanine 등 비필수 아미노산과는 대조적으로 필수 아미노산인 Threonine, Valine, Methionine, Phenylalanine, Leucine, Isoleucine 등은 염분에 상관없이 저염과 고염의 환경에서 대조구와 비교하여 현저히 감소하였다. 특히 Methionine으] 경우 저염과 고염에 노출된 후 2일 후부터 실험 종료시까지 실험구에서는 전혀 검출되지 않았다.
- 이중 Taurine이 급격히 상승하여 총 FAA의 80% 이상을 차지하였는데, 이는 둥근전복이 저염분의 환경 변화에 유지하기 위하여 Taurinei- 분비하는 것으로 사료된다. 또한, 다양한 염분 변화에 따른 변화를 보이는 T:G ratio는 둥근전복의 염분 스트레스에 대한 지수로 사용할 수 있는 것으로 판단된다.
- 4 gmol/g dry tissue로 다른 필수 아미노산의 함량보다 상대적으로 높았으나, 전반적으로 비 필수 아미노산에 비하여 낮은 함량을 보였다. 실험 시작 Day 5 이후 Aspartic acid 및 Tyrosine을 제외한 나머지 아미노산 함량이 급격히 감소하는 것을 관찰할 수 있었고, 총 FAA 함량 또한 286.0 gmol/g dry tissue에서 111.1 |imol/g dry tissue로 현저히 감소하는 것이 관찰되었다.
- 실험기간 동안 관찰된 대조구 전복의 FAA 농도변화는 실험 시작 Day 1 이후 비 필수 아미노산인 Taurine (131.8 gmol/g diy tissue), Alanine (43.3 pimol/g dry tissue), Glycine (31.1 gmol/g dry tissue) 등이 총 FAA 함량 중 70% 이상을 차지하며 가장 높게 나타났으며, Glutamic acid와 Serine 등이 각각 18.4 卩mol/ g dry tissue 와 16.9 gmol/g dry tissue 순으로 높게 나타났다 (Table 3). 한편 필수 아미노산은 Threonine이 11.
- 실험에 앞서 분석된 둥근전복 아가미 FAA는 비 필수 아미노산인 Aspartic acid (Asp), Glutamic acid (Glu), Serine (Ser), Glycine (Gly), Taurine (Tau), Alanine (Ala), Tyrosine (lyr) 과, 필수 아미노산인 Threonine (Thr), Valine (Vai), Methionine (Met), Phenylalanine (Phe), Isoleucine (Lie), Leucine (Leu) 등으로, 이중 비 필수 아미노산인 Tauine이 114.1 gmol/g dry tissue 으로 가장 높은 함량을 나타냈으며 Glutamic acid, Alanine, Aspartic acid 등이 각각 8.4, 7.4, 7.1 pmol/g dry tissue의 함량을 보였다. 이들 4종류의 비 필수 아미노산은 둥근전복의 총 FAA 구성성분 중 약 90% 이상을 차지하고 있었다.
- 실험에 앞서 측정된 둥근전복 아가미의 FAA 구성은 비 필수 아미노산인 Aspartic acid, Glutamic acid, Serine, Glycine, Taurine, Alanine, Tyrosine 7종과 필수 아미노산인 Threonine, Valine, Methionine, Phenylalanine, Isoleucine, Leucine 6송 둥 함유량이 높은 성분들을 중심으로 총 13종만 분석한 결과, 이들 아미노산 중 Taurine이 전체의 약 77%를 차지하고 있으며, 이어서 Glutamic acid, Aspatic acid, Alanine, Glycine 등의 순서였다. 이들 비 필수 아미노산 5종의 아미노산 함량은 전복 아가미 전체 FAA의 96%를 이루고 있었으나, 필수 아미노산은 극히 소량으로 존재함이 확인 되었다.
- 본 둥근전복에서도 다른 연구 결과와 유사한 경향의 결과가 나타났다. 염분 변화를 스트레스 조건으로 삼은 이번 실험에서 대조구인 35 psu 에 노출된 전복의 실험 시간에 따른 T:G ratio는 3.6-5.1의 범위였으나, 저염에 노출시킨 실험구(5.8-30.5)와 고염에 노출시킨 실험구(7.1-13.4) 모두 T:G ratio가 대조구보다 높았다. 특히 이 같은 현상은 저염에 노출된 기간이 길어질수록 더욱 뚜렷한 경향이 관찰되었다.
- 한편 Methionine은 노출 Day 5 후 검출되지 않았다. 이 처리구에서는 다른 저염 처리구와는 달리 Taurine이 대조 구와 같이 노출 시간이 지남에 따라 감소하는 경향을 나타냈다(Table 3).
- 1 pmol/g dry tissue의 함량을 보였다. 이들 4종류의 비 필수 아미노산은 둥근전복의 총 FAA 구성성분 중 약 90% 이상을 차지하고 있었다. 반면, 필수아미노산의 함량은 0.
- 이들 비 필수 아미노산 5종의 아미노산 함량은 전복 아가미 전체 FAA의 96%를 이루고 있었으나, 필수 아미노산은 극히 소량으로 존재함이 확인 되었다. Hatae et al.
- 1). 이번 실험 결과 시간이 경과함에 따라 T:G ratio가 저염분에 노출된 실험구에서 뚜렷이 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 고염분의 환경에서도 노출 시간이 지속 될수록 비율이 상승하는 것을 볼 수 있었다.
- 이 같은 현상은 염분이 높은 환경에서도 나타났고 노출 시간이 지속 될수록 그 비율은 상승하였다. 이상의 결과는 FAA 특히 Taurine, Glycine, Methionine 등이 둥근전복의 삼투조절에 중요한 기능을 담당하는 것을 의미하며, FAA 분석은 염분 변화에 따른 둥근전복의 삼투조절 및 생리 특성을 이해하는데 유용한 방법임을 제시하였다.
- FAA 중 Taurine, Glycine, Alanine의 함량이 가장 높았으며 , 이중 Taurine의 함량은 114 “mol/g dry tissue weight 로써 전체 FAA의 77%를 점유하였다. 저염 및 고염 환경에 노출된 시료의 FAA 함량은 분석 기간 동안 감소하는 경향을 나타냈다. 그러나 Taurine의 농도는 노출 후 24 於] 경과하였을때까지 대조구 보다 낮았으나 노출 48 h 후부터는 저염 환경인 20 psu 및 25 psu에서 증가하여 분석 종료 시점인 노출 120 h 이 되었을 때까지 급격히 증가하였다.
- 6으로 Day 1 의 노출된 실험구보다 낮은 값을 나타냈다. 한편, 20 psu, 25 psu의 실험구에서는 노출 Day 5 후 T:G ratio가 각각 30.5 와 30.3으로 이번 실험에서 가장 높게 나타나는 것을 관찰할 수 있었고, 대조구와 비슷한 염분인 30 psu, 40 psu에서도 17.0과 13.4로 대조구보다 높게 나타나는 것을 관찰할 수 있었다(Fig. 1). 이번 실험 결과 시간이 경과함에 따라 T:G ratio가 저염분에 노출된 실험구에서 뚜렷이 증가하는 것을 관찰할 수 있었고, 고염분의 환경에서도 노출 시간이 지속 될수록 비율이 상승하는 것을 볼 수 있었다.
후속연구
- 그러나 본 연구에서 둥근전복은 노출 1일 후 Taurine 농도는 저염에서 낮게 검출된 반면, 노출 기간이 길고 염분도가 낮을수록 Taurine의 농도가 증가하였다. 따라서 저염에 대한 Taurine 농도의 변화는 노출 기간과 염분도에 따라 변화하는 것으로 사료되며 노출 기간을 늘리는 등 삼투압 조절에 대한 Taurine의 역할을 규명하기 위한 보다 심도 있는 연구가 요구된다.
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