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문제 정의
- 라벤더 에탄올 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과는 이들이 tyrosinase 유전자 발현을 조절할 수 있다는 가능성을 제시한다. 따라서 라벤더 에탄올 추출물이 이들 유전자의 발현을 조절하는지 조사하기 위하여 유전자 증폭기술을 응용한 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 방법으로 tyrosinase 유전자의 primer를 이용 하여 mRNA의 발현을 분석하였다.
- 라벤더 에탄올 추출물이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 조사 하기 위하여 본 연구에서는 먼저 멜라닌 합성의 속도조절 효소로 작용하는 tyrosinase의 활성을 측정하였다. 라벤더 추출물 처리 시 12.
- 이에 저자들은 예로부터 피부 미용과 피부질환의 치료에 이용되어온 라벤더의 멜라닌 합성에 미치는 영향을 알아보고자 B16/F10 세포를 이용하여 멜라닌 자극 호르몬인 α-melanocyte stimulating hormone(α-MSH)를 처리하여 과색소 현상을 유도한후, 라벤더 에탄올 추출물의 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성에 미치는 영향을 조사하였다.
제안 방법
- 2) 용액으로 4시간 동안 실온에서 반응시켰다. 10% formylsaline으로 재고정하고 50%, 70%, 95%, 100% 알콜로 탈수시킨 다음 봉입하여 광학현미경으로 관찰하였다.
- 1M PMSF]로 세포를 용해하였다. 4℃, 13,000 rpm에서 30분간 원심분리를 하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성측정 용액으로 사용하였고, protein assay 용액(Bio Rad, USA) 으로 595 nm에서 흡광도를 측정, 동량의 단백질 양을 계산하였다. 시료 50 ㎕와 0.
- i-Master mix PCR kit(iNtRON)에 합성된 cDNA 2 ㎕와 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 primer를 넣은 후 중합효소 연쇄반응을 시행하였다. 94℃에서 5분간 1회 반응시킨 후 94℃에서 20초, 55℃에서 10초, 72℃에서 50초로 총 35회 반복하였으며 최종적으로 72℃에서 5분간 1회 반응시켰다. 이를 2% agarose gel에 전기 영동하여 정량하였다.
- B16/F10 세포를 6 well 배양용기에 5×104 개/well씩 분주하여 24시간 동안 배양하여 세포를 부착시킨 후, 라벤더(12.5, 25, 50 ㎍/㎖)와 α-MSH(20 nM)를 각각 처리하고 3일간 배양하였다.
- B16/F10 세포를 직경 10 ㎝ 배양용기에 3×105개씩 분주하여 부착시킨 후, 시료를 처리하여 3일 동안 배양하고 각 군당 5×106 개의 세포를 수거하여 멜라닌을 측정하였다.
- Chamber slide(Nunc)의 각 well에 1×104개의 세포를 분주하여 24시간 배양 후 교맥 50 ㎍/㎖, 100 ㎍/㎖과 α-MSH(100 nM)을 각각 처리하였다.
- cDNA는 2 ㎍의 RNA와 Maxime RT PreMix Oligo dT primer(iNtRON Biotechnology)를 넣고 45℃에서 1시간, 95℃에서 5분간 반응시킨 후 급랭시켜 합성하였다. i-Master mix PCR kit(iNtRON)에 합성된 cDNA 2 ㎕와 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 primer를 넣은 후 중합효소 연쇄반응을 시행하였다. 94℃에서 5분간 1회 반응시킨 후 94℃에서 20초, 55℃에서 10초, 72℃에서 50초로 총 35회 반복하였으며 최종적으로 72℃에서 5분간 1회 반응시켰다.
- 라벤더 에탄올 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과는 이들이 tyrosinase 유전자 발현을 조절할 수 있다는 가능성을 제시한다. 따라서 라벤더 에탄올 추출물이 이들 유전자의 발현을 조절하는지 조사하기 위하여 유전자 증폭기술을 응용한 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 방법으로 tyrosinase 유전자의 primer를 이용 하여 mRNA의 발현을 분석하였다. B16/F10세포에 라벤더 에탄올 추출물을 12.
- 따라서 본 실험에서 자외선, pro-inflammatory cytokine 및 호르몬과 같은 여러 인자에 의해 멜라닌 색소 침착이 증가된 경우, 라벤더의 에탄올 추출물의 효과를 조사하기 위하여 α-MSH 로 B16/F10 세포의 멜라닌 합성을 유도하였다.
- 라벤더 에탄올 추출물을 α-MSH 처리군과 함께 12.5 ㎍/㎖ 및 25 ㎍/㎖의 농도로 5일 동안 처리하고, 각 군당 1×106 개/dish 를 수집한 다음 멜라닌 양을 측정하였다.
- 라벤더 에탄올 추출물이 멜라닌 합성 조절 기전에 미치는 영향을 조사하고자, B16/F10 세포에 α-MSH를 처리하여 과색소 현상을 유도한 후 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성 및 tyrosinase 유전자 발현에 미치는 영향을 조사하였다.
- 멜라닌 정량은 Hosei16)등의 방법을 변형하여 사용하였다. B16/F10 세포를 직경 10 ㎝ 배양용기에 3×105개씩 분주하여 부착시킨 후, 시료를 처리하여 3일 동안 배양하고 각 군당 5×106 개의 세포를 수거하여 멜라닌을 측정하였다.
- 4℃, 13,000 rpm에서 30분간 원심분리를 하여 얻은 상층액을 tyrosinase 활성측정 용액으로 사용하였고, protein assay 용액(Bio Rad, USA) 으로 595 nm에서 흡광도를 측정, 동량의 단백질 양을 계산하였다. 시료 50 ㎕와 0.1M sodium phosphate buffer 150 ㎕, 0.1 M catechol 50 ㎕를 분주하여 혼합한 후 ELISA reader로 37℃에서 405 nm의 파장으로 1시간동안 10분 간격으로 흡광도의 변화를 측정하였다. 활성율은 대조군의 흡광도를 기준으로 한 백분율로 환산하여 결과로 나타내었다.
- 한편 멜라닌 색소는 각 군당 5×106개의 세포를 수거하여 육안적으로 멜라닌세포의 색깔을 관찰하였다.
대상 데이터
- B16/F10 멜라닌세포주는 한국 세포주 은행에서 분양받아 10% fetal bovine serum(FBS)이 첨가된 Dulbecco's modified eagle medium(DMEM)을 사용하여 CO2 배양기(37℃, 5% CO2) 에서 배양하였다.
- 라벤더는 자연사랑 영농조합에서 구입하였으며 100 g에 ethanol 1 ℓ를 가하고 밀봉하여 6 시간 동안 실온에서 냉침 시킨 후 거즈로 여과하여 1차적으로 침전물을 걸러 내었다. 원심분리를 통하여 2차적으로 침전물과 추출액을 분리한 후 감압농축기(rotary evaporator)로 상온에서 농축하여 14.
데이터처리
- 실험 결과는 One way ANOVA test를 이용하여 p-value를 구하여 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- 세포 내 tyrosinase 활성은 Matinez-Esparza 등15)의 방법으로 측정하였다. B16/F10 세포를 6 well 배양용기에 5×104 개/well씩 분주하여 24시간 동안 배양하여 세포를 부착시킨 후, 라벤더(12.
성능/효과
- 따라서 라벤더 에탄올 추출물이 이들 유전자의 발현을 조절하는지 조사하기 위하여 유전자 증폭기술을 응용한 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR) 방법으로 tyrosinase 유전자의 primer를 이용 하여 mRNA의 발현을 분석하였다. B16/F10세포에 라벤더 에탄올 추출물을 12.5, 25 ㎍/㎖ 농도로 처리하고 3일간 배양 후 tyrosinase 유전자 발현을 측정한 결과, tyrosinase 유전자 발현은대조군에 비하여 유의성 있는 변화를 보이지 않았다(Fig. 4). 그러나 α-MSH 처리군은 대조군에 비하여 증가하였으며, α-MSH와라벤더 병용처리군은 α-MSH 단일 처리군에 비하여 tyrosinase mRNA의 발현이 감소하였음을 알 수 있었다(Fig.
- 따라서 DOPA 염색을 이용하여 멜라닌세포의 tyrosinase의 활성을 관찰한 결과, α-MSH 처리군은 대조군에 비하여 tyrosinase의 활성이 현저히 증가하였으며, α-MSH와 라벤더 처리군은 α-MSH 단일 처리군에 비하여 tyrosinase의 활성이 감소 하였음을 알 수 있었다(Fig. 3).
- 또한 tyrosinase mRNA 발현에 미치는 영향을 조사하기 의하여 RT-PCR을 수행한 결과, 라벤더 추출물 단일 처리군에서 대조군에 비해 유의성 있는 변화를 보이지 않았다. 그러나 α-MSH 처리군은 대조군에 비하여 증가하였으며, α-MSH와 라벤더 병용처리군은 α-MSH 단일 처리군에 비하여 tyrosinase mRNA의 발현이 감소하였음을 알 수 있었다.
- 또한 수지상 돌기는 α-MSH 처리 군에서 현저히 증가하였고, 라벤더 병용 처리군에서 현저히 감소 하였다(Fig. 3).
- 라벤더 에탄올 추출물은α-MSH에 의하여 증가된 tyrosinase 활성도를 효과적으로 감소시켰다. 라벤더 에탄올 추출물이 tyrosinase 유전자 발현에 미치는 영향을 조사한 결과, α-MSH와 라벤더 병용 처리군에서 α-MSH 단일 처리군에 비하여 tyrosinase mRNA의 발현이 감소되었다.
- 라벤더 추출물 처리 시 12.5, 25 ㎍/㎖ 농도에서 각각 108%, 80%로 유의하게 tyrosinase의 활성이 감소하였고, α-MSH 처리 시 547±4.7 %로약 5.4배가량 tyrosinase의 활성이 증가하였다.
- 본 실험에서 라벤더의 피부생리활성 효능을 조사하기 위하여 먼저 미백효과를 조사한 결과, 라벤더 25 ㎍/㎖ 농도에서 B16/F10세포의 tyrosinase 효소 활성과 멜라닌 색소가 감소되었다.
- 본 실험에서 멜라닌세포의 가지돌기 형성(dendricity)에 미치는 라벤더 에탄올 추출물의 영향을 관찰한 결과, α-MSH에 의하여 B16/F10세포의 수지상 가지돌기가 증가하였으며, 라벤더에탄올 추출물은 α-MSH에 의한 수지상 가지돌기의 형성을 억제하였다.
- 이상의 결과 라벤더 에탄올 추출물은 멜라닌 합성을 저해시켰으며 α-MSH에 의한 멜라닌 합성 기능 항진 시 더욱 효과적으로 멜라닌 생성을 억제하였다.
- 이상의 결과 라벤더 에탄올 추출물은 멜라닌세포의 tyrosinase 효소 활성 감소와 수지상 가지돌기의 형성 억제를 통하여 멜라닌의 생성을 감소시켰으며, α-MSH 유도에 의한 과색소침착시 더욱 효과적으로 미백효능을 나타냈다.
- 한편 α-MSH 처리군은 209±12.96%로 대조군에 비해 약 2배 증가하였고, α-MSH와 라벤더 12.5 ㎍/㎖ 처리군은 156±4.87%로, α-MSH와 라벤더 25 ㎍/㎖ 처리군은 79±2.12%로 감소하였다(Fig. 1)
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