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문제 정의
- 본 연구에서는 위에서 언급한 여러 가지 효능을 나타내는 오배자를 선택하여 크로마토그래피 방법을 통하여, 생리 활성 화합물을 분리하고, 화학적 방법으로 구조를 결정하고, 이 화합물을 이용하여 염증억제제로서의 가능성을 추측하고자 한다.
제안 방법
- COX-2와 iNOS 및 β-actin에 대한 1차 항체 (primary antibody) 를 3 % skim milk/1xTBS-T에서 1:1,000 으로 희석하여 NC membrane과 상온에서 1시간 30분 동안 반응시키고, 1xTBS-T 를 이용하여 세척한 다음, anti-rabbit 혹은 goat IgG conjugated Horseradish peroxidase 2차 항체 (secondary antibody) 를 1% skim milk/1xTBS-T 에서 1:5,000으로 희석하여 NC membrane과 상온에서 1시간 동안 반응시킨다. 1x TBS-T 로 세척한 후, ECL reagent kit (ECL, Amersham, Buckinghamshire, England) 의 A와 B 용액을 1 : 1 로 반응시켜 NC membrane 과 상온에서 5분간 발색시킨 다음, X-ray film에 감광시는 방법으로 실험하였으며, 대조군에서 발현된 사이토카인의 양을 기준으로 분석하였다.
- Nitric oxide 가 생성되는 대사과정에 관여하는 사이토카인으로 알려진 iNOS 와 NOS 의 생성에 관여하는 조효소로 알려진 COX-2 의 발현을 관측하였다. 또한, 모든 세포가 일정하게 가지고 단백질로 알려진 β-actin 을 측정함으로써 각 농도별 단백질의 양이 일정함을 확인하였고, 자극원만 처리한 대조군의 사이토카인 발현 정도를 기준으로 하여, 생리활성 물질이 사이토카인을 억제하는 정도를 확인하였다.
- RAW 264.7 세포주의 성장에 오배자에서 추출한 SA, PMG 그리고, GA가 미치는 영향을 알아보기 위해 실험을 진행하였으며, 3차 증류수로 현탁하여 만든 5, 10, 20, 40, 50 μM 의 표준용액을 처리하였으며, 자극원에 의한 세포의 성장을 알아보기 위해 LPS만을 처리한 대조군을 기준으로 하였다.
- 추출물을 DMSO 또는 3차 증류수로 적정용액을 만들어 5, 10, 20, 40 μM 농도로 처리한 다음 2시간 후에 1 μg/ml LPS 를 처리한 후, 18시간 후에 5 μg/mL MTT 용액 50 ㎕ 를 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다. 배양액을 제거한 후, MTT 용액과 생존세포로부터 생성된 formazan 을 DMSO 150 ㎕ 로 용해하여 540 nm 파장에서 흡광도를 측정하고 대조군과 비교하여 백분율 (%)로 표시하였다.
- 8, 4 % SDS, 20 % glycerol, 10 % mercaptoethanol)를 혼합한 다음 95 ℃ 에서 5분 동안 가열하여 단백질 변성을 유도하였다. 변성된 단백질을 12 % SDS-PAGE 에서 전기영동을 수행한 다음, NC membrane으로 전위시키고, 5 % skim milk/1xTBS-T 20 ml을 넣고 상온에서 1시간 동안 반응시켜 비특이적인 항체반응을 억제시켰다. COX-2와 iNOS 및 β-actin에 대한 1차 항체 (primary antibody) 를 3 % skim milk/1xTBS-T에서 1:1,000 으로 희석하여 NC membrane과 상온에서 1시간 30분 동안 반응시키고, 1xTBS-T 를 이용하여 세척한 다음, anti-rabbit 혹은 goat IgG conjugated Horseradish peroxidase 2차 항체 (secondary antibody) 를 1% skim milk/1xTBS-T 에서 1:5,000으로 희석하여 NC membrane과 상온에서 1시간 동안 반응시킨다.
- 생쥐의 대식세포주 (Murine macrophage Raw 264.7 cell line)를 10% FBS (Fetal Bovine Serum, 56℃ heat inactivated), 1% L-glutamine, nonessential amino acids 및 1% antibiotic / antimycotic solution (100 U/ml of penicillin, 25 ㎍/ml of amphotericin D, and 100 ㎍/ml of streptomycin), 2% sodium bicarbonate 등이 포함된RPMI 1640 배지에 넣고 37℃, 5% CO2 incubator 에서 24시간 배양하였다.
- 오배자 추출물의 적정용액을 농도 별로 제조한 후 5, 10, 20, 40 μM 농도로 처리하고, 2시간 후에1 μg/ml LPS 을 처리하였다.
- 오배자 추출물의 적정용액을 농도 별로 제조한 후, 5, 10, 20, 40 μM 농도가 되도록 처리하고, 2시간 후에 1 μg/ml LPS 을 처리하여 18시간 동안 배양시킨다.
- 오배자에서 분리된 compound 1 (18.5 mg), compound 2 (20.7 mg), compound 3(19.5 mg)은 단일물질의 구조 결정을 위해 FT-NMR Spectrometer 을 이용하여 구조를 확인하였으며, 1차원 NMR은 ¹H-NMR 스펙트럼 및 ¹³C-NMR 스펙트럼을 측정하였고, 2차원 NMR 실험은 HSQC 및 HMBC를 측정하여 구조 분석을 하고, 문헌을 찾아 비교해본 결과 compound 1은 4-Hydroxy-3-methoxy-5-methyl-benzoic acid (Syringic acid), compound 2는 Methyl 3,4,5-trihydroxy benzoate (Phenolics methyl gallate), compound 3은 3,4,5- Trihydroxy- benzoic acid (Gallic acid)로 밝혀졌으며 각 구조식은 다음과 같다.
- 오배자에서 분리한 생리활성 물질을 interferon-γ(INF- γ) 또는 LPS로 자극된 RAW 264.7세포주에 주입하여, 단일화합물에 의한 염증억제 효과를 측정하였다.
- 추출물을 DMSO 또는 3차 증류수로 적정용액을 만들어 5, 10, 20, 40 μM 농도로 처리한 다음 2시간 후에 1 μg/ml LPS 를 처리한 후, 18시간 후에 5 μg/mL MTT 용액 50 ㎕ 를 첨가하여 4시간 동안 반응시켰다.
대상 데이터
- RPMI 1640 와 fetal bovine serum (FBS)는 Gibco/Invitrogen, dimethyl-sulfoxide(DMSO)와 lipopoly-sacchride(LPS), MTT(2-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 는 Sigma Chemical, 모든 용매는 분석등급으로 Sigma와 Merk(Darmstadt, Germany)에서 구입하였다.
- 본 실험에 사용된 오배자는 원광대학교 한의학대학 한방병원에서 구입하여 사용하였으며, 원광대학교 자연과학대학 천연물 보관실에 보관되어있다.
이론/모형
- 5 × 105/ml) were incubated with or without LPS (1㎍/ml) for 24 h in the presence or absence of compounds at indicated concentrations. The cell viability was determined by MTT assay.
- 오배자 추출물들에 의한 RAW 264.7 세포주의 세포 생존율을 MTT (2-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide) Assay 방법을 이용하여 분석 하였다. 세포주를96-well plate 에 2.
성능/효과
- IC50 (The half maximal inhibitory concentration)를 측정한 결과, SA 는 45 μM, PMG 는 15 μM 그리고, GA 는 42 μM에서 LPS 만을 처리한 대조군에서 생성된 NO의 농도를 50%로 억제하는 효과를 보였다.
- Sodium nitrite (NaNO2) 를 표준용액으로 하여 생성된 NO2- 의 농도를 정량한 결과, 아무것도 처리하지 않은 대조군은 5 μM 을 나타내었고, 자극원만 처리한 대조군은 30 μM 을 나타내었으며, 오배자 추출물한 생리활성 물질인 SA, PMG 그리고, GA 를 5, 10, 20, 40, 50 μM 을 처리한 군에서는 농도 의존적으로 NO의 생성을 억제하는 것으로 나타났다.
- 대조군을 기준으로 하여 백분율로 세포 성장을 나타낸 결과 Fig. 5와 같으며, 오배자에서 추출한 SA, PMG 그리고, GA 5~50 μM 의 농도에서는 세포생존율에 영향을 미치지 않은 것으로 확인되었다.
- 또한, 모든 세포가 일정하게 가지고 단백질로 알려진 β-actin 을 측정함으로써 각 농도별 단백질의 양이 일정함을 확인하였고, 자극원만 처리한 대조군의 사이토카인 발현 정도를 기준으로 하여, 생리활성 물질이 사이토카인을 억제하는 정도를 확인하였다.
- 오배자에서 추출한 SA 와 PMG 그리고, GA 화합물을 5-40 μM 의 농도로 세포주에 처리하고, 이로부터 단백질을 추출하여 전기영동장치를 이용한 단백질 분리과정을 통해 얻은 띠의 두께를 분석한 결과, SA 와 PMG 그리고, GA 화합물이 β-actin의 발현에 영향을 미치지 않고, 농도 의존적으로 iNOS 와 COX-2 의 생성을 억제함을 확인하였다.
- 사이토카인이 생성되는 과정을 통하여, Nitric Oxide 가 생성되는 것으로 알려져있다. 이러한 대사과정에 오배자에서 추출한 생리활성 물질인 SA 와 PMG 그리고, GA 화합물이 면역반응에 미치는 영향에 대한 실험을 진행한 결과, 면역반응에 의한 염증 대사과정에 관여하는 것으로 알려진 대식세포 중 쥐의 대식세포 RAW 264.7 세포 주를 사용하여 활성화된 대식세포로부터 생성되는 사이토카인 및 Nitric Oxide 의 생성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 오배자에 추출한 SA 와 PMG 그리고, GA 화합물이 염증억제제 (抗炎症除)로서 염증성 질환을 예방하거나 치료할 목적으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
후속연구
- 이상의 결과를 종합해 보면 오배자는 염증 반응에 관여하는 사이토카인 및 Nitric Oxide 의 생성을 농도 의존적으로 저해하는 효과가 있어 염증성 인체 질환의 개선 및 치료에 이용할 수 있는 물질이라 사료되며, 앞으로 이들 약물의 약리 작용 및 기전을 밝힐 필요가 있다고 사료된다. 더 나아가 본 연구에 소개된 구조들이 서로 유관한 단일 분자 각각의 구조와 그들의 항염증 효과의 차이들로부터 더 자세한 항염증 메커니즘 규명 및 더 효능 있는 신물질의 발견이 가능할 것으로 예측된다.
- 7 세포 주를 사용하여 활성화된 대식세포로부터 생성되는 사이토카인 및 Nitric Oxide 의 생성을 농도 의존적으로 저해하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 오배자에 추출한 SA 와 PMG 그리고, GA 화합물이 염증억제제 (抗炎症除)로서 염증성 질환을 예방하거나 치료할 목적으로 이용할 수 있을 것으로 사료된다.
- 이상의 결과를 종합해 보면 오배자는 염증 반응에 관여하는 사이토카인 및 Nitric Oxide 의 생성을 농도 의존적으로 저해하는 효과가 있어 염증성 인체 질환의 개선 및 치료에 이용할 수 있는 물질이라 사료되며, 앞으로 이들 약물의 약리 작용 및 기전을 밝힐 필요가 있다고 사료된다. 더 나아가 본 연구에 소개된 구조들이 서로 유관한 단일 분자 각각의 구조와 그들의 항염증 효과의 차이들로부터 더 자세한 항염증 메커니즘 규명 및 더 효능 있는 신물질의 발견이 가능할 것으로 예측된다.
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