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문제 정의
- 본 연구는 본태성 고혈압의 모델동물인 SHR을 대상으로 산삼배양근 추출물의 고혈압에 대한 효과를 평가하기 위하여 수행되었다. WMGCE의 8주간의 투여 후 체중, 사료 및 음수섭취량에서 특이할 만한 변화를 일으키지 않았고 기타 주목할 만한 이상도 관찰되지 않아서 WMGCE는 정상군 및 고혈압모델에서 체 조직의 형성과 생리학적 기능에는 영향을 미치지 않는다고 판단되었다.
- 따라서 이러한 인삼의 기존에 알려진 약리작용을 기초로 산삼배양근추출물의 중장기복용에 따른 고혈압에서 대한 효능에 대한 검토가 필요한 실정이다. 본 연구는 산삼배양근추출물을 본태성 고혈압의 모델동물인 SHR (spontaneously hypertensive rats)을 대상으로 8주간 투여하여 혈압 및 관련 항목에 미치는 영향을 알아보기 위하여 수행되었다.
제안 방법
- SHR중에서 수축기 혈압이 150 mmHg이상으로 고혈압 유발이 확인된 동물을 선발하여 3개 실험군으로 구분하고 WKY랫 드를 정상혈압대조군으로 설정하여 총 4개 실험군으로 구성하였다. SHR 실험군은 고혈압 대조군과 산삼배양근추출물을 투여하는 실험군으로 설정하였다. 산삼배양근 추출물은 최종추출물을 기준으로 100 mg/kg과 200 mg/kg을 10 ml/kg의 투여량으로 희석하여 경구용 주사기를 이용하여 8주간 매일 일정한 시간대 (오전 10시-11시)에 경구투여하였고, 고혈압 대조군에는 산삼배양추출물 투여군과 동일한 양의 증류수를 투여하였다.
- 실험군은 7두씩을 한 군으로 하여 4개의 실험군으로 분류하였다. SHR중에서 수축기 혈압이 150 mmHg이상으로 고혈압 유발이 확인된 동물을 선발하여 3개 실험군으로 구분하고 WKY랫 드를 정상혈압대조군으로 설정하여 총 4개 실험군으로 구성하였다. SHR 실험군은 고혈압 대조군과 산삼배양근추출물을 투여하는 실험군으로 설정하였다.
- 각 실험군에서 8주간의 WMGCE투여 후 체중의 변화를 조사하였다(Table 1). WKY에 비하여 본태성 고혈압의 모델동물인 SHR의 체중은 다소 낮았으며 WMGCE를 투여한 실험군에서는대조군의 SHR과 차이가 관찰되지 않았다.
- 동물을 채혈을 하고 희생시킨 후 심장을 적출하여 중량을 측정하고 적출한 심장은 10% 중성 포르말린용액에 7일 이상 충분히 고정시킨 후 조직처리를 하고 파라핀 포매기(Leica EG 116) 에서 포매하여 rotary microtome (Leica 820)으로 4 ㎛의 절편을 만들어 상행대동맥의 직경을 측정하였다.
- 혈장 삼투압 농도는 빙점강하의 원리를 응용한 Ultra supercooling방법으로 측정하였는데, 검사기기는 Osmometer (Osmetes, Precision system)을 이용하였다. 모든 가검물은 혈장을 분리한 다음 혈장 전해질 및 삼투압을 실험개시부터 종료시까지 2주 간격으로 측정하였다. 측정시 동일 가검물에 대해서 정확도를 높이기 위하여 2회 측정하여 평균치를 환산하여 자료로 사용하였다.
- SHR 실험군은 고혈압 대조군과 산삼배양근추출물을 투여하는 실험군으로 설정하였다. 산삼배양근 추출물은 최종추출물을 기준으로 100 mg/kg과 200 mg/kg을 10 ml/kg의 투여량으로 희석하여 경구용 주사기를 이용하여 8주간 매일 일정한 시간대 (오전 10시-11시)에 경구투여하였고, 고혈압 대조군에는 산삼배양추출물 투여군과 동일한 양의 증류수를 투여하였다.
- 실험군은 7두씩을 한 군으로 하여 4개의 실험군으로 분류하였다. SHR중에서 수축기 혈압이 150 mmHg이상으로 고혈압 유발이 확인된 동물을 선발하여 3개 실험군으로 구분하고 WKY랫 드를 정상혈압대조군으로 설정하여 총 4개 실험군으로 구성하였다.
- 산삼배양근 추출물은 (주)바이오피아(경기도 용인)에서 제공 받아 사용하였다. 야생산삼으로부터 유도된 산삼배양근을 영양 배지에서 4주간 배양한 후 배양근을 수거하여 증류수로 3회 수세하고 45℃에서 12시간 건조하였다. 건조된 산삼배양근 1 kg에 대하여 1차 증류수 150 L를 첨가하고 85℃의 항온수조에서 4시간 동안 추출하고 회전진공농축기를 사용하여 60°brix 이상으로 농축하여 산삼배양 추출물을 조제하였으며 실험에 사용시까지 -20℃에서 보관하였다.
- 체중과 사료 및 음수섭취량의 변화는 2주 간격으로 일정한 시간에 측정하였고 사료 및 음수섭취량은 사육케이지 별로 매주 1회씩 8주간 일정량의 사료와 음수를 공급하고 익일 같은 시간에 사료와 음수의 잔량을 측정하여, 일일 체중 100 g에 대한 평균사료섭취량과 일일 평균음수섭취량을 산출하였다.
- 모든 가검물은 혈장을 분리한 다음 혈장 전해질 및 삼투압을 실험개시부터 종료시까지 2주 간격으로 측정하였다. 측정시 동일 가검물에 대해서 정확도를 높이기 위하여 2회 측정하여 평균치를 환산하여 자료로 사용하였다.
- 혈압은 MK-2000 (Muromachi Kikai, Japan)혈압계를 사용하여 indirect tail-cuff method로 측정하였는데 매주 1회씩 8주간 모든 실험군의 동물을 대상으로 무마취하에서 수축기혈압 및 심박수를 측정하였고, 측정하기 전에는 체온 및 불안정한 심리적 동요를 동물이 최소화하기 위하여 동물을 30℃전후로 유지되는 항온상자에서 안정화시킨 다음 혈압 및 심박동수를 측정하였다. 측정은 개체당 매회 5회 이상 측정하여 평균치를 최종 자료로 사용하였다.
- 혈압은 MK-2000 (Muromachi Kikai, Japan)혈압계를 사용하여 indirect tail-cuff method로 측정하였는데 매주 1회씩 8주간 모든 실험군의 동물을 대상으로 무마취하에서 수축기혈압 및 심박수를 측정하였고, 측정하기 전에는 체온 및 불안정한 심리적 동요를 동물이 최소화하기 위하여 동물을 30℃전후로 유지되는 항온상자에서 안정화시킨 다음 혈압 및 심박동수를 측정하였다. 측정은 개체당 매회 5회 이상 측정하여 평균치를 최종 자료로 사용하였다.
대상 데이터
- 8주령의 웅성 spontaneously hypertensive rats (SHR)와 Wistar kyoto (WKY) 랫드를 Charles River Japan (Japan, Tokyo)에서 구입하여 약 2주간의 실험실 순화기간을 거쳐 10주령(체중 240 ± 10 g)에 실험에 사용하였다.
- 산삼배양근 추출물은 (주)바이오피아(경기도 용인)에서 제공 받아 사용하였다. 야생산삼으로부터 유도된 산삼배양근을 영양 배지에서 4주간 배양한 후 배양근을 수거하여 증류수로 3회 수세하고 45℃에서 12시간 건조하였다.
데이터처리
- 모든 실험결과는 mean ± S.E.M으로 표시하고, pharmacology 통계 program을 이용하여 group test를 시행하였다.
- 모든 실험군간의 비교로 ANOVA 일원배치법과 Dunnett's multiple-range test를 이용하여 p < 0.05의 수준에서 통계학적 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 혈장 전해질중에서 sodium, potassium, chloride 및 urea 농도의 측정은 flame photometer의 원리를 응용한 이온선택전극(ISE)분석법으로 측정하였는데, 장비는 Electrolyte analyzer (M644, CIBA-Corning과 AU 400 Olympus)를 이용하였다. 혈장 삼투압 농도는 빙점강하의 원리를 응용한 Ultra supercooling방법으로 측정하였는데, 검사기기는 Osmometer (Osmetes, Precision system)을 이용하였다. 모든 가검물은 혈장을 분리한 다음 혈장 전해질 및 삼투압을 실험개시부터 종료시까지 2주 간격으로 측정하였다.
- 혈액은 최종 실험일에 ether마취하에서 복대동맥을 통해 전 채혈을 하여 4℃에서 3,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 혈장을 분리하여 -80℃에서 분석을 위하여 냉동보관하였다. 혈장 전해질중에서 sodium, potassium, chloride 및 urea 농도의 측정은 flame photometer의 원리를 응용한 이온선택전극(ISE)분석법으로 측정하였는데, 장비는 Electrolyte analyzer (M644, CIBA-Corning과 AU 400 Olympus)를 이용하였다. 혈장 삼투압 농도는 빙점강하의 원리를 응용한 Ultra supercooling방법으로 측정하였는데, 검사기기는 Osmometer (Osmetes, Precision system)을 이용하였다.
성능/효과
- Sodium의 농도는 WKY에 비하여 SHR대조군에서 높았고 WMGCE를 투여한 실험군에서는 용량에 비례하여 낮아졌다. Potassium, chloride, urea, 삼투질농도도 sodium의 결과와 유사하게 WKY 에 비하여 SHR에서 경미하게 높았으며 WMGCE 투여에 의하여 정상군에 근접한 결과로 변화되는 양상을 나타내었으며 통계학적 유의성은 potassium의 농도가 WMGCE 200 mg/kg 투여군에서 대조군에 비하여 낮아지는 것이 인정되었다.
- Sodium의 농도는 WKY에 비하여 SHR대조군에서 높았고 WMGCE를 투여한 실험군에서는 용량에 비례하여 낮아졌다. Potassium, chloride, urea, 삼투질농도도 sodium의 결과와 유사하게 WKY 에 비하여 SHR에서 경미하게 높았으며 WMGCE 투여에 의하여 정상군에 근접한 결과로 변화되는 양상을 나타내었으며 통계학적 유의성은 potassium의 농도가 WMGCE 200 mg/kg 투여군에서 대조군에 비하여 낮아지는 것이 인정되었다.
- SHR대조군은 실험개시시에는 193.0 ± 12.7 mmHg, 8주간의 실험 종료시에는 218.3 ± 16.3 mmHg로 지속적으로 높은 수축기혈압을 나타내었다.
- 3 mmHg로 지속적으로 높은 수축기혈압을 나타내었다. WMGCE를 투여한 실험군에서는 2주후터 혈압의 감소가 나타나기 시작하여 100 mg/kg을 투여한 군에서는 8주에서, 200 mg/kg의 용량으로 투여한 군에서는 4주후부터 실험 종료시까지 통계학적으로 유의한 수축기 혈압의 감소가 관찰되었다.
- 본 연구는 본태성 고혈압의 모델동물인 SHR을 대상으로 산삼배양근 추출물의 고혈압에 대한 효과를 평가하기 위하여 수행되었다. WMGCE의 8주간의 투여 후 체중, 사료 및 음수섭취량에서 특이할 만한 변화를 일으키지 않았고 기타 주목할 만한 이상도 관찰되지 않아서 WMGCE는 정상군 및 고혈압모델에서 체 조직의 형성과 생리학적 기능에는 영향을 미치지 않는다고 판단되었다. WMGCE는 용량 및 시간의존적으로 SHR에서 수축기 혈압의 감소를 보였는데, 혈압의 감소는 WKY랫드에 투여시에는 관찰되지 않았다(결과로 제시하지는 않았음).
- 결론적으로 본 연구에서 WMGCE는 SHR에서 혈압을 감소시켰으며 혈액내 전해질 및 urae, 삼투질 등과 같은 용질의 농도를 낮추었다. 아울러 8주간의 WMGCE는 정상적인 혈압이나 심박수, 심장이나 대동맥에는 영향을 미치지 않았다.
- WMGCE는 용량 및 시간의존적으로 SHR에서 수축기 혈압의 감소를 보였는데, 혈압의 감소는 WKY랫드에 투여시에는 관찰되지 않았다(결과로 제시하지는 않았음). 따라서 WMGCE는 기본적으로 정상혈압에는 영향을 미치지 않아 혈압저하효과보다는 항고혈압효과가 있음을 알 수 있었다. 혈장중 sodium, patassium, chloride함량이 고혈압인 SHR에서 정상혈압인 WKY 랫드에서 보다 다소 높았으며 WMGCE를 투여에 의하여 낮아지는 경향을 나타내었는데, 이러한 혈장중 sodium, patassium, chloride함량의 감소가 이루어 진점은 sodium, patassium, chloride의 배출증가의 간접적인 자료로 의미가 있다고 볼 수 있다.
- WMGCE는 용량 및 시간의존적으로 SHR에서 수축기 혈압의 감소를 보였는데, 혈압의 감소는 WKY랫드에 투여시에는 관찰되지 않았다(결과로 제시하지는 않았음). 따라서 WMGCE는 기본적으로 정상혈압에는 영향을 미치지 않아 혈압저하효과보다는 항고혈압효과가 있음을 알 수 있었다. 혈장중 sodium, patassium, chloride함량이 고혈압인 SHR에서 정상혈압인 WKY 랫드에서 보다 다소 높았으며 WMGCE를 투여에 의하여 낮아지는 경향을 나타내었는데, 이러한 혈장중 sodium, patassium, chloride함량의 감소가 이루어 진점은 sodium, patassium, chloride의 배출증가의 간접적인 자료로 의미가 있다고 볼 수 있다.
- 8주간의 실험종료 후 실험군 동물의 심장무게, 심박수, 및 대동맥직경의 변화는 Table 3에 보여주었다. 심장의 무게는 WKY에 비하여 SHR에서 높았으며 WMGCE의 투여에 의하여 통계학적 유의성은 없었으나 SHR대조군에 비하여 낮아지는 경향을 나타내었다. 심박수와 대동맥 직경은 각 실험군간 유의할 만한 차이를 관찰할 수 없었다.
- 결론적으로 본 연구에서 WMGCE는 SHR에서 혈압을 감소시켰으며 혈액내 전해질 및 urae, 삼투질 등과 같은 용질의 농도를 낮추었다. 아울러 8주간의 WMGCE는 정상적인 혈압이나 심박수, 심장이나 대동맥에는 영향을 미치지 않았다. 따라서 이들 결과들은 WMGCE는 고혈압에 대해서 혈압저하기능으로서의 활용가능성이 있으며, WMGCE의 분자약리학적 기전과 작용부위 및 활성 성분의 규명 등이 향후 연구에서 이루어 져야 한다고 생각된다.
- 일일 사료섭취량은 체중 100 g당 9.4 ± 0.7 g으로 WKY의 10.1 ± 0.9에 비하여 다소 낮았지만 유의성은 없었으며 WMGCE를 투여한 실험군에서도 SHR 대조군과 유의할 만한 차이를 관찰할 수 없었으며 일일 음수섭취량도 실험군간 차이를 확인할 수 없었다.
- 그러한 추측에는 신장내와 정맥내로 bradykinin과 acetylcholine 과 같은 혈관이완물질을 투여하면 요중 sodium 배설의 증진과 관련되어 있다는 보고17)가 근거가 된다. 혈장내 urea와 삼투질농도의 변화도 전해질의 변화와 유사하게 WMGCE의 투여에 의해서 감소되는 결과를 나타내었다. Urea와 삼투질의 감소도 역시 요의 배출증가와 관련지울 수 있는 변화라고 볼 수 있다.
- 따라서 WMGCE는 기본적으로 정상혈압에는 영향을 미치지 않아 혈압저하효과보다는 항고혈압효과가 있음을 알 수 있었다. 혈장중 sodium, patassium, chloride함량이 고혈압인 SHR에서 정상혈압인 WKY 랫드에서 보다 다소 높았으며 WMGCE를 투여에 의하여 낮아지는 경향을 나타내었는데, 이러한 혈장중 sodium, patassium, chloride함량의 감소가 이루어 진점은 sodium, patassium, chloride의 배출증가의 간접적인 자료로 의미가 있다고 볼 수 있다. 이러한 결과들은 혈압의 감소는 혈액내 용질의 신장배출과 함께 요량의 증가가 일어나고 수분과 음이온의 신세뇨관 재흡수를 감소시킨다는 연구16)의 결과를 적용하여 WMGCE의 혈압감소효과의 기전을 추측할 수 있다.
후속연구
- Urea와 삼투질의 감소도 역시 요의 배출증가와 관련지울 수 있는 변화라고 볼 수 있다. 그러나 본 연구에서는 요량의 변화와 기타 혈액생화학적 및 혈액학적 분석을 실시하지 않았기 때문에 WMGCE의 혈압감소와 혈장내 전해질이나 기타 효소들의 변화를 직접적으로 확실하게 설명할 수는 없으며 향후 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다.
- 아울러 8주간의 WMGCE는 정상적인 혈압이나 심박수, 심장이나 대동맥에는 영향을 미치지 않았다. 따라서 이들 결과들은 WMGCE는 고혈압에 대해서 혈압저하기능으로서의 활용가능성이 있으며, WMGCE의 분자약리학적 기전과 작용부위 및 활성 성분의 규명 등이 향후 연구에서 이루어 져야 한다고 생각된다.
- 이러한 결과들은 혈압의 감소는 혈액내 용질의 신장배출과 함께 요량의 증가가 일어나고 수분과 음이온의 신세뇨관 재흡수를 감소시킨다는 연구16)의 결과를 적용하여 WMGCE의 혈압감소효과의 기전을 추측할 수 있다. 즉, WMGCE를 투여하면 혈장내 sodium, patassium, chloride함량이 낮아지고 이러한 상태에서 수분배출의 증가와 함께 혈관저항성이 감소되어 혈압의 감소가 일어나는 기전이 있을 것으로 추정되는데 여기에서 혈관에 대한 이완작용의 유무도 고려해 볼 항목이 될 수 있을 것이다. 그러한 추측에는 신장내와 정맥내로 bradykinin과 acetylcholine 과 같은 혈관이완물질을 투여하면 요중 sodium 배설의 증진과 관련되어 있다는 보고17)가 근거가 된다.
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