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문제 정의
- 본 실험에서는 靑皮가 FST에서 횐쥐의 우울 행동을 억제하는 것이 HPA axis와 관련하여 항우울 효과를 나타내는 것이 아닌가 하는 추론을 확인해보기 위해 시상하부의 PVN에서 CRF를 측정하여 보았다.
- 이에 저자는 靑皮가 FST에서 횐쥐의 우울 행동에 미치는 효과를 알아보기 위해 횐쥐에게 FST를 실시하여 행동변화를 살펴보고, 면역 조직화학법으로 HPA axis와 관련하여 시상하부의 실방핵(PVN, paraventricular nucleus) 에서 CRF, HSP70(heat shock protein 70), c-fos의 발현을 측정하여 유의성 있는 결과를 얻었기에 이를 보고하는 바이다.
가설 설정
- 또다른 가설로는 HPA(Hypothalamo-pituitaiy-adrenocartical) axis의 이상이 CRHcorticotrcpin-releasing factor)의 분비를 증가시키고 이것이 ACTH (adrenocorticotropic hormone), 코티졸의 분비를 자극한다는 것이다. 세 번째 가설로는 마크로파지 이론이 있는데 이는 사이토카인, Ⅱ.-l(interleukine-l), INF-a&iWemn-a)의 이상분비로 인해 CRF, ACTH, prolactin, cortisol의 이상분비가 나타나게 되고 이로 인해 우울증의 증후군이 발생하게 된다는 것이다.
제안 방법
- 횐쥐를 도피 불가능한 수조에 빠뜨리면 처음에는 출구를 찾아 격렬히 수영을 하다가 결국은 코를 수면위에 내놓기 위한 최소한의 동작 이외에는 특징적인 부동자세를 취함을 관찰하고, 이를 스트레스로 유발된 학습된 무력감 혹은 절망행동으로 보고 우울증의 동물모형이라 제안한 것으로, 실험방법이 간단 하고 예측 타당도가 인정되어 항우울제의 효과판정을 위한 방법으로 널리 사용되고 있다. 15분간 물에 빠뜨리는 예비 실험 후 24시간 후 본 실험을 시행하였는데, 수영을 하다 포기하고 부동자세를 취하여 좌절 양상을 보이는 시간을 측정하여 평가한다.
- 다시 PBST로 씻은 다음 뇌 조직은 실온에서 1시간 동안 Santa Cruz ABC reagent (Santa Cruz) 에 담가 반응시켰다. PBST로 몇 번 헹군 다음 뇌 조직을 착색제인 diaminobenz必dine을 사용하여 발색시켰다. 발색이 끝난 조직은 slide에 올려 2시간 동안 실온에서 건조시킨 후 xylene으로 투명화시켜 polymount로 봉입하였다.
- 다시 PBST로 씻은 다음 뇌 조직은 실온에서 1시간 동안 Santa Cruz ABC reagent (Santa Cruz)에 담가 반응시켰다. PBST로 몇 번 헹군 다음 뇌 조직을 착색제인 diaminobe沥dine을 사용하여 발색시켰다. 발색이 끝난 조직은 sHde에 올려 2시간 동안 실온에서 건조 시킨 후 xylene으로 투명화시켜 polymount로 봉입하였다.
- 靑皮가 횐쥐의 우울행동에 미치는 효과를 알아보기 위해 FST를 실시하여 행동변화에 미치는 영향을 보고, 면역 조직화학법으로 시상하부의 PVN에서 CRF, I6P70, c-fos의 변화를 측정하여 다음과 같은 결론을 얻었다.
- 강제수영 부하시험이 끝난 쥐를 sodium pentobarbital (80mg/kg, i.p.)로 마취 시킨 후 0.9% saline 200m夂에이어 phosphate buffer로 준비한 4% formalin 용액 100曲을 심장을 통해 관류하였다. 고정액의 처음 300 曲는 2분간, 나머지 700曲는 25분간에 걸쳐 관류하였다.
- 뇌 조직은 primaiy antiserum에서 72시간 배양하였다. 그 후 뇌 조직을 I理ST로 씻은 다음, 2시간 동안 실온에서 2% normal donky serum을 함유하는 PBST에서 200배로 희석한 biotinylates goat anti goat serum(Santa Cruz Biotechnology) 에 반응시켰다. 다시 PBST로 씻은 다음 뇌 조직은 실온에서 1시간 동안 Santa Cruz ABC reagent (Santa Cruz)에 담가 반응시켰다.
- 뇌 조직은 primary antiserum에서 72시간 배양하였다. 그 후 뇌 조직을 PBST로 씻은 다으 2시간 동안 실온에서 2% normal goat serum을 함유하는 PBST에서 200배로 회석한 biotinylates goat anti rabbit serum(Santa Cruz Biotechnology.)에 반응시켰다. 다시 PBST로 씻은 다음 뇌 조직은 실온에서 1시간 동안 Santa Cruz ABC reagent (Santa Cruz) 에 담가 반응시켰다.
- 뇌 조직은 primary antiserum에서 72시간 배양하였다. 그 후 뇌 조직을 PBST로 씻은 다음, 2시간 동안 실온에서 2% normal goat serum을 함유하는 PBST에서 200배로 회석한 biotinylates goat anti mouse serum (Santa Cruz Hote산mology.)에 반응시켰다. 다시 PBST로 씻은 다음 뇌 조직은 실온에서 1시간 동안 Santa Cruz ABC reagent (Santa Cruz) 에 담가 반응시켰다.
- 발색이 끝난 조직은 sHde에 올려 2시간 동안 실온에서 건조 시킨 후 xylene으로 투명화시켜 polymount로 봉입하였다. 뇌조직의 각 부위는 염색성을 광학현미경으로 100배 확대 관찰하고 사진을 촬영하였다. 뇌의 각 부위의 위치와 명칭은 Franklin과 Paxinos의 부도를 참고하였다.
- 발색이 끝난 조직은 sHde에 올려 2시간 동안 실온에서 건조 시킨 후 xylene으로 투명화시켜 polymount로 봉입하였다. 뇌조직의 각 부위는 염색성을 광학현미경으로 100배 확대 관찰하고 사진을 촬영하였다. 뇌의 각 부위의 위치와 명칭은 Franklin과 Paxinos의 부도를 참고하였다.
- 처음 수 분간은 이를 벗어나기 위해 랫트가 심한 저항을 보이나, 시간이 흐를수록 점점 부동자세를 보이는 시간이 늘어난다. 두 번째 날, 즉 24시간 후에는 5분간 같은 환경에서 강제 수영을 시키고 여기서 dimbmg, swimming, immobility 세 가지를 측정한다. 전형적인 immobility 란 랫트가 얼굴을 포함한 상체의 일부분만 수면 위로 드러낸 채 몸의 균형을 유지하기 위하여 약간의 움직임만을 나타낼 뿐 물 위에 떠 있는 상태이다 한편 swimmin吗은 랫트가 수면 위를 돌면서 움직이고, 간혹 물밑으로 잠수하기도 하는 상태이다 climl所吗은 가장 격렬한 운동 상태인데, 앞발을 적극적으로 사용하여 아크릴 원통 위로 오르려고 사지를 다 쓰는 상태이다.
- 실험은 두 단계로 나누어 실시하였다. 먼저 FST 에서는 Control(생리식염수 투여. N=8), CR100(靑皮 100mg/kg p.o.투여. N=8), CR400(靑皮 400m眼/kg p.o.투여. N=8)의 3그룹으로 나누어 실시하였고, 면역조직화학법에서는 Normal(N=8), Control(생리식 염수투여. N=8), CR100(靑皮 lOOmg/kg p.o.투여. N=8), CR400(靑皮 400mg/kg p.o.투여. N=8)의 4그룹으로 나누어 실시하였다.
- 전형적인 immobility 란 랫트가 얼굴을 포함한 상체의 일부분만 수면 위로 드러낸 채 몸의 균형을 유지하기 위하여 약간의 움직임만을 나타낼 뿐 물 위에 떠 있는 상태이다 한편 swimmin吗은 랫트가 수면 위를 돌면서 움직이고, 간혹 물밑으로 잠수하기도 하는 상태이다 climl所吗은 가장 격렬한 운동 상태인데, 앞발을 적극적으로 사용하여 아크릴 원통 위로 오르려고 사지를 다 쓰는 상태이다. 실수와 사람에 의한 오차를 줄이기 위해 비디오카메라로 측정하여 자료를 확보하였다.
- 실험은 두 단계로 나누어 실시하였다. 먼저 FST 에서는 Control(생리식염수 투여.
- 이 검사법은 약물개발시의 항우울효과를 검색하는 기본적인 실험으로 알려져 있다. 이 실험은 두 번에 걸쳐 이루어지는데, 첫 번째 날은 높이 50cm, 지름 30cm의 투명한 아크릴원통형 수조에 2ZC의 물에 랫트의 꼬리가 바닥에 닿지 않을 정도의 물 높이에 강제로 빠뜨린 다음 15분간 있게 하였다. 처음 수 분간은 이를 벗어나기 위해 랫트가 심한 저항을 보이나, 시간이 흐를수록 점점 부동자세를 보이는 시간이 늘어난다.
- 뇌의 각 부위의 위치와 명칭은 Franklin과 Paxinos의 부도를 참고하였다. 현상된 사진에서 격자(2x2cm)를 이용하여 동일한 지역에서 일정한 영역에 반응되어 나타난 염색성의 정도를 counting 하였다.
- 뇌의 각 부위의 위치와 명칭은 Franklin과 Paxinos의 부도를 참고하였다. 현상된 사진에서 격자(2x2cm)를 이용하여 동일한 지역에서 일정한 영역에 반응되어 나타난 염색성의 정도를 counting 하였다.
대상 데이터
- 사용하였다. 靑皮는 300g에 10배 (w/v) 량의 3차 증류수를 가하여 1(XTC에서 4시간 동안 냉각기를 장착한 상태로 환류 추출한 다음, 거즈로 여과하여, 80℃에서 중탕 농축하여 하루 동안 arc에서 냉각시킨 후, 40t 온도로 냉각동결건조시켜 분말로 靑皮 6Qg을 획득하였다. 투약시는 건조된 약재를 분량에 맞게 saline을 첨가하여 용액을 만들었다.
- 연구에 사용한 한약재는 萋香科 (Rutaceae) 에 속한 常綠小喬木인 귤나무(柑橘, Citrus reticulata Blanco) 의 未成熟 果皮 혹은 幼果를 건조한 것을 추출용 시료로 사용하였다. 靑皮는 300g에 10배 (w/v) 량의 3차 증류수를 가하여 1(XTC에서 4시간 동안 냉각기를 장착한 상태로 환류 추출한 다음, 거즈로 여과하여, 80℃에서 중탕 농축하여 하루 동안 arc에서 냉각시킨 후, 40t 온도로 냉각동결건조시켜 분말로 靑皮 6Qg을 획득하였다.
- 중량 200g 내외의 Sprague Dawley계 수컷 횐쥐 (Orient사)를 고형사료와 물을 충분히 공급하면서 2 주일간 실험실 환경에 적응 시킨 후, 실험에 사용하였다 낮과 밤 주기는 오전 7시부터 오후 7시까지를 낮으 5, 다른 12시간을 밤으로 하여 자동 조절하였다. 온도는 20-24C 습도는 36-64%S.
데이터처리
- 모든 측정값은(평균값土표준오차)로 표시하였고, 각 실험군의 통계학적 분석은 window용 SPSS를 이용하였다. 행동 실험결과 및 면역조직 화학법에 대한통계분석은 one way ANOVA로 분석하였으며, 사후검정은 LSD를 통해 검증하였으며, P값이 0.
- 행동 실험결과 및 면역조직 화학법에 대한통계분석은 one way ANOVA로 분석하였으며, 사후검정은 LSD를 통해 검증하였으며, P값이 0.05 미만인 것을 통계적으로 유의한 것으로 인정하였다.
이론/모형
- 뇌 조직의 각 부위는 염색성을 광학현미경으로 100배 확대 관찰하고 사진을 촬영하였다. 뇌의 각 부위 위치와 명칭은 FmnkBn과 Paxinos의 부도를 참고하였다. 현상된 사진에서 격자 (2x2cm)를 이용하여 동일한 지역에서 일정한 영역에 반응되어 나타난 염색성의 정도를 counting 하였다.
- 뇌조직의 각 부위는 염색성을 광학현미경으로 100배 확대 관찰하고 사진을 촬영하였다. 뇌의 각 부위의 위치와 명칭은 Franklin과 Paxinos의 부도를 참고하였다. 현상된 사진에서 격자(2x2cm)를 이용하여 동일한 지역에서 일정한 영역에 반응되어 나타난 염색성의 정도를 counting 하였다.
- 본 실험에서는 절망행동검사(behavioral despair test)라고도 하는 표준화된 검사법인 FST를 이용하였다. 이 검사법은 약물개발시의 항우울효과를 검색하는 기본적인 실험으로 알려져 있다.
- 본 연구에서는 횐쥐의 우울행동을 유발하기 위하여 理T를 사용하였는데, FST는 1978년 Porsolt 등에 의해 고안된 방법으로 절망행동모델이라고도 불린다. 횐쥐를 도피 불가능한 수조에 빠뜨리면 처음에는 출구를 찾아 격렬히 수영을 하다가 결국은 코를 수면위에 내놓기 위한 최소한의 동작 이외에는 특징적인 부동자세를 취함을 관찰하고, 이를 스트레스로 유발된 학습된 무력감 혹은 절망행동으로 보고 우울증의 동물모형이라 제안한 것으로, 실험방법이 간단 하고 예측 타당도가 인정되어 항우울제의 효과판정을 위한 방법으로 널리 사용되고 있다.
- 본 연구에서는 횐쥐의 우울행동을 유발하기 위하여 강제수영부하실험 (FST, Forced Swimming Test) 를 사용하였다. FST는 1978년 Porsolt 등에 의해 고안된 방법으로, 실험동물이 물이 담긴 실린더형 용기에서 수영을 하다 포기하고 부동자세를 취하는 것을 일종의 스트레스로 유발된 학습된 무력감 혹은 절망행동으로 보고 이러한 부동자세를 나타내는 시간을 측정하여 평가하는 것이다.
성능/효과
- 1. 理T를 실시하고 부동행동이 나타나는 시간을 관찰한 결과, 대조군에 비해 靑皮 100mg/kg그룹과 靑皮 400mg/kg그룹에서 유의성있게 감소하였다.
- 2. 면역조직화학법으로 시상하부의 PVN에서 CRF 의 발현을 관찰한 결과, 대조군에 비해 靑皮 400mg/ 戏그룹에서 CRF의 발현이 유의성있게 감소하였다.
- 3. 면역조직화학법으로 시상하부의 PVN에서 HSP70 의 발현을 관찰한 결과, 대조군에 비해 靑皮 400mg/ kg 그룹에서 HSP70의 발현이 유의성있게 감소하였다.
- 4. 면역조직화학법으로 시상하부의 PVN에서 c-fos의 발현을 관찰한 결과, 대조군에 비해 靑皮 lOOmg/kg 그룹과 靑皮 400mg/kg그룹에서 c-fos의 발현이 유의성 있게 감소하였다.
- 8, 9와 같다. 대조군을 100으로 보고 각각의 발현 세포 수를 %로 비교해 본 결과, 靑皮 100mg/kg그룹 (CR100)은 73.64±13.97%, 청피 400mg/kg그룹(CR400)은 50.38±7.14%< 나타내, 대조군에 비해 유의성있는 감소를 나타내었다(F(3, 26)=8.585, p<0.01).
- 4, 5 와 같다. 대조군을 100으로 보고 각각의 발현 세포 수를 %로 비교해 본 결과, 靑皮 100mg/kg그룹(CR100)과 靑皮 400m姻kg그룹(CR400)에서 각각 80.76±7.5%, 53.84±8.2%를 나타내, PVN 내에서의 CRF의 발현이감소되었고, 특히 靑皮 400mg/kg 그룹(CR400)에서는 유의성 있게 감소하였다(F(3, 35) = 11.319, p < 0.001).
- 6, 7과 같다. 대조군을 100으로 보고 각각의 발현 세포수를 %로 비교해 본 결과, 靑皮 10Qmg/l廷그룹(CR100)에서는 73.64±13.97%, 靑皮 400mg/kg그룹 (CR400)에서는 50.38圮14%를 나타내, 靑皮 400mg/ kg그룹(CR400)에서 유의성있게 감소하였음을 알 수 있다(F(3, 23)=4.840, p < 0.05).
- 본 실험에서는 우울상태와 연관하여 시상하부의 PVN에서 HSP70 발현의 변화를 살펴보았는데, 대조군을 100으로 보고 각각의 발현 세포수를 %로 비교해 본 결과, 靑皮 lOOmg/kg 그룹에서는 73.64 ± 13.97%로 그 발현이 감소함을 보였고, 靑皮 400mg/ kg그룹(CR400)에서는 50.38±7.14%를 나타내 유의성 있게 감소하였음을 알 수 있었다.
- 알려져 있다. 본 실험연구에서도 스트레스를 받으면 fos 발현이 증가되는 것으로 알려진 PVN에서 신경세포 활동성에 대한 지표가 되는 c-fos가 발현된 세포체의 수를 측정하였는데, 대조군을 100으로 보고 각각의 발현 세포수를 %로 비교해 본 결과, 靑皮 100理/kg그룹은 73.64±13.97%, 청피 400 mg/kg 그룹은 50.38±7.14%를 나타내 대조군에 비해 유의성 있는 감소를 나타내었다. 이는 靑皮의 투여가 PVN에 작용하여 c-Fos의 발현을 억제한 결과로 볼 수 있다.
- 본 실험의 결과 대조군을 100으로 보고 각각의 발현 세포수를 %로 비교해 본 결과, 靑皮 100mg/kg 그룹과 靑皮 400mg/kg그룹에서 각각 80.76±7.5%, 53.84±8.2%를 나타내, PVN 내에서의 CRF의 발현을 억제시켰다. 이는 여러 선행연구보고 결과에서 항우울제의 투여가 CRF의 발현을 감소시킨다고 한 것과 일치하는 것으로 靑皮의 투여가 시상하부의 PVN에 작용하여 CRF의 발현을 억제시키는 것으로 보이며, 특히 CRF1 receptor antagonist와 유사한 역할을 함으로써 항우울효과를 나타내는 것으로 생각된다.
- 본 실험의 결과를 보면 靑皮를 투여한 그룹에서 대조군에 비해 부동행동이 줄어드는 것을 볼 수 있었다. 특히 靑皮 100mg/kg투여한 그룹은 3.
- 이상 살펴본 바와 같이 靑皮가 시상하부의 PVN에 작용하여 PVN에서 HPA axis와 관련된 스트레스 물질인 CRF, HSP70, c-fos의 발현을 억제함으로써 항우울 작용을 나타내는데, 특히 CRF antagonists* 같은 작용을 함으로써 이러한 항우울작용을 나타내는 것이 아닌가 생각된다.
- 이상과 같은 실험결과를 볼 때, 靑皮가 FST에서 시상하부의 PVN에 작용함으로써 횐쥐의 우울행동을 억제시키는 항우울효과가 있다고 생각된다.
- 특히 靑皮 100mg/kg투여한 그룹은 3.0±0.8sec로 대조군의 10.4±1.3sec에 비해 부동행동이 유의성 있게 줄어드는 것을 관찰할 수 있었으며, 靑皮 400mg/kg 를 투여한 그룹에서도 6.7±1.8sec로 대조군에 비해 부동 행동이 감소하는 것을 볼 수 있었다. 이는 FST 로 인해 횐쥐의 우울행동이 유발되었고, 靑皮의 투여가 FST에서 나타나는 횐쥐의 우울행동을 억제하는 작용을 하고 있음을 알 수 있다.
- 한편 청피 100mg/kg그룹이 청피 400 mg/kg 그룹보다 더 유의성있는 억제작용을 나타낸 것을 관찰할 수 있었는데, 이는 약물의 투여량 변화에 따라 청피의 항우울효과가 관련이 있음을 보여주는 것이라 할 수 있는데, 본 실험에서 적은 양을 투여했을 때 횐쥐의부동행동을 더욱 억제하는 것으로 나타난 것은 조직 차원에서의 변화가 나타나는 시간과 행동 차원에서의 변화가 나타나는 시간 사이에 간극이 있어 이러한 결과를 나타내는 것이 아닌가 추측된다. 즉 저용량 의약물 흡수가 고용량의 경우보다 더 빠르게 진행되어 행동상의 변화 또한 더 빨리 나타나게 하는 것으로 생각된다.
후속연구
- 따라서 靑皮의 항우울 작용의 기전을 살피기 위해 CRF antagonist와 비교하고, 세로토닌, 도파민, 카테콜라민 계에 미치는 영향에 대한 추가연구가 필요하다고 생각된다.
- 이에 대해 한 선행연구3®에서 HSP70 발현의 변화가 GR과 연관되어 HPA axis에서 GC의 negative feedback0!] 영향을 준다고 한 가설과 연관하여 靑皮의 HSP70 발현억제기전을 추측해볼 수 있겠다. 반면에 HSP70 mRNA의 발현이 GR mRNA의 발현과 관련이 없고 PVN에서 HSP70 발현 수준이 높더라도 GR의 기능에 대해 제한적으로 작용하지 않으며 다른 steroid receptor와 관련이 있다는 보고刽)도 있어, HSP70의 역할과 관련한 靑皮의 작용기전에 대한 추가 연구가 필요하다고 생각된다.
- 즉 저용량 의약물 흡수가 고용량의 경우보다 더 빠르게 진행되어 행동상의 변화 또한 더 빨리 나타나게 하는 것으로 생각된다. 이를 확인하기 위해 용량을 더욱 세분화한 후속실험이 필요하리라 여겨진다.
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