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가설 설정
- 이상과 같이 유방창통이나 적취 등의 치료에 사용되고 암세포 증식억제 성분을 함유하고 있으며, 인체의 위암세포에 대한 항암효과8)가 알려진 청피가 인간 유래 유방암 세포의 사멸에도 관여할 수 있을 것이라는 가설을 세우게 되었다.
제안 방법
- 본 연구에서는 청피의 유방암에 대한 항암효과를 알아보기 위하여 인간 유래 유방암 세포인 MDA-MB-231에 청피를 처리하고, 세포증식률에 미치는 영향을 살펴본 다음, Annexin V/PI double stain, Cell cycle arrest 등의 방법을 통하여 어떤 type의 세포 사멸이 일어나는지 살펴보았고, 2’, 7’-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA)를 이용하여 산화적 스트레스의 발현 정도를 살펴보았다. 또한, Caspase 3, Caspase 9과 Bcl-2-associated X protein(Bax)/B-cell lymphoma 2(Bcl-2)의 비율에 미치는 영향을 확인하였다.
- 본 연구에서는 청피의 유방암에 대한 항암효과를 알아보기 위하여 인간 유래 유방암 세포인 MDA-MB-231에 청피를 처리하고, 세포증식률에 미치는 영향을 살펴본 다음, Annexin V/PI double stain, Cell cycle arrest 등의 방법을 통하여 어떤 type의 세포 사멸이 일어나는지 살펴보았고, 2’, 7’-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA)를 이용하여 산화적 스트레스의 발현 정도를 살펴보았다. 또한, Caspase 3, Caspase 9과 Bcl-2-associated X protein(Bax)/B-cell lymphoma 2(Bcl-2)의 비율에 미치는 영향을 확인하였다.
- 상기한 이유로 청피가 일으키는 세포 사멸의 형태가 어떤 것인지 살펴보기 위하여 Annexin V/PI double stain을 시행하였다. Annexin V는 Annexin group에 속하는 세포내 단백질의 일종으로 세포 내에서 그 기능은 잘 알려져 있지 않다.
- 인간 유래 거대유방암 세포주인 MDA-MB-213 세포의 생육 배지로는 DMEM 배지에 10% fetal bovine serum와 penicillin-streptomycin(100 units/ml, 100 μg/μl)을 첨가하여 사용하였고, 세포주의 계대 배양은 2일 간격으로 시행하였다. 부착 세포의 탈착을 위해서 Trypsin-EDTA(Sigma, USA)를 사용하였으며, 5% CO2가 공여되는 배양기 속에서 37℃를 유지하며 배양하였다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 靑皮는 운향과의 귤나무 Citrus reticulata Blanco의 미성숙한 과실의 과피로 동신대학교 부속 순천한방병원을 통하여 구입 정제하여 사용하였다.
- 인간 유래 거대유방암 세포주인 MDA-MB-231은 한국세포주은행(서울, 한국)으로부터 냉동상태로 구입하여 사용하였다. 분주받은 세포주는 해동되어 배양액 속에 분주된 후, 3회 이상 계대 배양하여 실험실 환경 및 기타 배양 환경에 충분히 적응시킨 후 증식률(Doubling Time)이 구입처에서 제공한 자료와 거의 일치하게 되었을 때, 충분히 적응하였다고 생각하고 실험에 사용하였다.
데이터처리
- 12, SAS Institute, USA)를 이용하였다. 실험 성적은 평균±표준편차(mean±SD)로 나타내었으며, 각 실험군 간 평균의 차이를 검정할 때에는 Student’s t-test로 검정하여 p값이 0.05 미만일 때 유의한 차이가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 시료가 Cell cycle distribution에 미치는 영향을 유세포분석법을 이용하여 관찰하였다. 실험과정을 간단히 요약하면, 6-well plate에 well당 5×104개의 세포를 분주하고, 24시간 동안 부착을 시행한 다음, 0 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, 200 μg/ml 농도의 시료를 처리하였다.
- 을 첨가하였다. 형광 측정은 FACS canto II(BD bioscience)을 이용하여 유세포분석법(flow cytometry)으로 시행하였다.
- 을 첨가하였다. 형광 측정은 FACS canto II(BD bioscience)을 이용하여 유세포분석법(flow cytometry)으로 시행하였다.
성능/효과
- 따라서, apoptosis의 진행은 Bcl-2의 발현량과 반비례하고, Bax의 발현량과는 비례하기 때문에 BAX/Bcl-2 비율이 증가할수록 apoptosis는 활성화 된다32,33). 본 연구의 결과에서 청피의 처리는 Bax/Bcl-2 비율을 증가시키는 경향을 보였다(Fig. 9).
- 이러한 결과는 청피가 거대 유방암세포에 일으키는 세포사멸이 apoptosis임을 시사한다. PI와 Annexin V double negative인 Q3 영역은 살아있는 정상세포, PI only positive인 Q1 영역에 속하는 세포는 necrosis, PI와 Annexin V double positive 영역인 Q2는 late apoptosis, Annexin V only positive 영역인 Q4는 early apoptosis라는 가정하에 각각의 영역에 해당하는 세포의 비율을 좀 더 자세하게 살펴본 결과 정상세포는 정상군에서 91.8% 였던 것이 200 μg/ml 투여군에서 71.2%로 감소하였고, Q2와 Q4를 합한 total apoptosis는 6.5%에서 26.1%로 증가하였다. 이에 반해 necrosis는 정상군 1.
- 3. 농도의존적으로 Annexin V 양성인 apoptotic cell의 숫자를 증가시키는 경향을 보였다.4. 농도의존적으로 sub G1 영역에 속한 세포들을 중가시키는 경향을 보였다.
- 만약, 이러한 ROS의 증가에 암세포가 적응하거나, 증가되는 ROS를 효율적으로 감소시키는 기전을 갖춘다면 이러한 암세포는 항암제에 내성을 보이며, 악성으로 분류된다22,23). 본 연구에서 청피가 암세포 내의 산화적 스트레스에 대하여 어떤 영향을 미치는지 살펴본 결과는 1시간 동안 50 μg/ml 농도로 처리해준 군에서는 산화적 스트레스를 줄여주는 효과가 있는 것으로 나타났으며, 100 μg/ml 처리군에서는 거의 정상군 수준으로 유지되었고, 200 μg/ml 투여군에서는 유의한 수준의 산화적 스트레스 증가가 관찰되었다(Fig. 6).
- 대표적으로는 extrinsic pathway에 속하는 caspase 8이나 caspase 9에 의해서 활성화될 수 있고, intrinsic pathway에 속하는 cytochrome c에 의해서도 활성화될 수 있다30,31). 본 연구의 결과를 살펴보면, 청피의 처리는 caspase 9의 발현에는 특별한 영향을 미치지 않은 반면, caspase 3의 발현량을 농도의존적으로 증가시켰다(Fig. 7, 8).
- 본 연구의 결과에서 청피는 농도 의존적으로 Annexin V positive(Q2, Q4)세포를 증가시켰다(Fig. 3).
- 본 연구의 결과에서 청피는 투여 농도 100 μg/ml 이상에서 유의한 수준의 세포 증식률 억제 효과를 보였으며, 50% growth inhibition 값(ID50)은 175.4 μg/ml이었다(Fig. 1).
- 따라서, apoptosis의 진행은 Bcl-2의 발현량과 반비례하고, Bax의 발현량과는 비례하기 때문에 BAX/Bcl-2 비율이 증가할수록 apoptosis는 활성화 된다32,33). 본 연구의 결과에서 청피의 처리는 Bax/Bcl-2 비율을 증가시키는 경향을 보였다(Fig. 9).
- 2. 유방암 세포의 증식 밀도와 세포 크기를 감소시켰다.3. 농도의존적으로 Annexin V 양성인 apoptotic cell의 숫자를 증가시키는 경향을 보였다.
- 5). 이러한 결과는 Annexin V/PI double stain 결과와 함께 청피의 세포 살해 기전이 apoptosis임을 시사한다.
- 3). 이러한 결과는 청피가 거대 유방암세포에 일으키는 세포사멸이 apoptosis임을 시사한다. PI와 Annexin V double negative인 Q3 영역은 살아있는 정상세포, PI only positive인 Q1 영역에 속하는 세포는 necrosis, PI와 Annexin V double positive 영역인 Q2는 late apoptosis, Annexin V only positive 영역인 Q4는 early apoptosis라는 가정하에 각각의 영역에 해당하는 세포의 비율을 좀 더 자세하게 살펴본 결과 정상세포는 정상군에서 91.
- 따라서 특정 항암제가 암세포의 분열을 억제시키는 효과를 발휘하기 위해서는 많은 세포가 G0 영역을 포함한 sub G1 영역에 위치하게 해야 한다. 이러한 점을 감안하고 본 연구 결과를 살펴보면, 청피의 투여는 농도 의존적으로 sub G1 영역에 속한 세포의 수를 증가시켰다(Fig. 4).
- 이상을 정리하여 보면, 청피는 인간 유래 거대유방암 세포 내에서 산화적 스트레스를 유발한 결과 미토콘드리아와 밀접한 관련이 있는 intrinsic 경로의 apoptosis를 유발하였으며, 그 결과 농도 의존적으로 세포 증식률이 감소하였고, Annexin V 양성인 세포를 증가시켰으며, sub G1 영역에 arrest되는 세포 수를 증가시켰다. 이러한 결과는 청피가 유방암에 사용될 가능성이 있음을 시사한다.
후속연구
- Bax가 미토콘드리아로부터 cytochrome c와 pro-apoptotic factors들의 유리를 일으킨다는 사실34)을 감안할 때, 이러한 결과는 청피가 intrinsic pathway를 통하여 apoptosis를 유도하는 증거로 해석될 수 있다. 이러한 가설을 증명하기 위해 후속 연구에서는 cytochorm c 유리, mitochondral membrane potential 등에 미치는 영향을 조사해야 할 것으로 사료된다.
- 이상의 결과로부터 靑皮가 유방암 세포에서 intrinsic pathway를 통한 apoptosis를 일으킴을 알 수 있었으며, 추후 유방암에 활용될 수 있는 가능성을 확인할 수 있었다.
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