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문제 정의
- 본 연구에서는 청열약의 대표적인 단미 한약재로 잘 알려져 있는 금은화, 목단피, 진피, 치자, 황금의 다섯 가지 한약재가 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 다양한 농도에서 약물상호작용에 크게 관여가 되며, 특히 간에서 크게 반응성을 나타내는 CYP 3A4에 대한 반응성을 알아보았다. CYP 3A4 억제제로 잘 알려져 있는 Ketoconazole과 함께 비교 실험 하여 어느 정도 CYP 3A4 억제에 대해 유의성을 나타내는지를 측정해 보았다.
- 본 연구에서는 청열약의 대표적인 단미 한약재로 잘 알려져 있는 금은화, 목단피, 진피, 치자, 황금의 다섯 가지 한약재가 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 다양한 농도에서 약물상호작용에 크게 관여가 되며, 특히 간에서 크게 반응성을 나타내는 CYP 3A4에 대한 반응성을 알아보았다. CYP 3A4 억제제로 잘 알려져 있는 Ketoconazole과 함께 비교 실험 하여 어느 정도 CYP 3A4 억제에 대해 유의성을 나타내는지를 측정해 보았다.
- 이에 본 연구에서는 청열약에 속하는 금은화, 목단피, 진피, 치자, 황금이 약재에 따라 그리고 농도에 따라 Human Liver Microsome에서 CYP 3A4 activity에 얼마나 영향을 주는지에 대해 알아보았다.
- 최근 한약재 역시 약물상호작용에 큰 이슈가 되고 있으므로, 한약재 중 청열약의 대표적인 다섯 가지; 금은화, 목단피, 진피, 치자, 황금이 약물상호작용에 어떠한 영향을 주는지에 대해 실험해보았다. 금은화, 목단피, 진피, 치자, 황금은 문헌에서 다음과 같이 서술되어 있다.
제안 방법
- Human Liver Microsome과 Kpi buffer 그리고 3차 증류수가 섞여있는 glass tube에 DMSO 1㎕ 넣어주고 이는 Control로 사용되었다. CYP 3A4의 대표적인 inhibitor로 알려져 있는 1mM 로 희석된 Ketoconazole 역시 1㎕을 앞에서 설명한 것과 같이 준비된 glass tube에 넣어 Negative Control로써 진피(Fraxinus rhynchophylla Hance)과 비교하였다. 진피는 먼저 40㎎/㎖ stock의 농도로 DMSO에 녹인 후, 계산을 통하여 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 농도로 DMSO 로 희석하였다.
- Human Liver Microsome과 Kpi buffer 그리고 3차 증류수가 섞여있는 glass tube에 DMSO 1㎕ 넣어주고 이는 Control로 사용되었다. CYP 3A4의 대표적인 inhibitor로 알려져 있는 1mM 로 희석된 Ketoconazole 역시 1㎕을 앞에서 설명한 것과 같이 준비된 glass tube에 넣어 Negative Control로써 치자(Gardenia jasminoides Ellis)과 비교하였다. 치자는 먼저 40㎎/㎖ stock 의 농도로 DMSO에 녹인 후, 계산을 통하여 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 농도로 DMSO로 희석하였다.
- Human Liver Microsome과 Kpi buffer 그리고 3차 증류수가 섞여있는 glass tube에 DMSO1㎕ 넣어주고 이는 Control로 사용되었다. CYP 3A4의 대표적인 inhibitor로 알려져 있는 1mM 로 희석된 Ketoconazole 역시 1㎕을 앞에서 설명한 것과 같이 준비된 glass tube에 넣어 Negative Control로써 황금(Scutellaria baicalensis George)와 비교하였다. 황금은 먼저 40㎎/㎖ stock의 농도로 DMSO에 녹인 후, 계산을 통하여 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 농도로 DMSO 로 희석하였다.
- 먼저, Human Liver Microsome과 Kpi buffer 그리고 3차 증류수가 섞여있는 glass tube에 DMSO 1㎕ 넣어주고 이는 Control로 사용되었다. CYP 3A4의 대표적인 inhibitor로 알려져 있는 1mM로 희석된 Ketoconazole 역시 1㎕을 앞에서 설명한 것과 같이 준비된 glass tube에 넣어 Negative Control로써 금은화(Lonicera japonica Thunb)과 비교하였다. 금은화는 먼저 40㎎/㎖ stock의 농도로 DMSO에 녹인 후, 계산을 통하여 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 농도로 DMSO로 희석하였다.
- Human Liver Microsome과 Kpi buffer 그리고 3차 증류수가 섞여있는 glass tube에 DMSO 1㎕ 넣어주고 이는 Control로 사용되었다. CYP 3A4의 대표적인 inhibitor로 알려져 있는 1mM로 희석된 Ketoconazole 역시 1㎕을 앞에서 설명한 것과 같이 준비된 glass tube에 넣어 Negative Control로써 목단피(Paeonia suffruticosa Andr.)과 비교하였다. 목단피는 먼저 40㎎/㎖ stock의 농도로 DMSO에 녹인 후, 계산을 통하여 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 농도로 DMSO로 희석하였다.
- 30분 incubation이 끝나면, 처음 NGS를 넣었던 순서에 맞추어서 stop solution을 넣어준다. 그 후 Solid Phase Extraction(SPE) 과정을 거쳐 N₂Evaporator에서 MeOH을 증발시킨 후, 0.1% Formic Acid 와 100% Acetonitrile이 85 :15의 비율로 만들어진 solution을 1.5㎖ microtube들에 각각 50㎕씩 넣고, 5분간 격렬한 voltexing을 한 후 LC/MS-MS용 insert가 들어있는 Auto-sampling vial에 그대로 옮긴 후 LC/ MS-MS API 2000(Agilent, U.S.A)을 이용하여 각 sample들의 metabolite산출 반응을 측정 하였다.
- CYP 3A4의 대표적인 inhibitor로 알려져 있는 1mM로 희석된 Ketoconazole 역시 1㎕을 앞에서 설명한 것과 같이 준비된 glass tube에 넣어 Negative Control로써 금은화(Lonicera japonica Thunb)과 비교하였다. 금은화는 먼저 40㎎/㎖ stock의 농도로 DMSO에 녹인 후, 계산을 통하여 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 농도로 DMSO로 희석하였다. 각각의 농도로 희석된 금은화 역시 준비된 각각의 glass tube에 1㎕ 씩 넣어주었다.
- )과 비교하였다. 목단피는 먼저 40㎎/㎖ stock의 농도로 DMSO에 녹인 후, 계산을 통하여 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 농도로 DMSO로 희석하였다. 각각의 농도로 희석된 목단피 역시 준비된 각각의 glass tube에 1㎕ 씩 넣어주었다.
- 본 실험에서는 CYP450의 많은 isoform들 중에 간에서의 가장 많이 발현되며, 간에서의약물대사에 가장 크게 관여하는 CYP 3A4 반응성을 Human Liver Microsome을 사용하여 측정하였다.
- 이 다섯가지 약재가 약물 상호작용의 어떤 영향을 주는지에 대한 실험의 첫 단계로 Human Liver Microsome에서의 반응성을 각각의 농도 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖에서 측정하였다.
- 그리고 Filter 2 여과지(Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 감압여과 하였다. 이 여과액을 감압농축기(Eyela, Tokyo, Japan)를 이용하여 농축한 후, 얻어진 농축액을 동결 건조하여(Freezedryer, Matsushita, Japan) 각각 35g, 20.5g, 36g, 21.5g, 27.6g, 21g, 21.5g, 10g, 15g, 14.9g의 분말을 얻어(수율 : 35.00%, 20.50%, 36.00%, 21.50%, 27.60%, 21.00%, 21.50%, 10.00%, 15.00%, 14.90%) 농도에 따라 40㎎/㎖ in DMSO의 stock으로부터 stock과 DMSO의 양을 계산하여 희석하였다. (농도: 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖)
- CYP 3A4의 대표적인 inhibitor로 알려져 있는 1mM 로 희석된 Ketoconazole 역시 1㎕을 앞에서 설명한 것과 같이 준비된 glass tube에 넣어 Negative Control로써 진피(Fraxinus rhynchophylla Hance)과 비교하였다. 진피는 먼저 40㎎/㎖ stock의 농도로 DMSO에 녹인 후, 계산을 통하여 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 농도로 DMSO 로 희석하였다. 각각의 농도로 희석된 진피 역시 준비된 각각의 glass tube에 1㎕씩 넣어주 었다.
- CYP 3A4의 대표적인 inhibitor로 알려져 있는 1mM 로 희석된 Ketoconazole 역시 1㎕을 앞에서 설명한 것과 같이 준비된 glass tube에 넣어 Negative Control로써 치자(Gardenia jasminoides Ellis)과 비교하였다. 치자는 먼저 40㎎/㎖ stock 의 농도로 DMSO에 녹인 후, 계산을 통하여 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 농도로 DMSO로 희석하였다. 각각의 농도로 희석된 치자 역시 준비된 각각의 glass tube에 1㎕씩 넣어주었다.
- CYP 3A4의 대표적인 inhibitor로 알려져 있는 1mM 로 희석된 Ketoconazole 역시 1㎕을 앞에서 설명한 것과 같이 준비된 glass tube에 넣어 Negative Control로써 황금(Scutellaria baicalensis George)와 비교하였다. 황금은 먼저 40㎎/㎖ stock의 농도로 DMSO에 녹인 후, 계산을 통하여 10, 20, 30, 40, 50㎍/㎖의 농도로 DMSO 로 희석하였다. 각각의 농도로 희석된 황금 역시 준비된 각각의 glass tube에 1㎕씩 넣어주었다.
대상 데이터
- 1M Glucose-6-phosphate(G-6-P), 10mM NADP+, 1u/㎖ Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G-6-P dehydrogenase)등의 모든 시약은 Sigma에서 구입하였다. 0.1% Acetic Acid, 100% Methanol(HPLC grade), 100% Acetonitrile (HPLC grade), 0.1% Formic Acid의 용매는 J.C Baker에서 구입하여 그대로 혹은 3차 증류수에 희석하여 사용하였다. 이 모든 시약과 용매는 한국과학기술연구원(KIST)의 대사유전체센터에서 공급해주었다.
- 이 모든 시약과 용매는 한국과학기술연구원(KIST)의 대사유전체센터에서 공급해주었다. Solid Phase Extraction을 위한 Oasis SPE Kit는 웅기과학(Waters Korea 대리점)에서 구입하여 사용하였다. CYP protocol 에 따른 실험을 위한 glass tubes, 1.
- 본 실험에서 사용된 chemical들(Dimethyl sulfoxide(DMSO), 1 M ketoconazole in DMSO : CYP 3A4 index inhibitor, 10mM midazolam in DMSO : CYP 3A4 substrate, 16uM Terfenadine : Internal standard, 1M Kpi buffer(pH 7.4), 0.1M Glucose-6-phosphate(G-6-P), 10mM NADP+, 1u/㎖ Glucose-6-phosphate dehydrogenase(G-6-P dehydrogenase)등의 모든 시약은 Sigma에서 구입하였다. 0.
- 본 실험에서 사용한 청열약 5종은 옴니허브(Kyungbuk, Korea)에서 구입하여 100g 정량 후 1L의 80% 에탄올을 가하여 15분씩 두 번, 총 30분 동안 sonication 하였다. 그리고 Filter 2 여과지(Whatman, Maidstone, England)를 이용하여 감압여과 하였다.
- C Baker에서 구입하여 그대로 혹은 3차 증류수에 희석하여 사용하였다. 이 모든 시약과 용매는 한국과학기술연구원(KIST)의 대사유전체센터에서 공급해주었다. Solid Phase Extraction을 위한 Oasis SPE Kit는 웅기과학(Waters Korea 대리점)에서 구입하여 사용하였다.
- 최소 연령 10세부터 최고연령 70세까지의 다양한 질환과 치료 경력을 가진 사람들을 대상으로 남성 기증자 15명, 여성 기증자 7명의 간에서 채취한 Microsome을 한독바이오테크 (수입 : BD Biosciences)에서 구입하였다. 각각의 Vial은 0.
이론/모형
- 연구의 신뢰도를 높이기 위하여 최근 CYP450 activity측정에 많이 사용되고 있는 LC/MS-MS 측정법을 사용하였다. 치자는 모든 농도에서 control 보다 높은 억제율을 보였으며, 30㎍/㎖에서 최고로 34% 정도까지의 억제율을 보이면서 CYP 3A4 억제에 있어서 좋은 효과를 나타낸다고 볼 수 있는 한약재로 꼽을 수 있게 되었다.
성능/효과
- 13) Midazolam은 LC/MS를 이용하여 CYP 3A4의 효소반응을 측정하는 기질로써 많이 쓰이며, Midazolam은 NADPH와 수산화 반응을 일으켜 1-OH' Midazolam이라는 대사물질을 산출하게 되어 효소와 기질의 반응성을 측정 할 수 있다.
- 1-2) 간에서 발현 되는 CYP 450 효소들 중 가장 대표적인 것은 CYP 3A4 형태로써 erythromycin and cyclosporin등의 넓은 범위의 기질들을 함유하고 있으며, 다른 CYP 형태들 보다도 더 많은 범위에 기질들에 반응한다.3) CYP 3A4 효소는 인간의 체내에서 모든 약물대사의 50% 이상에 관여하며, 일본에서는 감포 약재가 CYP와 같은 특정 약물 대사에 관여하는 효소들의 반응에 영향을 미친다는 것을 알고 사용하고 있다.4-5) 또한, 소청룡탕과 그 성분들의 효능을 밝히고, 그것들이 CYP 3A 효소에 영향을 미치는지에 대해서도 연구하는 등의 과학적인 접근을 시도하고 있다.
- 그 결과, 대부분의 농도가 50%의 억제율을 산출시키지 못하였으며, Ketoconazole뿐만 아니라, 컨트롤로 사용한 DMSO 보다도 높은 평균값을 나타내었다(n=3). 이 결과는 CYP 3A4가 유도되었음을 말해줄 수 있는 자료는 되지 못하지만, 다섯 가지 한약재들이 약물상호작용에 있어서 안정성을 나타내고 있음을 말해준다고 볼 수 있다.
- 억제작용이 일어나는지에 대한 실험을 하여, 20, 30㎍/㎖에서 컨트롤에 비해 50% 미만의 결과값인 41% 와 34%의 억제율을 보인다는 결과를 얻 었다. 그리고 이 결과는 CYP 3A4 enzyme activity를 보인다는 것을 증명해주는 결과가 되었다. 이 실험에 따르면, 치자는 CYP 3A4억제에 있어서 좋은 한약재가 된다는 것을 알수 있다(Figure 6.
- 와 같은 차트로 나타내었다. 억제작용이 일어나는지에 대한 실험을 하여, 20, 30㎍/㎖에서 컨트롤에 비해 50% 미만의 결과값인 41% 와 34%의 억제율을 보인다는 결과를 얻 었다. 그리고 이 결과는 CYP 3A4 enzyme activity를 보인다는 것을 증명해주는 결과가 되었다.
- 와 같은 차트로 나타내었다. 억제작용이 일어나는지에 대한 실험을 하여, 50㎍/㎖을 제외한 10～40㎍/㎖ 모두 컨트롤에 비해 억제되는 결과를 얻었으나, 50% 미만의 억제율은 보이지 않았다. 그러므로, CYP 3A4 enzyme activity에 대한 유의성은 없다고 판단이 된다.
- 연구의 신뢰도를 높이기 위하여 최근 CYP450 activity측정에 많이 사용되고 있는 LC/MS-MS 측정법을 사용하였다. 치자는 모든 농도에서 control 보다 높은 억제율을 보였으며, 30㎍/㎖에서 최고로 34% 정도까지의 억제율을 보이면서 CYP 3A4 억제에 있어서 좋은 효과를 나타낸다고 볼 수 있는 한약재로 꼽을 수 있게 되었다.
후속연구
- 또한 세포 실험을 통하여 in vitro 데이터를 확보하고, 동물 실험을 통하여 in vivo데이터를 확보하여전 임상단계에 대한 데이터를 구축해야 할 것이다. 그 후 임상실험을 통하여 한약재의 안정성을 사람들에게 증명하는 역할을 해야 할 것이다.
- 더 나아가서, 더 정확하고 확실한 결과를 얻기 위해서는 약재의 반응성을 시간별로 정확히 측정하여 판독하는 Kinetic Study를 비롯하여, 세포에서의 RNA, 단백질 레벨 측정, 동물실험을 통한 각각의 조직들에 대한 RNA, 단백질 레벨 측정 등의 전 임상 단계 실험이 먼저 진행이 되어야 할 것이다. 그리고 그 결과 들을 토대로 임상 실험을 진행하여 한약재의 우수성과 안정성을 증명할 수 있다는 목표를 가지고 실험을 진행하여야 할 것이다.
- 더 나아가서, 더 정확하고 확실한 결과를 얻기 위해서는 약재의 반응성을 시간별로 정확히 측정하여 판독하는 Kinetic Study를 비롯하여, 세포에서의 RNA, 단백질 레벨 측정, 동물실험을 통한 각각의 조직들에 대한 RNA, 단백질 레벨 측정 등의 전 임상 단계 실험이 먼저 진행이 되어야 할 것이다. 그리고 그 결과 들을 토대로 임상 실험을 진행하여 한약재의 우수성과 안정성을 증명할 수 있다는 목표를 가지고 실험을 진행하여야 할 것이다.
- 이를 더욱 구체적이고, 논리적으로 증명하기 위하여서는 Kinetic Study를 통하여 Human Liver Microsome에서의 반응성을 좀더 구체적 으로 알아 볼 필요성이 있을 것이다. 또한 세포 실험을 통하여 in vitro 데이터를 확보하고, 동물 실험을 통하여 in vivo데이터를 확보하여전 임상단계에 대한 데이터를 구축해야 할 것이다. 그 후 임상실험을 통하여 한약재의 안정성을 사람들에게 증명하는 역할을 해야 할 것이다.
- 마지막으로, 약물상호작용을 일으키는 정도는 개인마다 다양하게 나타나는데, CYP450에 존재하는 약물의 양과 CYP450에 대한 약물의 친화도 뿐만 아니라 나이, 영양상태, 질환상태,다양한 CYP450에 의한 대사경로 등에 따라 차이를 나타내기 때문에 더 많은 연구가 in vitro, in vivo상에서 뿐만 아니라 임상을 통해서 진행되어야 할 것이다.
- 이를 더욱 구체적이고, 논리적으로 증명하기 위하여서는 Kinetic Study를 통하여 Human Liver Microsome에서의 반응성을 좀더 구체적 으로 알아 볼 필요성이 있을 것이다. 또한 세포 실험을 통하여 in vitro 데이터를 확보하고, 동물 실험을 통하여 in vivo데이터를 확보하여전 임상단계에 대한 데이터를 구축해야 할 것이다.
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