선택한 단어 수는 입니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
최소 단어 이상 선택하여야 합니다.
선택한 단어 수는 30입니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
최대 10 단어까지만 선택 가능합니다.
문제 정의
- Scheffler 등은 미슬토 약제의 직접적인 세포독성 연구에서 소세포성 폐암 세포주에 대해 Viscum album L Pini, Abietis, Quercus 이 세종류의 약제를 이용하여 확인해본 결과 억제 효과가 lectin 내용물에 달려 있다면 Quercus 약제가 가장 강력한 효과를 지니고 Pini 약제는 가장 적은 효과를 지니는 것으로 나타나야만 하지만 실험상에서는 상관관계가 없는 것으로 보고하였다.(11) 이것은 mistletoe lectin 외의 성분이 겨우살이 추출물의 세포독성 작용에 관여할 가능성을 암시하기 때문에 이점을 고려해 본 연구에서는 mistletoe lectin을 이용하지 않고 실제 임상에서 사용되는 용액형태 전체를 위암 세포주에 투여하여 직접적인 세포독성을 확인해 보았다. Maier 등은 세종류 (Iscardor M, Qu, P) 의 미슬토 추출물을 이용하여 16개의 사람 종양 세포주에 대해 항 증식 및 자극효과를 시험했다.
- (19) 또한 Bussing 등은 두개의 리보솜 억제 단백질 (ribosome-inhibi ting proteins) 인 겨우살이 lectin III와 Volkensin 으로 사람 임파구를 가지고 이들에 의해 유도된 세포사멸의 효과를 연구하였다. 이 실험에서 세포의 사멸이 핵의 p53과 Bcl2 proteins 의 감소와 telomeric associations 유도와 관련이 있다는 보고를 하였다.(20)
제안 방법
- 배양하였다. 2일마다 한 번 새로운 배지로 교환하고 배양접시에 세포가 80% 이상 자랐을 때 PBS 로 세척한 후 0.05% trypsin-EDTA 를 사용하여 배양접시에 부착된 세포를 떼어낸 후 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액은 제거하고 침전된 세포에 배지를 넣고 세포가 골고루 분산되도록 피펫으로 잘 혼합하여 96 well plate, 혹은 6 well plate 에 분주 후 약물을 처리한 다음 여러 실험들을 수행하였다.
- Block ing 후 TBS-T 로써 10분씩 3번 씻어내고 난 다음 2% (w/v) fat-free BSA/TBS-T 에 희석시킨 일차 항체를 2시간 동안 처리한다. TBS-T 로써 10분씩 3번 씻어낸 뒤 5% (w/v) 탈지분유/TBS-T 에 희석시킨 HRP 가 결합된 이차 항체를 1시간 동안 처리한 후 TBS-T 로써 10분씩 3번, TBS 로 10분 동안 1번 씻어낸 뒤 ECL western blotting detection reagent 들을 처리하여 반응을 시킨 뒤 필름 현상을 통해 단백질 발현 정도를 확인한다.
- 겨우살이 추출물 처리에 의한 세포 사멸의 기전을 확인하기 위해서 시행한 caspase 3 activity assay 에서는 겨우살이추출물의 경우 농도는 50O“g/ml과 1, 00O“g/ml 을 각각 처리하였고 5-FU 의 경우 농도는 10“g/ml, 100“g/ml 을 각각 처리하여 그 결과를 분석하였다. 분석 결과, 처리한 약물들의 농도의 고저에 상관없이 caspase 3의 활성은 증가하였고 caspase 3 작용 억제 물질인 Z-VAD-FMK 를 처리함으로써 활성이 매우 낮게 감소한 것으로부터 겨우살이 추출물 및 5-FU 처리는 caspase 3의 활성을 증가시킴을 알 수 있다.
- 따라서 본 연구에서는 위암 세포주에 겨우살이 추출물이 세포 생존율, 세포자멸사, 그리고 Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome10 (PTEN) 같은 항암 단백질에 어떻게 작용하는 가를 임상에서 항암화학 치료제로 사용 중인 5-FU (5-Fluorouracil) 와 Cisplatin과 비교 및 병합 처치를 통해서 알아보았다.
- (10) 겨우살이 추출물 중에서 mistletoe lectin 성분이 주로 세포자멸사를 유발 하는데 현재 임상에 사용되는 겨우살이 제제는 ABNOBAviscum® 과 Helixor® 그리고 Iscador® 세 제품이 있다. 본 연구에서는 위에서 언급한 세 가지 약제 중 mistletoe lectin 을 가장 많이 함유한 독일 ABNOBA사의 ABNOBAviscum Quercus-2와 ABNOBAviscum Fraxini-2를 사용하여 위암 세포주에 대한 세포독성실험을 시행하였다. 하지만 mistletoe lectin 의 함량은 세포소멸 능력과 밀접한 상관관계를 가지나 lectin만을 기준으로 세포독성효과를 예측하는 것은 불가능하다.
- 05% trypsin-EDTA 를 사용하여 배양접시에 부착된 세포를 떼어낸 후 원심분리 하였다. 원심분리 후 상층액은 제거하고 침전된 세포에 배지를 넣고 세포가 골고루 분산되도록 피펫으로 잘 혼합하여 96 well plate, 혹은 6 well plate 에 분주 후 약물을 처리한 다음 여러 실험들을 수행하였다.
- 처리하여 48시간 동안 더 배양한다. 이 때 세포사멸의 양성대조군으로 1% triton X-100 처리군을 만들고 처리하지 않은 대조군을 음성대조군으로 만들어 이를 분석의 기준으로 삼는다. 이 후 배양액에 분출된 젖산탈수소효소 (Lactate dehydrogenase) 의 활성도를 측정하기 위하여 배양액 100 “l 를 채취한다.
대상 데이터
- (Seoul, Korea). 겨우살이 추출물 ABNOBAviscum-Q (AVQ) 와 ABNOBAviscum-F (AVF) 는 (주)한국 아브노바사에서 구매하였다 (Seoul, Korea). 항암제 5-Fluorouracil (5-FU) 과 Cisplatin은 각각 중외제약(Seoul, Korea)과 일동제약 (Seoul, Korea) 으로부터 공급받았다.
- Caspase 3 as say kit 은 Promega 사의 제품을 사용하였다 (Madison, USA). 세포배양에 사용된 배양액과 FBS, 항생제는 (주)웰진에서공급받았다 (Seoul, Korea).
- 실험에 사용된 위암세포주인 SNU-719 세포주 (human sto mach adenocarcinoma cell line) 는 한국세포주은행에서 구입하였다 (Seoul, Korea). 겨우살이 추출물 ABNOBAviscum-Q (AVQ) 와 ABNOBAviscum-F (AVF) 는 (주)한국 아브노바사에서 구매하였다 (Seoul, Korea).
- 위암세포 배양은 10% FBS, 1% antibiotic-antimycotic 을 함유한 RPMI 1640 배지를 사용하여 37oC, 5% CO2 세포 배양기에서 배양하였다. 2일마다 한 번 새로운 배지로 교환하고 배양접시에 세포가 80% 이상 자랐을 때 PBS 로 세척한 후 0.
- 겨우살이 추출물 ABNOBAviscum-Q (AVQ) 와 ABNOBAviscum-F (AVF) 는 (주)한국 아브노바사에서 구매하였다 (Seoul, Korea). 항암제 5-Fluorouracil (5-FU) 과 Cisplatin은 각각 중외제약(Seoul, Korea)과 일동제약 (Seoul, Korea) 으로부터 공급받았다. CCK-8 assay kit는 Dojindo 사의 제품을 사용하였고 (Kumamoto, Japan), LDH assay kit 은 TAKARA 사 제품을 사용하였다 (Otsu, Japan).
데이터처리
- 실험 군들 간의 통계학적 의미 여부는 student, s Mesf와 one-way ANOVA를 사용하여 검정하였고 P<0.05 일 경우 결과가 통계학적 의미가 있는 것으로 판정하였다.
이론/모형
- 원하는 겨우살이 추출물을 계획대로 처치한 후 24시간, 48시간동안 배양 세포가 80% 정도 자란 100 mm 배양 접시에 단백질 추출액 200 “l를 넣고 수확 후 50초 동안 격하게 흔들어주어 세포를 분해한다. 20분 동안 영하 20oC 냉동고에 방치한 후 15, 000 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액만을 분리하여 모은 뒤 Bradford 방법(8)을 원용하여 단백질량을 측정한 뒤 동량을 사용하여 SDS-PAGE 를 실시한다. 전기영동이 끝나면 바로 nitrocellulose membrane 에 1시간 30분 동안 transfer 한 뒤 5% (w/v) 탈지분유/TBS-T 로써 밤새 blocking 을 실시한다.
- Mistletoe 추출물의 위암세포주에 대한 세포자멸사 유도의 분자생물학적 기전을 알기 위해 p53과 Bcl2 발현의 Western blot 검사를 시행하였다. 원하는 겨우살이 추출물을 계획대로 처치한 후 24시간, 48시간동안 배양 세포가 80% 정도 자란 100 mm 배양 접시에 단백질 추출액 200 “l를 넣고 수확 후 50초 동안 격하게 흔들어주어 세포를 분해한다.
성능/효과
- 1). 세포 생존율 실험을 통해 겨우살이추출물들이 SNU-719 위암세포에 대한 반수치사량(LD50: 50% lethal dose) 은 50"g/ml 내외라는 것을 알 수 있었고 이처리 농도 이상에서는 급격하게 세포 사멸률이 증가하는즉, 세포독성 효과를 보이고 있다.
- 종양 콜로니 형성 (tumor colony formation) 을 대조군에 비해 30%까지 억제하는 농도를 (T/C<30%) 비교해본 결과 ABNOBAviscum mali 가 5 “M/ml 농도로 가장 높은 세포독성을 보였으며 다른 약제들은 100 ug/ml 이상의 농도에서 이와 비슷한 세포독성을 보였다.(14) 여러 논문 검색에서 저자들과 유사한 실험논문이 검색되지 않아 비교할 수 없었지만 저자들이 사용한 위암 세포주 (SNU-719) 에서의 세포사멸 효과는 항암제인 5-FU 에 의한 농도 의존적 세포사멸 효과는 10 ug/ml 처리 시 약 50% 세포사멸이 나타났으며 이에 비해서 겨우살이 추출물 단독처리에 의한 세포사멸효과는 AVF 인 경우 약 40 ug/ml 에서 AVQ 인 경우 약 50 ug/ml 의 농도에서 나타남을 확인하였다 (Fig. 1, 2). 본 연구에서 겨우살이 추출물 처리 농도가 50 ug/ml 이상에서는 급격히 높은 세포 사멸 효과, 즉 세포 독성 효과를 나타내나 세포주를 대상으로 시행한 in vitro 연구의 한계성을 볼 때 이를 곧바로 임상치료에 적용하는 것은 무리가 있다.
- 겨우살이 추출물 AVQ 와 AVF, 그리고 항암제인 5-FU 와 cisplatin을 각각 그리고 병합 처리 후 Western blot analysis 를통해 apoptosis 에 관여하는 Bcl2 와 p53 의 단백질 발현량을 24시간과 48시간에 걸쳐 측정한 결과 Bcl2 는 처리 후 48시간이 지나야 대조군에 비해 발현량에 변화가 있었다. 즉, 항암제인 5-FU와 cisplatin, 그리고 겨우살이 추출물들 모두 Bcl2 의 발현량을 감소시켰고 항암제들의 감소 효과가 더 컸다.
- 겨우살이 추출물들은 본 연구결과에서 caspase 3의 활성을 증가시키고 Bcl2 의 단백질 발현량을 감소시킴으로써 세포자멸사를 유발하며 이는 p53과는 상관없는, 즉 p53- independent 한 작용임을 알 수 있었다.
- 겨우살이 추출물들은 위암 세포에 농도 별로 처리 시 일정 농도 이상부터 5-FU 나 cisplatin같은 항암제보다 그 효과는 작으나 세포 사멸을 일으켰고 항암제들과 병합 처리 시단독 처리할 때보다 위암 세포 사멸에 있어 분명한 상승효과를 보였다.
- 따라서 같은 시약을 동일 농도에서 처리를 해도 세포 사멸률 시험과 생존율 시험에서 절대치가 상호 일치되게 결과가 나오는 경우는 드물다. 그러나 본 연구에서 약제들을 농도가 증가하게 처리하였을 때 세포 생존율은 이에 비례하여 감소했고 세포 사멸률은 증가하였으므로 이 두 실험을 통해 겨우살이 추출물의 항암효과를 분명하게 알 수 있다.
- 따라서 겨우살이 추출물은 PTEN 경로를 통한 항암 작용은 하지 않음을 알 수 있었다.
- 이 실험에서 세 종류 모두 종양 생장 자극의 증거는 없으며, 높은 lectin 농도를 함유한 Iscardor M 과 Qu에서 유방암 세포주에서 15 “g/ml dose level에서 대조군에 비해 70% 이상 생장 억제 현상을 관찰할 수 있었다. 또한 Iscardor M에서 3개의 cancer cell lines 에서 Iscardor Qu 에서 7개의 cell lines 에서 약한 항종양 효과(생장 억제 30 - 70%)를 관찰할 수 있었다. 하지만 lectin을 함유하지 않은 Iscardor P에서 항 증식 효과 (antiproliferative effect) 는 관찰되지 않았다.
- 2). 또한 겨우살이 추출물과 5-FU 를 병합처리 하였을 때 겨우살이 추출물들을 단독으로 처리하였을 경우보다 0.01~10“g/ml 의 농도 범위에서 50% 내외로 세포 사멸률이 더 증가하는 상승효과 (sy nergistic effect) 를 나타내었다 (Fig. 3). 세포 사멸률 측정에 사용한 LDH assay 시약과 세포 생존율 측정에 쓰인 CCK-8시약은 그 성분 조성이 다르기 때문에 세포주의 시약 감수성에 차이가 나타나게 된다.
- 본 연구결과에서는 항암제들과 겨우살이 추출물 모두 PTEN 단백질 발현에는 의미 있는 영향을 주지 못했다. 따라서 겨우살이 추출물은 PTEN 경로를 통한 항암 작용은 하지 않음을 알 수 있었다.
- 본 연구에서도 Bcl-2 와 p53 단백질 발현을 알아본 Western blot 실험 결과 약물처리 48시간 후 대조군에 비해 5-FU, cisplatin, AVQ, AVF 처리군에서 Bcl2 단백질 발현량이 감소하는 것이 관찰되었고 겨우살이 추출물과 5-FU, cisplatin 병합 처리 시에는 Bcl2 단백질 발현량이 더욱 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 허나 p53 의 경우에는 항암제인 5-FU 와 cisplatin 을 처리한 실험군들에서만 그 발현량이 대조군에 비해 매우 높게(37~50%) 증가하였지만 겨우살이 추출물만을 처리한 실험 군들에서는 대조군과 차이가 없었다.
- 그 결과를 분석하였다. 분석 결과, 처리한 약물들의 농도의 고저에 상관없이 caspase 3의 활성은 증가하였고 caspase 3 작용 억제 물질인 Z-VAD-FMK 를 처리함으로써 활성이 매우 낮게 감소한 것으로부터 겨우살이 추출물 및 5-FU 처리는 caspase 3의 활성을 증가시킴을 알 수 있다. 특히 고용량으로 이들 약물을 처리하였을 때 저농도에서 보다 최고 3배 이상 caspase 3의 활성이 증가하였다 (Fig.
- Maier 등은 세종류 (Iscardor M, Qu, P) 의 미슬토 추출물을 이용하여 16개의 사람 종양 세포주에 대해 항 증식 및 자극효과를 시험했다. 이 실험에서 세 종류 모두 종양 생장 자극의 증거는 없으며, 높은 lectin 농도를 함유한 Iscardor M 과 Qu에서 유방암 세포주에서 15 “g/ml dose level에서 대조군에 비해 70% 이상 생장 억제 현상을 관찰할 수 있었다. 또한 Iscardor M에서 3개의 cancer cell lines 에서 Iscardor Qu 에서 7개의 cell lines 에서 약한 항종양 효과(생장 억제 30 - 70%)를 관찰할 수 있었다.
- 이들 약물이 세포의 사멸률에 미치는 영향을 알기위해 lactate dehydrogenase (LDH) 활성을 측정해 본 결과 세포 생존율 결과와 같은 맥락에서 약물 농도가 증가함에 따라 세포 사멸률은 증가하였고 이때도 항암제인 5-FU 의 사멸률이 겨우살이 추출물들보다 더 컸다 (Fig. 2). 또한 겨우살이 추출물과 5-FU 를 병합처리 하였을 때 겨우살이 추출물들을 단독으로 처리하였을 경우보다 0.
- 종양 억제 인자 (tumor suppressor) 로서 작용하는 PTEN 의 단백질 발현량 변화를 겨우살이 추출물과 항암제들을 처리한 후 Western blot analysis 를 사용하여 측정한 결과 5-FU 와 겨우살이 추출물들을 각각 그리고 병합 처리하였을 때 PTEN 의 발현량에는 의미 있는 차이가 없었고 이는 cisplatin을 처리하였을 경우에도 같은 결과를 보여주었다 (Fig. 8).
- 종양 콜로니 형성 (tumor colony formation) 을 대조군에 비해 30%까지 억제하는 농도를 (T/C<30%) 비교해본 결과 ABNOBAviscum mali 가 5 “M/ml 농도로 가장 높은 세포독성을 보였으며 다른 약제들은 100 ug/ml 이상의 농도에서 이와 비슷한 세포독성을 보였다.(14) 여러 논문 검색에서 저자들과 유사한 실험논문이 검색되지 않아 비교할 수 없었지만 저자들이 사용한 위암 세포주 (SNU-719) 에서의 세포사멸 효과는 항암제인 5-FU 에 의한 농도 의존적 세포사멸 효과는 10 ug/ml 처리 시 약 50% 세포사멸이 나타났으며 이에 비해서 겨우살이 추출물 단독처리에 의한 세포사멸효과는 AVF 인 경우 약 40 ug/ml 에서 AVQ 인 경우 약 50 ug/ml 의 농도에서 나타남을 확인하였다 (Fig.
- 지나야 대조군에 비해 발현량에 변화가 있었다. 즉, 항암제인 5-FU와 cisplatin, 그리고 겨우살이 추출물들 모두 Bcl2 의 발현량을 감소시켰고 항암제들의 감소 효과가 더 컸다. 특히 항암제와 겨우살이 추출물을 병합 처리하였을 경우 각각 단독으로 처리하였을 때보다 Bcl2 의 발현량이 더 감소하는 상승효과를 나타내었다.
- 분석 결과, 처리한 약물들의 농도의 고저에 상관없이 caspase 3의 활성은 증가하였고 caspase 3 작용 억제 물질인 Z-VAD-FMK 를 처리함으로써 활성이 매우 낮게 감소한 것으로부터 겨우살이 추출물 및 5-FU 처리는 caspase 3의 활성을 증가시킴을 알 수 있다. 특히 고용량으로 이들 약물을 처리하였을 때 저농도에서 보다 최고 3배 이상 caspase 3의 활성이 증가하였다 (Fig. 5).
- 즉, 항암제인 5-FU와 cisplatin, 그리고 겨우살이 추출물들 모두 Bcl2 의 발현량을 감소시켰고 항암제들의 감소 효과가 더 컸다. 특히 항암제와 겨우살이 추출물을 병합 처리하였을 경우 각각 단독으로 처리하였을 때보다 Bcl2 의 발현량이 더 감소하는 상승효과를 나타내었다.
- 항암제 5-FU 와 겨우살이 추출물들 (AVQ 와 AVF) 은 모두 세포에 처리한 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 감소하였고 항암제의 세포 생존율 감소 효과가 겨우살이 추출물보다 더 컸다 (Fig. 1). 세포 생존율 실험을 통해 겨우살이추출물들이 SNU-719 위암세포에 대한 반수치사량(LD50: 50% lethal dose) 은 50"g/ml 내외라는 것을 알 수 있었고 이처리 농도 이상에서는 급격하게 세포 사멸률이 증가하는즉, 세포독성 효과를 보이고 있다.
- 비해 발현량이 매우 높게 증가하였다. 항암제를 처리하였을 때 24시간 후부터 대조군에 비해 매우 높게 발현이 증가하였고 48시간이 지난 후에는 5-FU 경우는 오히려 약간 발현량이 줄어들었고 cisplatin 의 경우에는 차이가 없었다 (Fig. 6, 7).
후속연구
- 본 연구에서 겨우살이 추출물 처리 농도가 50 ug/ml 이상에서는 급격히 높은 세포 사멸 효과, 즉 세포 독성 효과를 나타내나 세포주를 대상으로 시행한 in vitro 연구의 한계성을 볼 때 이를 곧바로 임상치료에 적용하는 것은 무리가 있다. 다만 본 연구를 통해 겨우살이 추출물의 항암작용의 기전을 정확히 파악하고 또 기존 항암제와 병합 처리 효과를 앎으로써 위암 환자치료에 새로운 대안을 제시할 수 있을 것으로 사료된다. 항암제와의 병용효과에 대한 연구에서 Galm 등은 사람 백혈병 세포주 (human leukemia cell lines) 인 K562와 KG1a 에 대한 유전자 재조합 겨우살이 lectin (rViscumin) 이 여러 항암제 (vincristine, mafosf-amide, idarubicin and cisplatin) 의 독성효과를 증가시키는 것을 보고하였다.
- 1, 2). 본 연구에서 겨우살이 추출물 처리 농도가 50 ug/ml 이상에서는 급격히 높은 세포 사멸 효과, 즉 세포 독성 효과를 나타내나 세포주를 대상으로 시행한 in vitro 연구의 한계성을 볼 때 이를 곧바로 임상치료에 적용하는 것은 무리가 있다. 다만 본 연구를 통해 겨우살이 추출물의 항암작용의 기전을 정확히 파악하고 또 기존 항암제와 병합 처리 효과를 앎으로써 위암 환자치료에 새로운 대안을 제시할 수 있을 것으로 사료된다.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.