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문제 정의
- 따라서 본 연구는 측정불확도(uncertainty of measurement) 개념8)을 정량이 필요한 법과학 분야에 도입하여 분석결과의 신뢰도를 보다 정확하고 객관적으로 표현하고자 하는데 목적이 있다. 본 연구에서는 대마 흡연여부 확인을 위한 소변 감정에 대한 불확도를 추정하고 평가하였다.
- 을 정량이 필요한 법과학 분야에 도입하여 분석결과의 신뢰도를 보다 정확하고 객관적으로 표현하고자 하는데 목적이 있다. 본 연구에서는 대마 흡연여부 확인을 위한 소변 감정에 대한 불확도를 추정하고 평가하였다. 우선 소변 중 대마 대사체를 분석하는 과정에서 결과에 영향을 줄 수 있는 요인들을 찾아내어, 관계식(measurand)을 설정하고, 요인별 측정값으로부터 표준불확도(standard uncertainty), 합성표준불확도(combined standard uncertainty) 및 확장불확도(expanded uncertainty)를 구하였다.
- 시료로부터 산출되는 최종 분석결과 값 내에는 시험을 거치면서 발생하는 다양한 불확도 요인들이 포함되어 있다. 따라서 본 연구에서는 소변 중 THCCOOH 측정 결과 값에 여러 요인으로부터 기인한 불확도를 표기하여 측정값의 존재 범위를 표시함으로써 분석 결과의 품질을 정량적으로 나타내고자 하였다.
가설 설정
- 본 연구는 대조 소변을 포함한 모든 시료에 동위원소로 치환된 내부표준물질을 첨가하는 내부표준법을 사용함으로써 분석과정 중 전처리단계에서 발생할 수 있는 불완전한 추출, 용매의 증발, 칼럼 통과시 손실되는 양과 시험자의 조작 손실 등은 보정되는 것으로 가정하였다.12)
- 검량선은 4개 농도(2, 10, 20, 40 ng/ml)의 표준용액을 각각 2회 분석하여 작성하였다(Table V). 검량선과 관련된 변수는 가로축 값의 불확도가 세로축 값의 불확도보다 작다는 가정을 전제조건으로 하여 선형 최소제곱법으로 계산하였다. 그 결과 THCCOOH의 검량선은 결정계수 0.
제안 방법
- 시료를 상온으로 냉각한 다음 그 중 1 µl를 GC/MS에 주입하여 분석하였다(Fig. 2).
- 보관표준용액은 각각의 표준물질을 methanol에 녹여 순차적으로 10, 1, 0.1 µg/ml 농도로 희석시켜 조제하였으며, 사용하기 전까지 -20℃에서 냉동 보관하였다.
- 본 연구에서는 대마 흡연여부 확인을 위한 소변 감정에 대한 불확도를 추정하고 평가하였다. 우선 소변 중 대마 대사체를 분석하는 과정에서 결과에 영향을 줄 수 있는 요인들을 찾아내어, 관계식(measurand)을 설정하고, 요인별 측정값으로부터 표준불확도(standard uncertainty), 합성표준불확도(combined standard uncertainty) 및 확장불확도(expanded uncertainty)를 구하였다. 이러한 분석결과에 대한 측정불확도 표시는 약 95%의 신뢰도에서 측정값의 존재 범위로 표기하였다.
- 이러한 분석결과에 대한 측정불확도 표시는 약 95%의 신뢰도에서 측정값의 존재 범위로 표기하였다.9) 그리고 불확도 요인들에 대한 측정불확도 평가 결과를 시험법 개선 및 오차요인의 영향을 감소시키는데 활용하였다.
- 주입구와 검출기 부위의 온도는 각각 250℃와 280℃로 설정하였다. 운반기체 헬륨의 유속은 0.7 ml/min으로 고정하였고, 주입방법은 비분할 방식(splitless mode)으로 purge-on time을 0.75분으로 설정하였다. 시료는 미국 Agilent Technologies사 7683 자동주입장치(autosampler)를 사용하여 분석 장비에 주입하였다.
- 10 M KOH 용액 200 µl를 넣고 교반기를 이용하여 상온에서 30초간 혼합한 후, 아세트산을 첨가하여 pH 4로 조정하였다. 고체상 추출용 카트리지를 활성화하기 위해 메탄올 1ml와 증류수 1ml를 순서대로 2ml/min의 속도로 각각 흘려주었다. 활성화된 카트리지에 시료를 2ml/min의 속도로 흘려준 후, 증류수 2ml와 헥산 4 ml를 순서대로 흘려주어 세척하였다.
- 정량 범위는 소변 중에 존재하는 농도를 고려하여 농도 범위를 정하였으며, 3가지 농도의 THCCOOH 희석된 표준용액(10, 1, 0.1 µg/ml)을 대조 소변 시료에 첨가하여 검량선(calibration curve)을 작성하였다.
- 최종 전처리 단계를 거친 시료 중 1 µl를 GC/MS에 주입하여 분석하였으며, 그 결과로부터 검량선을 작성하였다.
- 여기에 THCCOOH-d3을 메탄올에 녹여 1 µg/ml 농도로 제조한 내부표준용액 45 µl를 취하여 넣은 다음 시료와 동일한 방법으로 처리하여 분석하였다.
- 1 µg/ml)을 대조 소변 시료에 첨가하여 검량선(calibration curve)을 작성하였다. 본 연구에서는 THCCOOH의 정량 농도 범위를 2.0~40 ng/ml로 정하여 표준용액을 첨가하여 4개의 농도의 검량점(calibration point)에 해당하는 시료를 제조하였다. 여기에 THCCOOH-d3을 메탄올에 녹여 1 µg/ml 농도로 제조한 내부표준용액 45 µl를 취하여 넣은 다음 시료와 동일한 방법으로 처리하여 분석하였다.
- 대조 소변 시료 3ml에 THCCOOH 표준용액을 첨가하여 소변 중 대마 대사체의 농도를 5 ng/ml로 맞추고, 시료와 같은 방법으로 처리 분석한 후, 측정된 양을 비교하여 정밀도를 검토하였다. 일간(inter-day) 정밀도는 한명의 시험자가 4일간 반복하여 측정하였으며, 시험자간(inter-person) 정밀도는 세 명의 시험자가 반복하여 측정하였다.
- 대조 소변 시료 3ml에 THCCOOH 표준용액을 첨가하여 소변 중 대마 대사체의 농도를 5 ng/ml로 맞추고, 시료와 같은 방법으로 처리 분석한 후, 측정된 양을 비교하여 정밀도를 검토하였다. 일간(inter-day) 정밀도는 한명의 시험자가 4일간 반복하여 측정하였으며, 시험자간(inter-person) 정밀도는 세 명의 시험자가 반복하여 측정하였다.
- 를 근거로 요인별 관계 모델(입력량과 출력량의 함수식 표현)의 설정, 불확도를 포함하고 있는 요인 파악, 입력량의 요소별 표준불확도 계산, 실제 시료에서 측정불확도의 계산 및 각각의 불확도 요소에 대한 평가와 불확도를 수치로 나타내는 4단계로 나눌 수 있다. 즉 측정모델에 포함된 개개 요인의 불확도 요소로부터 표준불확도를 산출하고, 모든 표준불확도를 합하여 합성표준불확도를 구한다. 그리고 합성표준불확도에 신뢰 수준에 상당하는 포함인자(coverage factor, k)를 곱하여 확장불확도를 계산하고, 그 결과로부터 불확도를 수치로 나타낸다.
- 1 ml 피펫을 사용하여 시료 3ml의 부피를 측정할 때 발생하는 불확도는 1ml씩 3회 측정한 부피의 불확도로부터 표준불확도를 계산하였다. 따라서 1ml씩 3회 반복 측정에 의한 상대표준불확도(ur vol')는 식(2)에 적용한 결과, 0.
- 보관표준용액을 10배 희석한 1차 표준용액(1st working standard solution, W1)을 제조하는 과정의 불확도 산출을 위하여 먼저 보관표준용액의 표준불확도를 계산하였다.
- 14) 본 실험에서는 5.0 ng/ml 농도의 QC 시료를 선택하여 불확도를 산출하였다. 한 명의 시험자가 일간(inter-day) 정밀도 측정을 위해 4일간 반복하여 측정하였으며 또한 서로 다른 세 명의 시험자 사이에서 측정이 반복적으로 이루어질 때 발생하는 측정시스템 및 재현성의 요소를 QC 시료에 대한 정밀도로 반영하였다.
- 0 ng/ml 농도의 QC 시료를 선택하여 불확도를 산출하였다. 한 명의 시험자가 일간(inter-day) 정밀도 측정을 위해 4일간 반복하여 측정하였으며 또한 서로 다른 세 명의 시험자 사이에서 측정이 반복적으로 이루어질 때 발생하는 측정시스템 및 재현성의 요소를 QC 시료에 대한 정밀도로 반영하였다. Fig.
- 검량선은 4개 농도(2, 10, 20, 40 ng/ml)의 표준용액을 각각 2회 분석하여 작성하였다(Table V). 검량선과 관련된 변수는 가로축 값의 불확도가 세로축 값의 불확도보다 작다는 가정을 전제조건으로 하여 선형 최소제곱법으로 계산하였다.
- 요약하면 측정값을 산출하는데 관련 있는 요인들을 포함하는 모델식 설정, 각 입력량에 대한 불확도 요소의 측정값 산출, 산출된 값으로부터 표준불확도를 계산하는 과정으로 압축될 수 있다. 또한 불확도 전파의 법칙에 근거해 표준불확도로부터 합성표준불확도를 구하고, 포함인자(k)를 곱하여 최종 확장불확도를 계산하였다. 실제 대마 흡연자의 소변에서 THCCOOH의 농도 측정값은 11.
대상 데이터
- 표준물질 THCCOOH은 1ml 용량의 유리병(vial)에 0.1 mg/ml 농도로, 내부표준물질 THCCOOH-d3은 1ml 용량의 유리병에 10 µg/ml 농도로 제조된 제품을 미국 Cerilliant사에서 구입하였다.
- 희석된 표준용액을 조제하기 위해 독일 Brand사의 용량 플라스크(10 ml)와 독일 Eppendorf사의 피펫(1000 µl)을 사용하였으며, 시험에 사용될 소변 시료의 양을 측정하기 위해 독일 Eppendorf사의 피펫(1000 µl)을 사용하였다.
- 1 mg/ml 농도로, 내부표준물질 THCCOOH-d3은 1ml 용량의 유리병에 10 µg/ml 농도로 제조된 제품을 미국 Cerilliant사에서 구입하였다. 추출과정에 사용된 용매 및 시약은 특급이며 미국 J. T. Baker 사에서 구입하였다. 유도체 시약인 N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide/1% trimethylchlorosilane(BSTFA/1% TMCS)는 미국 Alltech사로부터 구입하였다.
- Baker 사에서 구입하였다. 유도체 시약인 N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide/1% trimethylchlorosilane(BSTFA/1% TMCS)는 미국 Alltech사로부터 구입하였다. 고체상 추출에 사용된 카트리지로 Oasis MCX(60 mg, 3 ml)는 미국 Waters사에서 구입하였다.
- 유도체 시약인 N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide/1% trimethylchlorosilane(BSTFA/1% TMCS)는 미국 Alltech사로부터 구입하였다. 고체상 추출에 사용된 카트리지로 Oasis MCX(60 mg, 3 ml)는 미국 Waters사에서 구입하였다. 보관표준용액은 각각의 표준물질을 methanol에 녹여 순차적으로 10, 1, 0.
- 분석에 사용된 장비는 미국 Agilent Technologies사 6890 Gas Chromatograph(GC)에 5973 Mass Selective Detector가 연결된 GC/MS를 사용하였다. 분리관은 DB-5MS(25 m×0.
- 75분으로 설정하였다. 시료는 미국 Agilent Technologies사 7683 자동주입장치(autosampler)를 사용하여 분석 장비에 주입하였다.
- 2008년 6월부터 7월까지 약 2개월 동안 수도권 소재 검찰청으로부터 감정 의뢰된 대마초 흡연 용의자의 소변을 연구용 시료로 사용하였다. 그리고 약물을 복용하지 않은 사람의 소변을 채취하여 대조 시료로 사용하였다.
- 2008년 6월부터 7월까지 약 2개월 동안 수도권 소재 검찰청으로부터 감정 의뢰된 대마초 흡연 용의자의 소변을 연구용 시료로 사용하였다. 그리고 약물을 복용하지 않은 사람의 소변을 채취하여 대조 시료로 사용하였다. 연구용 및 대조 시료로 사용된 소변은 사용 전까지 -20℃에서 냉동 보관하였다.
- 피펫 자체의 불확도는 교정성적서 자료를 활용하였다. 교정성적서로부터 95%의 신뢰구간에서 불확도(k=2)가 0.
데이터처리
- 지금까지 소변 감정의 개별 시료에서 대마 성분에 대한 분석결과의 불확도를 정량적으로 표현하지 못했다. 다만 분석법을 개발할 때 실시하는 분석방법에 대한 검정(method validation) 과정과 실제 시료와 함께 분석하는 품질관리(QC) 시료의 정밀도(precision)와 정확도(accuracy)로 분석결과의 신뢰도를 나타내었다. 그러나 이러한 표현 방법은 분석법을 구성하는 요소인 시료량 측정, 시험자간 불확도, 용액제조 시 희석에 의한 오차, 검량선 작성에 따른 오차 등 개별 인자들의 오차 크기를 비교 가능한 수치로 표시하고 이를 근거로 분석법을 개선하는데 유용하지 못하였다.
이론/모형
- 시험은 '소변 중 대마 성분 감식법'(SPO-DRUG-QA-04, 2006)에 규정된 방법에 따라 실시하였다.
- 희석된 표준용액을 조제하기 위해 독일 Brand사의 용량 플라스크(10 ml)와 독일 Eppendorf사의 피펫(1000 µl)을 사용하였으며, 시험에 사용될 소변 시료의 양을 측정하기 위해 독일 Eppendorf사의 피펫(1000 µl)을 사용하였다. 전처리 과정은 자동화 장비인 미국 캘리퍼사의 Rapid Trace SPE workstation을 사용하여 고체상 추출(solid-phase extraction, SPE)을 수행하였다.
- 시료 부피 측정 과정의 유효자유도(νeff)는 요인별 표준편차의 자유도를 식(3)의 Welch-Satterthwaite equation에 적용하여 구한 결과 그 값은 무한대(∞)였다.
- )를 계산하여 Table I에 정리하였다. 보관표준물질의 순도에 적용된 표준불확도는 직사각형 모양의 분포함수에 따르는 B형 불확도 평가 방법을 이용하여 계산하였고, 상대표준불확도는 표준불확도를 초기 농도로 나누어 구하였다.
- 불확도 평가는 측정불확도 표현 지침서에 나타나있는 방법에 따라 수행하였다. 요약하면 측정값을 산출하는데 관련 있는 요인들을 포함하는 모델식 설정, 각 입력량에 대한 불확도 요소의 측정값 산출, 산출된 값으로부터 표준불확도를 계산하는 과정으로 압축될 수 있다.
성능/효과
- 플라스크 자체의 불확도는 교정성적서로부터 95%의 신뢰구간에서 불확도(k=2)가 0.008 ml로 표준불확도(ucert')는 0.004 ml임을 알 수 있었다.
- 검량선과 관련된 변수는 가로축 값의 불확도가 세로축 값의 불확도보다 작다는 가정을 전제조건으로 하여 선형 최소제곱법으로 계산하였다. 그 결과 THCCOOH의 검량선은 결정계수 0.9995, 기울기 0.0631, y-절편 0.009의 값을 나타내었다. 실제 복용자의 소변 시료로부터 THCCOOH 성분의 검량선에 적용하여 2회 분석하여 얻은 평균농도는 11.
- 009의 값을 나타내었다. 실제 복용자의 소변 시료로부터 THCCOOH 성분의 검량선에 적용하여 2회 분석하여 얻은 평균농도는 11.53 ng/ml이었다.
- 본 연구를 통하여 검토된 불확도 요인은 크게 5가지로 시료의 분취, 표준용액의 제조, 일간 측정의 반복성, 시험자간 측정의 재현성 및 GC/MS 검량선의 비직선성이었다. 불확도 추정 및 평가과정을 통하여 5가지 요인 중 시험자간 측정의 재현성, 일간 측정의 반복성, 검량선의 비직선성에 의한 요소가 가장 큰 영향을 미치는 요인임을 알 수 있었다. 첫째, 시험자간 측정 편차에 의한 불확도는 시험자간 숙련도, 경험, 자질 등의 차이에 의한 것으로 볼 수 있다.
- 불확도 추정 및 평가과정을 통하여 5가지 요인 중 시험자간 측정의 재현성, 일간 측정의 반복성, 검량선의 비직선성에 의한 요소가 가장 큰 영향을 미치는 요인임을 알 수 있었다. 첫째, 시험자간 측정 편차에 의한 불확도는 시험자간 숙련도, 경험, 자질 등의 차이에 의한 것으로 볼 수 있다. 시험자간 측정 편차는 직무 교육, 비교숙련도 시험 참가 등 품질보증 프로그램을 통해 시험자간 편차를 줄여 나갈 수 있을 것으로 판단된다.
- 측정값을 약 95%의 신뢰구간에서 포함인자 k=2.1일 때 불확도를 포함하여 표기하면(11.53±1.39) ng/ml(k=2.1, 신뢰수준 약 95%)이었으며, 불확도는 THCCOOH의 농도에 대해서 12.05%였다.
- 본 연구를 통하여 검토된 불확도 요인은 크게 5가지로 시료의 분취, 표준용액의 제조, 일간 측정의 반복성, 시험자간 측정의 재현성 및 GC/MS 검량선의 비직선성이었다. 불확도 추정 및 평가과정을 통하여 5가지 요인 중 시험자간 측정의 재현성, 일간 측정의 반복성, 검량선의 비직선성에 의한 요소가 가장 큰 영향을 미치는 요인임을 알 수 있었다.
후속연구
- 시험자간 측정 편차는 직무 교육, 비교숙련도 시험 참가 등 품질보증 프로그램을 통해 시험자간 편차를 줄여 나갈 수 있을 것으로 판단된다. 둘째, 일간 측정의 반복성에 의한 불확도는 시험자간 측정 편차에 의한 불확도와 중복되는 부분이 있을 것으로 생각되므로 중복되는 부분을 효과적으로 배제할 수 있는 기법을 고안하여 적용해야 정확한 불확도를 계량화할 수 있을 것으로 생각된다. 다음으로 검량선의 비직선성에 의한 불확도는 기질의 특이성과 소변내의 방해물질의 영향에 의한 것으로 판단되며, 분석대상 물질의 분리능(separation resolution)과 선택성(selectivity)을 향상시킴으로써 일정 정도 개선될 것으로 판단된다.
- 둘째, 일간 측정의 반복성에 의한 불확도는 시험자간 측정 편차에 의한 불확도와 중복되는 부분이 있을 것으로 생각되므로 중복되는 부분을 효과적으로 배제할 수 있는 기법을 고안하여 적용해야 정확한 불확도를 계량화할 수 있을 것으로 생각된다. 다음으로 검량선의 비직선성에 의한 불확도는 기질의 특이성과 소변내의 방해물질의 영향에 의한 것으로 판단되며, 분석대상 물질의 분리능(separation resolution)과 선택성(selectivity)을 향상시킴으로써 일정 정도 개선될 것으로 판단된다. 이러한 시험방법에 대한 불확도 추정 및 평가 결과는 향후 시험법 개선에 반영시켜 오차 요인들의 영향을 감소시키는 데 활용할 예정이다.
- 다음으로 검량선의 비직선성에 의한 불확도는 기질의 특이성과 소변내의 방해물질의 영향에 의한 것으로 판단되며, 분석대상 물질의 분리능(separation resolution)과 선택성(selectivity)을 향상시킴으로써 일정 정도 개선될 것으로 판단된다. 이러한 시험방법에 대한 불확도 추정 및 평가 결과는 향후 시험법 개선에 반영시켜 오차 요인들의 영향을 감소시키는 데 활용할 예정이다.
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