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문제 정의
- 본 연구에서는 예로부터 약용 및 식용으로 사용되는 생강나무를 새로운 가능성 소재로 활용하기 위해 잎 추출물과 가지/줄기혼합 추출물에서 항산화 활성과 미백효과를 측정하였다.
제안 방법
- 17시간 후 cell의 부착을 확인한 후 배지를 걷어내고 각 농도 별로 배지에 녹여 조제한 생강나무 잎 추출물 1.0, 5.0, 10, 50 µg/ml을 각 well에 1 ml씩 분주하였다.
- 17시간 후 cell의 부착을 확인한 후 배지를 걷어내고 각 농도 별로 배지에 녹여 조제한 생강나무 잎 추출물 1.0, 5.0, 10, 50 µg/ml을 각 well에 1ml씩 분주하였다.
- 17시간 후 cell의 부착을 확인한 후 배지를 걷어내고 각 농도 별로 배지에 녹여 조제한 생강나무 잎 추출물 1.0, 5.0, 10, 50, 100 µg/ml을 각 well에 1ml씩 분주하였다.
- Cell viability − 세포에서의 미백효과 확인은 위의 항산화 활성 결과를 바탕으로 잎 추출물에서만 확인하였다.
- DPPH radical 소거활성에 의한 항산화 효능 검색 − 각 농도별로 조제한 생강나무 잎 추출물 5, 10 50, 100, 500, 1000 µg/ml의 용액과 가지·줄기 혼합 추출물 10, 50, 100, 500 µg/ml의 용액 20 µl와 70% ethanol 100 µl, 95% ethanol에 녹인 0.15 mM DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)용액 80 µl를 넣고 37°C에서 30분 동안 방치시킨 후 517 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Hydroxyl radical 소거활성에 의한 항산화 효능 검색 − 시험관에 95% ethanol에 녹인 2.5 mM β-carotene 200 µl에 5.94 mM H2O2, 800 µl와 26.4 mM FeSO4의 농도가 되게 녹인 정제수 800 µl, 각 농도 별로 조제한 생강나무 잎 추출물 0.5, 1.0, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5 mg/ml과 가지줄기 혼합 추출물 0.5, 1.0, 1.5 mg/ml 용액 200 µl를 혼합한 후 곧바로 536 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- Superoxide radical(Non-enzymatic system : NADH-PMS) 소거활성에 의한 항산화 효능 검색 − 24 well plate에 각 농도 별로 조제한 생강나무 잎 추출물 1.0, 5.0, 10, 50, 100, 500 µg/ml과 가지/줄기 혼합 추출물 1.0, 10, 100, 1000 µg/ml 용액 20 µl에 30 mM Tris-HCl buffer(pH 8.0) 100 µl와 100 µM PMS(Phenazine methosulfate) 20 µl, 0.5 mM NADH 40 µl, 0.5 mM NBT 20 µl를 혼합하여 37°C에서 20분 동안 방치한 후 560 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 대조 약물로서는 ascorbic acid 0.01, 0.1, 1.0, 10, 100, 1000 µg/ml를 사용하였으며 결과는 시료를 처리하지 않은 군에 대한 percentage(%)로 표기하였다.
- 대조 약물로서는 ascorbic acid(vitamin C) 0.5, 1.0, 5.0, 10, 50 µg/ml을 사용하였으며 결과는 시료를 처리하지 않은 군에 대한 percentage(%)로 표기하였다.
- 72시간 동안 CO2 incubator에서 배양한 후 MTT 용액을 넣고, 다시 4시간 동안 CO2 incubator에서 배양하였다. 배지를 제거하고, DMSO로 cell을 녹여 560 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 시료를 처리하지 않은 군에 대한 percentage(%)로 표기하였다.
- 이 후의 tyrosinase activity와 melanin content 측정 실험은 독성이 나타나지 않은 1, 5, 10, 50 µg/ml의 농도 범위 안에서 실시하였다.
대상 데이터
- Tyrosinase activity inhibition − B16 melanoma F10 cell을 24 well에 well당 104 cell씩 분주하였다.
- 대조 약물로는 xanthine oxidase 억제 작용이 있는 약물로 널리 알려진 allopurinol 0.68, 1.36, 6.8, 13.36, 136 µg/ml을 사용하였으며 결과는 시료를 처리하지 않은 군에 대한 percentage(%)로 표기하였다.
- 5 mg/ml 용액 200 µl를 혼합한 후 곧바로 536 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조 약물로서는 mannitol 0.0018, 0.0091, 0.0182, 0.091, 0.182, 0.91, 1.82 mg/ml을 사용하였으며 결과는 시료를 처리하지 않은 군에 대한 percentage(%)로 표기하였다.
- 본 실험에서 사용한 생강나무는 충청남도 천안에서 채집하였다, 잎과 가지줄기 부분만을 따로 분리, 세척하고 물기를 제거한 다음 건조 시켜 각각의 재료 100 g을 분쇄하여 70% ethanol을 넣고 환류하면서 80°C에서 4시간씩 3회 반복 추출하였다.
- 실험에 사용한 B16F10은 마우스의 melanoma 세포주로 미국 ATCC에서 구입하였다. Cell culture에 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium), 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin은 Hyclone Laboratories Inc.
- 본 실험에서 사용한 생강나무는 충청남도 천안에서 채집하였다, 잎과 가지줄기 부분만을 따로 분리, 세척하고 물기를 제거한 다음 건조 시켜 각각의 재료 100 g을 분쇄하여 70% ethanol을 넣고 환류하면서 80°C에서 4시간씩 3회 반복 추출하였다. 이를 감압 농축, 동결 건조하여 그 분말을 실험에 사용하였다. 잎의 수득율은 26.
데이터처리
- 자료분석 및 통계처리 − 모든 실험결과는 평균±표준편차로 표기하였고, 통계적 유의성은 Student's t-test로 분석하였으며, p값이 0.01 미만일 때 통계적으로 유의하다고 판단하였다.
성능/효과
- 그러나 식물은 이러한 활성산소에 대한 방어기작으로 이를 제거할 수 있는 tocopherol, ascorbic acid, catechine, glutathione 등과 같은 다양한 형태의 천연 항산화제를 함유하고 있으며,3-6) 특히, 항산화 효소의 발현은 중요한 역할을 한다.7) 항산화 효소는 superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase 등이 있는데 superxoide dismutase(SOD)는 superoxide anion radical(#)을 제거하여 hydrogen peroxide(H2O2)로 전환시키는 촉매 효소이고, catalase(CAT)는 주로 peroxisom 에 존재하며 H2O2를 물과 산소로 분해한다.8) 이러한 천연 항산화제나 항산화 효소들은 독자적인 작용이나 다른 작용을 보조하는 과정을 통해 활성 산소로부터 생체를 보호하는 작용을 한다.
- DPPH radical 소거활성에 의한 항산화 효능 검색 − 생강나무 여러 부위별(잎, 가지/줄기) 추출물의 DPPH radical소거능은 잎의 경우 5.0~1000 µg/ml에서 농도 의존적인 경향을 나타냈으며, 가지/줄기 혼합 추출물의 경우 0.5~500 µg/ml에서 농도 의존적인 경향을 나타냈다.
- Hydroxyl radical 소거활성에 의한 항산화 효능 검색 − 생강나무 잎 추출물의 hydroxyl radical 소거능은 생강나무 잎 추출물에서만 확인할 수 있었다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 잎 추출물 1.0~1.5 mg/ml 범위에서 농도 의존적으로 소거하였으며, 그 효과는 잎 추출물의 IC50 수치가 1.21 mg/ml로 hydroxyl radical 소거제인 mannitol의 IC50 수치 0.159 mg/ml과 비교했을 때 10배 정도의 활성 산소 소거능 차이를 가짐을 알 수 있었다.
- Hydroxyl radical 소거활성에 의한 항산화 효능 검색 − 생강나무 잎 추출물의 hydroxyl radical 소거능은 생강나무 잎 추출물에서만 확인할 수 있었다.
- Superoxide radical(Non-enzymatic system : NADHPMS) 소거활성에 의한 항산화 효능 검색 − 비효소적 superoxide radical 생성계인 NADH/PMS에서의 superoxide radical 소거능은 잎의 경우 1~500 µg/ml에서 농도 의존적으로 소거되는 경향을 나타냈으며, 가지/줄기 혼합 추출물의 경우 1~1,500 µg/ml에서 농도 의존적으로 소거되는 경향을 보였다(Fig. 3).
- Tyrosinase activity inhibition − 세포 독성이 나타나지 않는 1, 5, 10, 50 µg/ml 농도 범위에서 tyrosinase 활성 저해율은 각각 9.8, 14.3, 17.3, 45.2%를 보였다(Fig. 6).
- 생강나무 잎 추출물과 가지/줄기 추출물의 항산화 효과는 가지/줄기 추출물보다는 잎 추출물에서 높은 항산화 활성을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 세포에서 잎 추출물을 농도 별로 처리하여 tyrosinase activity와 melanin content를 본 결과 미백효과가 있음을 검증할 수 있었다.
- 이러한 결과를 바탕으로 세포에서 잎 추출물을 농도 별로 처리하여 tyrosinase activity와 melanin content를 본 결과 미백효과가 있음을 검증할 수 있었다. 생강나무 추출물 특히 잎 추출물은 항산화 능력에 비해 미백효과가 더 강하게 나타나 새로운 미백소재로서 개발 가능성이 충분할 것으로 확인 할 수 있었다.
- 생강나무 추출물의 세포 독성은 잎 추출물의 경우 100 µg/ml의 농도 이상에서 독성이 있음을 확인하였다(Fig. 5).
- 7). 이는 Fig. 5의 결과와 종합하여 볼 때 세포의 증식을 억제하지 않는 범위에서 세포 내 total melanin content가 22% 감소한 것으로 생강나무의 미백능을 확인할 수 있다.
- 생강나무 잎 추출물과 가지/줄기 추출물의 항산화 효과는 가지/줄기 추출물보다는 잎 추출물에서 높은 항산화 활성을 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 세포에서 잎 추출물을 농도 별로 처리하여 tyrosinase activity와 melanin content를 본 결과 미백효과가 있음을 검증할 수 있었다. 생강나무 추출물 특히 잎 추출물은 항산화 능력에 비해 미백효과가 더 강하게 나타나 새로운 미백소재로서 개발 가능성이 충분할 것으로 확인 할 수 있었다.
- 6). 이로부터 생강나무 잎 추출물의 melanin생성억제 가능성이 있음을 확인 할 수 있었다.
- 이를 감압 농축, 동결 건조하여 그 분말을 실험에 사용하였다. 잎의 수득율은 26.8%, 가지 줄기 혼합 추출물의 수득률은 17.8% 였다.
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