본 연구의 목적은 생강나무 추출물의 항산화 활성과 타이로시네이즈 저해 활성을 살펴봄으로써 화장품 원료로서의 응용 가능성을 확인하는 것이다. 모든 실험은 생강나무의 50 % 에탄올 추출물, 에틸아세테이트(ethyl acetate) 분획, 아글리콘(aglycone) 분획을 이용하여 진행하였다. 에틸아세테이트 분획의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 소거활성은 기존에 잘 알려져 있는 항산화제인 (+)-${\alpha}$-tocopherol 보다 높은 것으로 나타났다. $Fe^{3+}$-EDTA/ $H_2O_2$ 계에서 생성된 활성산소종에 대한 세 분획의 소거활성(총항산화능)은 대표적인 항산화제인 L-ascorbic acid와 비슷한 것으로 나타났다. Rose-bengal로 증감된 $^1O_2$에 의한 적혈구 파괴에서, 50 % 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획의 세포보호 효과는 농도 의존적($1{\sim}25{\mu}g/mL$)으로 증가하였다. $10{\mu}g/mL$ 농도를 기준으로 비교하였을 때 에틸아세테이트 분획의 ${\tau}_{50}$은 361.0 min으로 가장 높은 세포 보호 활성을 나타내었다. 타이로시네이즈 저해활성에서 에틸아세티이트 분획과 아글리콘 분획은 알부틴보다 높은 저해 효과를 나타내었다. 이상의 결과들로부터 생각나무 추출물은 활성산소종을 소거하는 항산화제로 여러 산업 분야에 응용 가능할 것이라 생각된다. 또한 알부틴을 대체하는 미백 기능성 소재로서 응용될 수 있는 가능성을 확인하였다.
본 연구의 목적은 생강나무 추출물의 항산화 활성과 타이로시네이즈 저해 활성을 살펴봄으로써 화장품 원료로서의 응용 가능성을 확인하는 것이다. 모든 실험은 생강나무의 50 % 에탄올 추출물, 에틸아세테이트(ethyl acetate) 분획, 아글리콘(aglycone) 분획을 이용하여 진행하였다. 에틸아세테이트 분획의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 소거활성은 기존에 잘 알려져 있는 항산화제인 (+)-${\alpha}$-tocopherol 보다 높은 것으로 나타났다. $Fe^{3+}$-EDTA/ $H_2O_2$ 계에서 생성된 활성산소종에 대한 세 분획의 소거활성(총항산화능)은 대표적인 항산화제인 L-ascorbic acid와 비슷한 것으로 나타났다. Rose-bengal로 증감된 $^1O_2$에 의한 적혈구 파괴에서, 50 % 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획의 세포보호 효과는 농도 의존적($1{\sim}25{\mu}g/mL$)으로 증가하였다. $10{\mu}g/mL$ 농도를 기준으로 비교하였을 때 에틸아세테이트 분획의 ${\tau}_{50}$은 361.0 min으로 가장 높은 세포 보호 활성을 나타내었다. 타이로시네이즈 저해활성에서 에틸아세티이트 분획과 아글리콘 분획은 알부틴보다 높은 저해 효과를 나타내었다. 이상의 결과들로부터 생각나무 추출물은 활성산소종을 소거하는 항산화제로 여러 산업 분야에 응용 가능할 것이라 생각된다. 또한 알부틴을 대체하는 미백 기능성 소재로서 응용될 수 있는 가능성을 확인하였다.
In this study, the antioxidative effects and inhibitory activities on tyrosinase of Lindera obtusiloba Blume (L. obtusiloba Blume) extracts were investigated. 50 % ethanol extract, ethyl acetate and aglycone fractions of L. obtusiloba Blume were used in experiments. The DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhy...
In this study, the antioxidative effects and inhibitory activities on tyrosinase of Lindera obtusiloba Blume (L. obtusiloba Blume) extracts were investigated. 50 % ethanol extract, ethyl acetate and aglycone fractions of L. obtusiloba Blume were used in experiments. The DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) scavenging activities of ethyl acetate fraction of L. obtusiloba Blume was higher than (+)-${\alpha}$-tocopherol, known as a typical antioxidant. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities of extract and fractions of L. obtusiloba Blume on ROS generated in $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ system were similar to L-ascorbic acid, well known as a strong antioxidant. The cellular protective effects of 50 % ethanol extract and ethyl acetate of L. obtusiloba Blume on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were increased in a concentration dependent manner ($1{\sim}25{\mu}g/mL$). Ethyl acetate fraction in $10{\mu}g/mL$ concentration showed the most protective effect among extracts (${\tau}_{50}$ = 361.0 min). The inhibitory effects on tyrosinase of ethyl acetate and aglycone fractions were higher than arbutin, known as a whitening agent. These results indicate that L. obtusiloba Blume extracts can be used as antioxidant, and could be applicable to functional cosmetic ingredient.
In this study, the antioxidative effects and inhibitory activities on tyrosinase of Lindera obtusiloba Blume (L. obtusiloba Blume) extracts were investigated. 50 % ethanol extract, ethyl acetate and aglycone fractions of L. obtusiloba Blume were used in experiments. The DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) scavenging activities of ethyl acetate fraction of L. obtusiloba Blume was higher than (+)-${\alpha}$-tocopherol, known as a typical antioxidant. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities of extract and fractions of L. obtusiloba Blume on ROS generated in $Fe^{3+}$-EDTA/$H_2O_2$ system were similar to L-ascorbic acid, well known as a strong antioxidant. The cellular protective effects of 50 % ethanol extract and ethyl acetate of L. obtusiloba Blume on the rose-bengal sensitized photohemolysis of human erythrocytes were increased in a concentration dependent manner ($1{\sim}25{\mu}g/mL$). Ethyl acetate fraction in $10{\mu}g/mL$ concentration showed the most protective effect among extracts (${\tau}_{50}$ = 361.0 min). The inhibitory effects on tyrosinase of ethyl acetate and aglycone fractions were higher than arbutin, known as a whitening agent. These results indicate that L. obtusiloba Blume extracts can be used as antioxidant, and could be applicable to functional cosmetic ingredient.
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문제 정의
이 두 번의 산화 반응 모두에 타이로시네이즈 효소가 관여하기 때문에 타이로시네이즈 저해활성은 미백 효능에 결정적인 역할을 한다[20]. 따라서 본 연구에서 사용한 천연 항산화제가 이러한 산화 반응을 방지하여 멜라닌 합성에 영향을 줄 수 있는지 확인해보았다.
생강나무의 항산화효과와 미백 연구는 일부 진행된 바 있으나[21-24], 피부에서 생성되는 다양한 ROS와 이것이 야기하는 손상들에 대해 초점이 맞춰져 있지 않았다. 따라서 본 연구에서는 각종 ROS가 생성되는 Fe3+-EDTA/H2O2 계에서의 총항산화능과 1O2으로 유도된 세포손상에 대한 보호 효과를 확인하였다. 또한 기존의 생강나무 연구에서는 유효성분의 추출 효율을 높이기 위해서 주로 70 % 에텐올 추출물을 사용하여 단편적인 항산화 효과를 확인하였다.
이외에도 다양한 ROS가 부가적으로 생성되면서 세포의 형태를 유지시켜주는 단백질을 산화하면서 세포 용혈을 유도한다. 따라서 해당 실험을 통해 활성산소에 의한 지질 과산화반응, 단백질 산화, 그리고 항산화제의 파괴 및 세포의 파괴 등을 알아볼 수 있다. 생강나무 추출물과 (+)-α-tocopherol으로 실험을 진행하였고, 결과 값은 적혈구 세포가 50 % 파괴되는 데 걸리는 시간( τ 50)으로 표시하였다.
제안 방법
10 µg/mL 농도를 기준으로 각각의 분획과 (+)-α-tocopherol의 τ 50을 비교하였다(Figure 3).
하지만 본 연구에서는 50 % 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획을 이용한 다양한 분획 조건에서 항산화 효능을 비교해 보았다. 70 % 에탄올보다 수상의 비율을 높인 50 % 에탄올 추출물과, 유효성분을 정제한 에틸아세테이트 분획을 비교하였고, 이를 통해 수상에 포함된 물질들이 항산화 효과에 미치는 영향을 확인하였다. 이에 더하여, 당을 제거시킨 아글리콘 분획과 에틸아세테이트 분획을 비교함으로써 유효물질 구조에서 당의 유무가 항산화 효과에 미치는 영향을 확인하였다.
DPPH는 상대적으로 안정한 자유라디칼이기 때문에 실험에 많이 응용되는 산화제이다. DPPH 소거 반응을 이용하여 생강나무 추출물에 대한 자유라디칼의 소거활성을 측정하였다.
대조군(control)은 시료를 넣지 않고 10 min 후에 흡광도를 측정하여 라디칼 소거가 이루어지지 않았을 때의 값을 측정하였다. 공시험(blank)으로 DPPH를 용매로 대체한 후 흡광도를 측정하여 517 nm에서 시료와 용매의 영향을 보정해주었다. 소거 활성은 DPPH의 농도가 50 % 감소되는 데 필요한 시료의 농도(free radical scavenging activity, FSC50, µg/mL)로서 표기하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20 W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사하였다. 광조사가 끝난 후 15 min 간격으로 700 nm에서 투광도(transmittance, %)를 측정하여 암반응(post-incubation)에 의한 적혈구의 파괴 정도를 확인하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도 증가는 적혈구의 용혈 정도에 비례한다.
반응시간이 지난 후 spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군(control)은 시료를 넣지 않고 10 min 후에 흡광도를 측정하여 라디칼 소거가 이루어지지 않았을 때의 값을 측정하였다. 공시험(blank)으로 DPPH를 용매로 대체한 후 흡광도를 측정하여 517 nm에서 시료와 용매의 영향을 보정해주었다.
이러한 이유로 타이로시네이즈의 저해활성은 미백활성을 측정하는 데 매우 중요한 요소이다. 본 연구에서 생강나무의 추출물 및 분획과 대표적인 미백제로 알려져있는 알부틴의 타이로시네이즈 저해활성을 비교해보았다(Figure 4). 데이터는 타이로시네이즈 활성을 50 % 저해하는 농도인 IC50 (inhibitory concentration)으로 나타내었다.
생강나무 추출물과 (+)-α-tocopherol으로 실험을 진행하였고, 결과 값은 적혈구 세포가 50 % 파괴되는 데 걸리는 시간( τ 50)으로 표시하였다.
생강나무 추출물의 세포 보호 효과는 post-incubation 시간과 용혈 정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50 %가 용혈되는 시간인 τ 50을 구하여 비교하였다.
아미노프탈산은 다시 바닥상태로 떨어지면서 발광(420 ∼ 450 nm)을 하기 때문에 이를 이용하여 ROS의 소거능을 측정하였다.
70 % 에탄올보다 수상의 비율을 높인 50 % 에탄올 추출물과, 유효성분을 정제한 에틸아세테이트 분획을 비교하였고, 이를 통해 수상에 포함된 물질들이 항산화 효과에 미치는 영향을 확인하였다. 이에 더하여, 당을 제거시킨 아글리콘 분획과 에틸아세테이트 분획을 비교함으로써 유효물질 구조에서 당의 유무가 항산화 효과에 미치는 영향을 확인하였다. 이와 같은 다양한 분획 조건을 이용하여 항산화 및 타이로시네이즈 저해 효과 실험을 진행하였다.
이와 같은 결과값들을 비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol (FSC50 = 8.98 ± 2.93 µg/mL)과 비교해 보았다.
이에 더하여, 당을 제거시킨 아글리콘 분획과 에틸아세테이트 분획을 비교함으로써 유효물질 구조에서 당의 유무가 항산화 효과에 미치는 영향을 확인하였다. 이와 같은 다양한 분획 조건을 이용하여 항산화 및 타이로시네이즈 저해 효과 실험을 진행하였다.
또한 기존의 생강나무 연구에서는 유효성분의 추출 효율을 높이기 위해서 주로 70 % 에텐올 추출물을 사용하여 단편적인 항산화 효과를 확인하였다. 하지만 본 연구에서는 50 % 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획을 이용한 다양한 분획 조건에서 항산화 효능을 비교해 보았다. 70 % 에탄올보다 수상의 비율을 높인 50 % 에탄올 추출물과, 유효성분을 정제한 에틸아세테이트 분획을 비교하였고, 이를 통해 수상에 포함된 물질들이 항산화 효과에 미치는 영향을 확인하였다.
대상 데이터
EDTA, 루미놀, 헤파린, 증감제로 사용된 rose-bengal, 자유라디칼 소거활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) 라디칼은 Sigma Chemical Co. (USA) 제품을 사용하였다. 기타 FeCl3․6H2O는 Junsei Chemical Co.
UV-visible spectrophotometer는 Varian (Australia)사의 Cary 50, 적혈구 광용혈에 사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품을 사용하였고, 화학발광기는 Berthold (Germany)사의 6-channel LB9505 LT를, pH 미터는 Istek (Korea)사 제품을 사용하였다.
건강한 성인 남녀로부터 채혈한 후 헤파린이 첨가된 시험관에 넣었다. 3,000 rpm으로 5 min 동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하였다.
공시험(blank)은 ROS를 생성시키는 주요 물질인 H2O2와 FeCl3·6H2O를 제외하고 나머지는 실험군과 동일한 조건으로 진행하였다.
완충용액 제조에 사용된 Na2HPO4·12H2O, NaH2PO4·2H2O, NaCl, H2SO4, 그리고 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트(EtOAc), n-헥산 등 각종 용매는 시판 특급 시약으로 사용하였다. 기질로 사용된 L-타이로신과 N-succinyl-(Ala)3-p-nitroanilide, 효소로 사용된 타이로시네이즈(11.9 mg solid, 4,276 units/mg solid)는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하여 사용하였다. 비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, 알부틴은 Sigma (USA)에서 구입하였다.
기타 FeCl3․6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical & Metals (Korea)사 제품을 사용하였다.
생강나무 추출물의 총 항산화능 실험 결과를 Figure 2에 나타내었다. 데이터는 ROS를 50 % 소거하는 농도인 OSC50 (Reactive oxygen species scavenging activities)로 나타내었다. 생강나무 50 % 에탄올 추출물의 OSC50은 0.
본 연구에서 생강나무의 추출물 및 분획과 대표적인 미백제로 알려져있는 알부틴의 타이로시네이즈 저해활성을 비교해보았다(Figure 4). 데이터는 타이로시네이즈 활성을 50 % 저해하는 농도인 IC50 (inhibitory concentration)으로 나타내었다.
비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, 알부틴은 Sigma (USA)에서 구입하였다.
실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 O.D.가 0.6 이었으며 이때 적혈구 수는 약 1.5 × 107 cells/mL이다.
비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid, 알부틴은 Sigma (USA)에서 구입하였다. 실험에 사용한 생강나무 재료는 2011년 6월 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
에틸아세테이트 분획에서 얻은 파우더 중 0.2 g을 산 가수분해 반응시켜 당이 제거된 아글리콘 파우더 얻고 실험에 사용하였다. 실험 방법은 에틸아세테이트 파우더를 H2SO4 및 아세톤 용액을 넣고, 70 ℃에서 4 h 동안 중탕 가열하면서 환류·냉각시킨다.
완충용액 제조에 사용된 Na2HPO4·12H2O, NaH2PO4·2H2O, NaCl, H2SO4, 그리고 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트(EtOAc), n-헥산 등 각종 용매는 시판 특급 시약으로 사용하였다.
이론/모형
피부에서도 Fenton 반응이 일어나 주변 조직에 손상을 가하기 때문에 다양한 ROS에 대한 항산화 능력을 측정하는 것은 큰 의미를 갖는다. 본 실험에서는 루미놀 발광법을 이용하여 여러 가지 ROS에 대한 총항산화능을 측정하였다. 루미놀은 Fe3+-EDTA/H2O2 계에서 생성된 ROS에 의해 산화되고 들뜬 상태의 아미노프탈산이 된다.
활성산소에 의한 세포손상 모델로 사람 적혈구와 광증감 반응을 사용하였다. 피부에 존재하는 여러 가지 광증감제에 자외선이 조사되면 광증감 반응이 일어나며 빠르게 1O2과 ROS들을 생성한다.
성능/효과
1) 생강나무 추출물의 자유라디칼 소거활성(FSC50) 측정 결과 에틸아세테이트 분획(5.55 µg/mL) > 아글리콘 분획(7.48 µg/mL) > (+)-α-tocopherol (8.98 µg/mL) > 50 % 에탄올 추출물(15.46 µg/mL) 순서로 나타났다.
2) 생강나무 추출물의 활성산소 소거활성(총항산화능, OSC50)은 에틸아세테이트 분획(0.32 µg/mL) > 아글리콘 분획(0.37 µg/mL) > L-ascorbic acid (0.41 µg/mL) > 50 % 에탄올 추출물(0.52 µg/mL) 순서로 나타났다. 하지만 세 분획 모두 L-ascorbic acid보다 유의할 만큼 높은 총항산화능을 보이진 못하였다.
25 µg/mL보다 더 높은 농도인 50 µg/mL에서의 τ 50을 확인해 본 결과 22.9 ± 0.8 min으로 대조군보다 더 빨리 세포가 파괴되는 것을 확인하였다.
3) 생강나무 추출물의 1O2으로 유도된 적혈구 파괴에 대한 세포보호 효과 실험에서 50 % 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획은 농도 의존적으로 증가하였다. 하지만 아글리콘 분획은 10 µg/mL 이상의 농도에서 점점 세포보호 효과가 감소하는 것으로 보아 고농도에서 세포 독성을 갖는 것으로 보인다.
4) 생강나무 추출물의 타이로시네이즈 저해활성(IC50)은 에틸아세테이트 분획(147.9 µg/mL) > 아글리콘 분획(172.1 µg/mL) > 50 % 에탄올 추출물(297.0 µg/mL) 순서로 확인되었다. 이 중 에틸아세테이트 분획과 아글리콘 분획은 기준물질인 알부틴(226.
50 % 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획은 비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol ( τ 50 = 38.0 ± 1.8 min)보다 각각 약 3.3배, 9.5배, 4.1배 높은 세포보호 효과를 나타내었다.
50 % 에탄올 추출물은 (+)-α-tocopherol보다는 낮았지만 상당한 라디칼 소거 효과를 보여주었다.
이렇게 얻어진 50 % 에탄올 추출물 파우더의 절반은, 물과 헥산을 이용한 분액과정을 거쳐 비극성 성분을 제거하고 이후 에틸아세테이트 분획을 감압·농축하여 파우더를 얻었다. 50 % 에탄올 추출물의 건조 중량당 에틸아세테이트 분획의 수율은 10.95 %로 확인되었다. 50 % 에탄올 추출물과 에틸아세테이트 분획을 얻는 과정은 모두 20 ~ 40 ℃ 온도 조건에서 진행하였다.
따라서 에틸아세테이트와 아글리콘 분획은 (+)-α-tocopherol보다 높은 라디칼 소거 활성을 갖는 것으로 확인되었다.
모든 경우의 실험에서 대조군은 τ 50이 30 min으로 오차범위 ± 1 min 이내로 재현성이 양호하게 나타났다.
아글리콘 분획은 (+)-α-tocopherol과 비슷한 정도의 높은 라디칼 소거능을 가진 것으로 확인하였다.
위의 결과를 통해 (+)-α-tocopherol을 대체하는 라디칼 소거제로서 생강나무의 에틸아세테이트 분획이 사용될 수 있음을 확인하였다.
이상의 결과들로부터 생강나무 추출물의 항산화 효과 미백 효과를 확인하였다. 진행된 모든 실험에서 에틸아세테이트 분획이 가장 높은 활성을 나타내었다.
14 µg/mL로 확인하였다. 이와 같은 결과를 통해 실험에 사용한 생강나무의 추출물과 분획 모두 L-ascorbic acid와 유사한 높은 ROS 소거 능력을 갖는 것으로 확인하였다.
이상의 결과들로부터 생강나무 추출물의 항산화 효과 미백 효과를 확인하였다. 진행된 모든 실험에서 에틸아세테이트 분획이 가장 높은 활성을 나타내었다. 따라서 생강나무의 에틸아세테이트 분획은 뛰어난 항산화 효과 및 높은 타이로시네이즈 저해 활성을 갖는 화장품원료로서 응용 가능성이 있음을 보고한다.
후속연구
3배 높은 타이로시네이즈 저해활성을 나타내었다. 따라서 생강나무의 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획은 미백 기능성 원료로서 화장품에 응용될 가능성이 있다고 보여진다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
피부가 노화하는 데 가장 큰 영향을 미치는 요인은 무엇인가?
최근 기능성 화장품 산업에서 연구가 가장 활발하게 진행되고 있는 분야는 노화 방지와 미백 효능이라 할 수 있다. 피부가 노화하는 데 가장 큰 영향을 미치는 요인으로는 자외선을 꼽을 수 있다[1]. 광 노화에 대한 여러 이론들 중 가장 유력한 이론은 자유 라디칼 설이다.
최근 기능성 화장품 산업에서 연구가 가장 활발하게 진행되고 있는 분야는 무엇인가?
최근 기능성 화장품 산업에서 연구가 가장 활발하게 진행되고 있는 분야는 노화 방지와 미백 효능이라 할 수 있다. 피부가 노화하는 데 가장 큰 영향을 미치는 요인으로는 자외선을 꼽을 수 있다[1].
활성산소종이란 무엇인가?
ROS란 높은 산화력을 갖는 산소 종으로 superoxide anion radical (O2⦁-), hydrogen peroxide (H2O2), singlet oxygen (1O2), hydroxyl radical ( ⦁ OH) 등과 이들이 불포화 지방산과 반응하면서 생성되는 peroxyl radical (ROO ⦁ ), alkoxyl radical (RO ⦁ ), hydroperoxide (ROOH)등이 포함된다[9,10]. ROS는 강력한 반응성으로 세포막을 이루고 있는 인지질을 산화시켜 세포를 파괴할뿐만 아니라, MMPs의 발현을 촉진시켜 콜라겐, 엘라스틴 섬유를 분해시킨다.
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