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문제 정의
- 본 실험에서는 생강나무 추출물의 항산화 효과를 알아보기 위해 DPPH를 이용하여 항산화 효과를 측정하였다. 생강나무 추출물과 대표적인 항산화제 물질인 ascorbic acid (이하 AA로 표기)의 free radical 소거 활성을 측정한 결과는 Table 1과 같다.
- 본 연구는 생강나무 추출물이 피부 주름 형성에 미치는 효능을 검증해 보고자 실시 되었다. 생강나무를 열수 추출하여 항산화 및 콜라게네이즈 효소 억제의 효과를 측정한 결과 라디컬 소거능의 IC50은 30 μg/mL, 콜라게네이즈 효소의 억제 IC50은 0.
제안 방법
- 10주 동안 자외선 조사를 실시한 무모쥐의 피부를 실리콘 고무로 모사판을 제작하여 주름의 형성정도를 측정하였다. 무모쥐의 등 부분에 지름이 1 cm가 되는 원모양의 구멍이 있는 디스크를 부착하고 모사판 제작용 시약을 혼합하여 무모쥐의 등부분에 얇게 펴 바르고 완전히 말린 다음 디스크를 조심스럽게 떼어내어 모사판을 제작하였다.
- Ultraviolet B (UVB)는 주 3회 무모쥐의 등 부분에 조사하였으며 자외선 조사량은 처음 1주간은 30 mJ/cm2, 2주는 60 mJ/cm2, 3주는 90 mJ/cm2, 4주는 120 mJ/cm2, 5주부터 10주까지는 150 mJ/cm2 로 10주 동안 조사 하였다.
- 대조군은 기본 도포액을, 실험군은 도포액에 생강나무 추출물 5 %를 녹여 조제한 후 60 μL씩 10주 동안 매일 1회씩 무모쥐의 등 부위에 도포하였다.
- 도포액의 구성은 에탄올, 프로필렌글리콜과 증류수를 각각 30 : 50 : 20의 비율로 혼합하여 조제하였다. 대조군은 기본 도포액을, 실험군은 도포액에 생강나무 추출물 5 %를 녹여 조제한 후 60 μL씩 10주 동안 매일 1회씩 무모쥐의 등 부위에 도포하였다.
- 10주 동안 자외선 조사를 실시한 무모쥐의 피부를 실리콘 고무로 모사판을 제작하여 주름의 형성정도를 측정하였다. 무모쥐의 등 부분에 지름이 1 cm가 되는 원모양의 구멍이 있는 디스크를 부착하고 모사판 제작용 시약을 혼합하여 무모쥐의 등부분에 얇게 펴 바르고 완전히 말린 다음 디스크를 조심스럽게 떼어내어 모사판을 제작하였다. 모사판 제작의 온도는 20 ∼ 23 ℃, 습도 45 ∼ 50 %의 항온 항습 상태에서 실시하였으며 모사판 제작용 실리판 고무 인상재(Heraeus kulzer, Germany)를 사용하였다.
- 배양기에서 배양하였다. 배양액을 가지고 procollagen Type I Cpeptide EIA kit (Takara bio, Japan)를 이용하여 콜라겐 양을 측정하였다. 콜라겐 측정키트에 포함된 표준용액을 희석한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 표준농도 곡선을 작성하고 콜라겐 생성량을 산정하였다.
- 43 ℃에서 1 h 동안 반응시킨 후 반응이 완료되면 3000 rpm에서 10 min 동안 원심분리시켜 분해되지 않은 콜라겐은 침전시킨다. 분해된 콜라겐을 함유하는 상등액을 취하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며 대조군으로서 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가하여 흡광도를 측정하였다. 시료자체의 값도 측정하여 효소 활성 계산시 보정하였다.
- 생강나무 추출물의 도포가 피부주름의 형성정도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 무모쥐에 10주 동안 UVB를 조사한 뒤 UV 대조군과 생강나무 추출물 도포군의 주름 생성 억제 효능을 비교하였다. 그 결과 Figure 3과 같이 UV 대조군은 정상군에 비해 굵고 깊게 패인 주름과 함께 잔주름이 형성된 것을 관찰할 수 있었으며, 같은 세기의 UV가 조사 되었음에도 불구하고 생강나무 추출물 도포군은 UV 대조군에 비해 주름의 굵기와 깊이가 개선된 것을 확인하였다.
- 섬유아세포에서 생강나무 추출물의 처리가 세포증식에 미치는 영향을 확인하기 위하여 MTT assay를 이용한 세포생존율을 측정하였다. Figure 1에서 생강나무 추출물 처리군은 세포생존율이 133.
- 분해된 콜라겐을 함유하는 상등액을 취하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였으며 대조군으로서 효소액 대신 반응완충액을 효소와 동량 첨가하여 흡광도를 측정하였다. 시료자체의 값도 측정하여 효소 활성 계산시 보정하였다.
- 실험동물은 습도 50 %, 온도 22 ± 1 ℃로 유지되는 동물실험실에서 사육하였으며 물과 식이를 자유롭게 섭취할 수 있도록 공급하였다.
- 이러한 UV에 의한 주름 형성의 결과가 직접적으로 콜라겐 섬유의 함량에도 영향을 미치는지 관찰하기 위하여 무모쥐의 등조직을 적출하여 진피층의 콜라겐 섬유 부위를 masson's trichrome staining 방법으로 염색하여 관찰하였다.
- 세포외 기질로 분비된 procollagen은 세포표면에 존재하는 procollagen peptidase에 의해 C-peptide가 분해되고 활성 collagen으로 형성된다[19]. 이러한 원리를 이용하여 콜라겐 생성량의 변화를 확인하기 위해 사람 섬유아세포에 약물을 처리하여 C-peptide의 함량을 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. Figure 2에서와 같이 대조군의 콜라겐 생성량을 100%로 볼 때 AA 처리군은 대조군에 비해 144.
- 콜라겐 생합성능을 알아보기 위하여 사람 섬유아세포를 96 well-plate에 1 × 104 cells/well 씩 분주하여 10 % FBS/DMEM 배지로 24 h 동안 배양시킨 다음, 새로운 serum-free 배지와 희석하여 생강나무 추출물을 200 μg/mL의 농도로 첨가하여, 다시 48 h 동안 CO2 배양기에서 배양하였다.
- 배양액을 가지고 procollagen Type I Cpeptide EIA kit (Takara bio, Japan)를 이용하여 콜라겐 양을 측정하였다. 콜라겐 측정키트에 포함된 표준용액을 희석한 후 450 nm에서 흡광도를 측정하여 표준농도 곡선을 작성하고 콜라겐 생성량을 산정하였다.
대상 데이터
- 6주령의 암컷 무모쥐(female SKH hairless mice)를 대한바이오링크(한국)로부터 구입하여 2주 동안 적응시킨 후 사용하였다. 실험동물은 습도 50 %, 온도 22 ± 1 ℃로 유지되는 동물실험실에서 사육하였으며 물과 식이를 자유롭게 섭취할 수 있도록 공급하였다.
- CCD-986sk 사람의 섬유아세포를 한국세포주은행으로 부터 분양받아 배양하고 1 × 104 cells/well씩 96 well plate에 분주한 후 생강나무 추출물을 200 μg/mL 처리하여 CO2 배양기에서 48 h 동안 배양하였다.
- 모사판 제작의 온도는 20 ∼ 23 ℃, 습도 45 ∼ 50 %의 항온 항습 상태에서 실시하였으며 모사판 제작용 실리판 고무 인상재(Heraeus kulzer, Germany)를 사용하였다.
- 실험동물은 습도 50 %, 온도 22 ± 1 ℃로 유지되는 동물실험실에서 사육하였으며 물과 식이를 자유롭게 섭취할 수 있도록 공급하였다. 사료는 샘타코(한국)에서 판매하는 NIH#31 M를 공급하였다. 또한 본 실험은 IACUC 위원회의 동물실험허가 승인(승인번호:JS-2009-05)을 받고 진행하였다.
- 실험에 사용된 생강나무는 경동시장(서울)에서 국내산을 구입하였다. 생강나무 200 g에 물 2 L를 넣어 100 ℃에서 약탕기(COSMOS-660, Kyungseo, Korea)로 3 h 동안 추출하였다.
데이터처리
- 통계처리는 Student's t-test로 검정하였고 당뇨 대조군과 비교하여 P < 0.05 이하의 경우 유의적인 차이가 있다고 판정하였다.
성능/효과
- 이러한 원리를 이용하여 콜라겐 생성량의 변화를 확인하기 위해 사람 섬유아세포에 약물을 처리하여 C-peptide의 함량을 ELISA kit를 이용하여 측정하였다. Figure 2에서와 같이 대조군의 콜라겐 생성량을 100%로 볼 때 AA 처리군은 대조군에 비해 144.5 %의 콜라겐 생성 증가율을 보였으며 생강나무 추출물 처리군은 대조군에 비해 191.8 %의 증가율로 유의적인 콜라겐 생성을 나타내어 AA처리군 보다 콜라겐 생성 촉진 효과가 더 큰 것으로 나타났다. 생강나무 추출물의 콜라겐 합성 촉진 작용은 Table 1의 항산화 효과 및 콜라게네이즈 억제 효과와 관련해 볼 때 AA에 비해 생강나무 추출물의 항산화 활성은 낮으나 콜라겐 분해효소의 억제 효과가 높은 것으로 나타나 free radical 생성억제 효과보다는 콜라게네이즈(MMPs)의 발현을 억제하는 작용이 콜라겐 생성 촉진 효과에 간접적인 영향을 주었을 것으로 사료된다.
- 그에 비해 UV 대조군은 조직의 맨 윗부분에서 굵은 각질층을 형성하고 그 아래 광범위하게 표피층이 분포하고 있으며 콜라겐이 포함되어 있는 진피층에서 염색된 콜라겐 섬유는 거의 관찰되지 않았다. UV 대조군과의 비교 결과 생강나무 추출물을 도포한 그룹에서는 UV 조사에 의한 표피층의 증가는 감소하였고, 특히 생강나무 추출물 도포군에서는 염색된 콜라겐 섬유가 증가되었음이 관찰되었다. 이는 생강나무 추출물의 도포가 UV에 의해 파괴되는 진피층의 콜라겐 섬유를 보호하는 작용이 있으며 이로 인해 Figure 3과 같이 주름의 형성을 억제 시켜주는 것으로 사료된다.
- 생강나무 추출물의 도포가 피부주름의 형성정도에 미치는 영향을 알아보기 위하여 무모쥐에 10주 동안 UVB를 조사한 뒤 UV 대조군과 생강나무 추출물 도포군의 주름 생성 억제 효능을 비교하였다. 그 결과 Figure 3과 같이 UV 대조군은 정상군에 비해 굵고 깊게 패인 주름과 함께 잔주름이 형성된 것을 관찰할 수 있었으며, 같은 세기의 UV가 조사 되었음에도 불구하고 생강나무 추출물 도포군은 UV 대조군에 비해 주름의 굵기와 깊이가 개선된 것을 확인하였다.
- 17 mg/mL 보다 더 뛰어난 collagenase 효소 활성 억제능을 보였다. 그러므로 위와 같은 결과는 생강나무 추출물이 피부주름에 영향을 미치는 2가지 요인인 활성산소 및 콜라게네이즈의 활성을 억제하는 효과가 있음을 증명하였다.
- 두 가지 물질 모두 라디칼 소거 활성능을 보였으며 AA는 3 μg/mL, 생강나무 추출물은 30 μg/mL의 농도에서 50 %의 radical 소거 활성능을 보이는 것을 확인하였다.
- 8 % 증가시키는 것으로 나타났다. 또한 이러한 결과들이 실제적인 주름형성에 미치는 영향을 알아보고자 무모쥐에 지속적인 UVB를 조사하여 피부조직에서 주름을 유발시키고 5 % 생강나무 추출액이 포함된 도포액을 매일 도포하여 그 결과를 확인하였다. 조직 모사판 제작의 결과 생강나무 추출액은 UV대조군에 비해 주름의 굵기와 깊이가 현저히 완화된 것으로 관찰되었으며, masson's trichrome 염색으로 피부 콜라겐 섬유를 염색한 결과 자외선이 조사된 대조군의 피하조직에 비해 생강나무 추출물군은 조직의 밀도가 높고 콜라겐 섬유가 대조군보다 많이 존재하는 것으로 나타났다.
- 본 연구에서 생강나무 추출물의 항산화, 콜라겐 합성 및 콜라게네이즈 억제 활성을 확인하였으며 자외선으로 주름을 유발시킨 무모쥐에 도포하여 광노화에 의한 주름 형성 억제 효능이 있음을 확인하였다.
- 또한 생강나무 추출물의 collagenase 효소 활성 억제능을 측정한 결과는 Table 1과 같다. 생강나무 추출물과 AA 모두 collagenase 효소 활성 억제능을 보였으며 생강나무는 IC50 농도 값이 0.56 mg/mL로 AA의 IC50 농도값인 2.17 mg/mL 보다 더 뛰어난 collagenase 효소 활성 억제능을 보였다. 그러므로 위와 같은 결과는 생강나무 추출물이 피부주름에 영향을 미치는 2가지 요인인 활성산소 및 콜라게네이즈의 활성을 억제하는 효과가 있음을 증명하였다.
- 8 %의 증가율로 유의적인 콜라겐 생성을 나타내어 AA처리군 보다 콜라겐 생성 촉진 효과가 더 큰 것으로 나타났다. 생강나무 추출물의 콜라겐 합성 촉진 작용은 Table 1의 항산화 효과 및 콜라게네이즈 억제 효과와 관련해 볼 때 AA에 비해 생강나무 추출물의 항산화 활성은 낮으나 콜라겐 분해효소의 억제 효과가 높은 것으로 나타나 free radical 생성억제 효과보다는 콜라게네이즈(MMPs)의 발현을 억제하는 작용이 콜라겐 생성 촉진 효과에 간접적인 영향을 주었을 것으로 사료된다.
- 생강나무를 열수 추출하여 항산화 및 콜라게네이즈 효소 억제의 효과를 측정한 결과 라디컬 소거능의 IC50은 30 μg/mL, 콜라게네이즈 효소의 억제 IC50은 0.56 mg/mL의 농도로 나타났으며, CCD-986sk 사람섬유아세포에서 콜라겐 생성을 유의적으로 91.8 % 증가시키는 것으로 나타났다.
- 또한 이러한 결과들이 실제적인 주름형성에 미치는 영향을 알아보고자 무모쥐에 지속적인 UVB를 조사하여 피부조직에서 주름을 유발시키고 5 % 생강나무 추출액이 포함된 도포액을 매일 도포하여 그 결과를 확인하였다. 조직 모사판 제작의 결과 생강나무 추출액은 UV대조군에 비해 주름의 굵기와 깊이가 현저히 완화된 것으로 관찰되었으며, masson's trichrome 염색으로 피부 콜라겐 섬유를 염색한 결과 자외선이 조사된 대조군의 피하조직에 비해 생강나무 추출물군은 조직의 밀도가 높고 콜라겐 섬유가 대조군보다 많이 존재하는 것으로 나타났다. 생강나무 추출물은 피하조직의 콜라겐 섬유의 분해를 저해함으로써 외형적으로 주름형성을 완화한 것으로 사료된다.
후속연구
- 생강나무 추출물은 피하조직의 콜라겐 섬유의 분해를 저해함으로써 외형적으로 주름형성을 완화한 것으로 사료된다. 이러한 결과는 생강나무 추출물이 자외선에 의한 피부주름을 예방하거나 완화 할 수 있는 효과가 있다는 것으로 향후 기능성화장품의 소재로 활용될 수 있을 것으로 사료된다.
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