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문제 정의
- mutans의 다당류는 치아우식증에 관여하는 치면세균막을 형성하는데 가장 중요한 역할을 하는 다당류이다. 따라서 본 연구에서는 황금 IPK-3 추출물 50mg/ml의농도로 S. mutans의 배양액 투여하였을 때 다당류 생성을 어느 정도 억제하는지 확인하기 위하여 액체배지에서시간별 다당류의 양적 변화를 알아 본 결과 Fig. 6과 같다. 대조군에서는 배양 18시간에 500mg/100ml의 다당류를 얻었으나, 황금 추출물이 투여된 배지에서는 280mg/100ml의 다당류가 수확되었다.
- 그리고 Lee 등17)은 황금 추출물이 Staphy- lococcus aureus와 Bacillus cereus에 대해, Choi 등18)은 Pseudomonas aeruginosa에 대해 항균력이 있다고 보고하였다. 본 연구에서는 안전성이 우수한 한약재인 황금을이용하여 구강 내 질병의 원인균에 대한 항균활성능력 및최소억제농도(minimal inhibitory concentration, MIC)를 측정하고, 황금추출물이 S. mutans의 생장에 미치는 영향과 hydroxyapatite beads에 대한 부착 억제 효과를 통해 치아표면에 치아우식원인균의 부착억제 가능성을 확인하였다.
제안 방법
- 정치시킨 e-tube에서 배지를 제거하고PBS로 1회 세척한 후, 상징액을 버리고 세척한 S-HA에 DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole, Sigma, USA)를 첨가하여 37oC에서 1시간동안 염색시켰다. 1시간동안 염색시킨 S-HA는 PBS로 1회 세척하고 20µl를 채취하여 fluorescence microscope (Olympus DP71, Japan) 상에서 관찰하였다.
- 여과된 methanol 추출물은 회전 감압농축기(Rotavapor, Büchi RE-111, Switzerland)를 사용해 80oC 항온수조 (Oilbath, Büchi B-485, Switzerland)에서 감압 농축시켰다. Methanol 추출물 (IPK-6)을 약 40ml까지 농축한 후 분액깔때기를 이용해 hexane (IPK-1), chloroform (IPK- 2), ethyl acetate (IPK-3), n-butanol (IPK-4), 물 (IPK-5) 순으로 용매 첨가 후 분리하여 시료를 얻었다. 농축된 추출물들은 냉장보관하면서 시료로 사용하였다.
- S. mutans 균의 hydroxyapatite adhesion assay는 Gaines19)의 assay를 응용하여 실험하였다. 우선 타액은 건강한 성인에게서 채취하여 냉각된 conical tube에 채취한 후, 4oC에서 15,000rpm으로 20분간 원심분리(Mega 17R, Hanil, Korea)하였다.
- disc 방법을 사용하였다. 간략하면 보관된 S. mutans 균주를 BHI 배지에 접종하여 15~18시간 활성화시켜 항균성 실험용 MHA agar 배지에 균주 50㎕ 씩 도말하였다. 도말된 배지에 멸균된 filter paper disc (8mm : 1.
- 45 (4 x 106cells/ml)로 맞추어 underlay 배지 10 ml에 균 45㎕ 씩 분주하여 혼합한 후, square petri dish (Falcon, USA) 에 분주하여 15분간 실온에서 방치하였다. 건조된 배지에 0.4 mm 직경의 구멍을 뚫고 준비된 황금 IPK-3 추출물을분주하였다. 최초 농도를 1000 mg/ml로 하여 다음 농도가 초기 농도의 1/2이 되도록 연속적으로 17번째까지 희석하였다.
- 9는 Hydroxyapatite (Sigma, USA) 제품을 사용하여 관찰한 결과이다. 균이 S-HA에 부착되는 순간부터 부착된 이후까지의 결과를 보기 위해 0시간, 90분, 12시간, 24시간에 S-HA를 채취하고 DAPI 로 염색하여 관찰하였다. 황금 IPK-3 추출물이 첨가된 S-HA에 대한 S.
- mutans 균주를 BHI 배지에 접종하여 15~18시간 활성화시켜 항균성 실험용 MHA agar 배지에 균주 50㎕ 씩 도말하였다. 도말된 배지에 멸균된 filter paper disc (8mm : 1.5mm, Toyo Roshi Kaisha, Ltd., Japan)를 밀착시킨 후, 황금 추출물을 농도별 적용하였다. 황금 추출물을 초기 농도의 1/2이 되도록 연속적으로 4회 희석하여 최종 1000mg/ml, 500mg/ml, 250mg/ml, 125mg/ml 농도가 되도록 조제하였으며, disc당 50㎕씩 흡수시켰다.
- 있다. 따라서 황금의 추출물을 BHI 액체배지에 넣고 균체를 성장시켰을 때, 배지 내 단백질 변화를 확인함으로써 세균의 활성을 확인하였다. 황금 IPK-3 추출물이 첨가된 배지에 S.
- 통해 최소억제농도 (MIC)를 측정하였다. 모든 균주를 tryptic soy borth (TSB, Bacto, USA)에 전 배양하여 활성화 시킨 후, 37oC CO incubator에서 18~24시간 배양하였으며 본 실험에서는 tryptic soy agar를 사용하여 실험하였다. 실험법을 간략하면, 균의 O.
- mutans를 37oC CO incubator(5% CO )에서 18~24시간 동안 배양시켰다. 배양 후에는 disc 주변에생성된 inhibition zone diameter (mm)의 크기를 vernier caliper (Mitutoyo Co., Japan)로 측정하여 각 추출물의 항균 활성 정도를 측정하였다.
- 최초 농도를 1000 mg/ml로 하여 다음 농도가 초기 농도의 1/2이 되도록 연속적으로 17번째까지 희석하였다. 분주한 후, 37oC CO incubator (5% CO )에서18~24시간 동안 배양하였으며 MIC 측정은 육안으로 관찰된 생육저지대의 농도로 결정하였다.
- 모든 균주를 tryptic soy borth (TSB, Bacto, USA)에 전 배양하여 활성화 시킨 후, 37oC CO incubator에서 18~24시간 배양하였으며 본 실험에서는 tryptic soy agar를 사용하여 실험하였다. 실험법을 간략하면, 균의 O.D. 값을 0.45 (4 x 106cells/ml)로 맞추어 underlay 배지 10 ml에 균 45㎕ 씩 분주하여 혼합한 후, square petri dish (Falcon, USA) 에 분주하여 15분간 실온에서 방치하였다. 건조된 배지에 0.
- mutans 균의 hydroxyapatite adhesion assay는 Gaines19)의 assay를 응용하여 실험하였다. 우선 타액은 건강한 성인에게서 채취하여 냉각된 conical tube에 채취한 후, 4oC에서 15,000rpm으로 20분간 원심분리(Mega 17R, Hanil, Korea)하였다. 원심 분리된 타액의 상징액을 취하여 60oC에서 30분간 가온하여 효소를 불활성화 시킨 후 - 20oC에 보관하여 실험에 사용하였다.
- )을 이용하여 측정하였으며, 또한 glucan 생성 효과도알아보았다. 이때 대조군은 IPK-3 추출물이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 측정하였다.
- cells/ml이 되도록 접종하였다. 접종 후 37oC CO incubator (5% CO )에서 18~24시간 동안 배양하였으며 대조군은 BHI 액체배지를 blank로 하고 실험군은 IPK-3를 첨가한 BHI 액체배지를 blank로 하여 Multi functional microplate reader (BMG Labtech, Germany)를이용해 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한 pH 변화는 IPK-3 추출물을 50mg/ml로 첨가하고 pH 변화를 6시간 마다 측정하였다.
- 천연물 황금으로부터 여러 유기용매 추출물을 얻어 치아우식증 원인균인 S. mutans 에 대한 항균활성, 배지 내 환경변화, 그리고 부착억제에 대해 알아보았다.
- 황금 IPK-3 추출물을 S. mutans에 첨가한 후 배지 내의탄수화물량의 변화를 알아보기 위해 6시간 별로 측정하였다. 초기 배지의 총 탄수화물량은 ml당 0.
- 황금 유기용매 분획추출물이 균주에 가지는 항균 활성 능력을 보기 위하여 MHA 배지에 균을 도말하고 paper disc에 추출물을 1,000 mg/ml, 100 mg/ml, 10 mg/ml 농도별로 첨가해 37oC CO incubator (5% CO )에서 배양하여 생육 억제대를 관찰하였다. 실험 결과는 Table 2와같이 S.
- , Japan)를 밀착시킨 후, 황금 추출물을 농도별 적용하였다. 황금 추출물을 초기 농도의 1/2이 되도록 연속적으로 4회 희석하여 최종 1000mg/ml, 500mg/ml, 250mg/ml, 125mg/ml 농도가 되도록 조제하였으며, disc당 50㎕씩 흡수시켰다. Disc에 추출물을 흡수시킨 배지는 실온에서 10분간 방치시켜 건조시킨 후, S.
대상 데이터
- S-HA 부착 억제에 대한 실험에는 Macro-prep ceramic hydroxyapatite type II 80 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), Fluka crude hydroxylapatite (Fluka cat. No. 21223), Hydroxyapatite (Sigma, USA) 등 3개 제조사의 hydroxyapatite beads를 사용하였다. 황금 ethyl acetate 추출물이 S-HA에 대한 S.
- 본 연구에 사용한 충치균은 Streptococcus mutans ATCC 25175 균주로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC)에서 분양 받아 사용하였다. 세균의 증식은 brain heart infusion (BHI, Difco, USA)에서 1~2차 계대배양후 같은 배지에 식균하여 37oC CO incubator (5% CO )(Thermo electron corporation, USA)에서 배양하였다.
- 한약재인 황금은 서울 경동시장에서 건조 상태의 것을구입하여 사용하였으며, 여러 유기용매를 활용하여 추출하였다. 구입한 황금을 분쇄한 후, 3배량의 methanol을 첨가하여 72시간 냉침 시켰으며 methanol 추출물을 aspirator (EYELA, A-3S, Tokyo Rikakikai Co.
- 세균의 증식은 brain heart infusion (BHI, Difco, USA)에서 1~2차 계대배양후 같은 배지에 식균하여 37oC CO incubator (5% CO )(Thermo electron corporation, USA)에서 배양하였다. 항균 활성용 배지는 Müeller hinton agar (MHA, Difco, USA)를 사용하였다.
이론/모형
- Paper disc method로 1차 항균 활성을 검색하고 선별한 황금 ethyl acetate 추출물(IPK-3)은 radial diffusion assay 를 통해 최소억제농도 (MIC)를 측정하였다. 모든 균주를 tryptic soy borth (TSB, Bacto, USA)에 전 배양하여 활성화 시킨 후, 37oC CO incubator에서 18~24시간 배양하였으며 본 실험에서는 tryptic soy agar를 사용하여 실험하였다.
- Paper disc 방법에서 높은 항균활성을 나타낸 황금 IPK-3 추출물을 병원성 미생물에 대한 최소억제농도를 측정하기 위하여 radial diffusion assay로 실험하였다. S.
- 또한 pH 변화는 IPK-3 추출물을 50mg/ml로 첨가하고 pH 변화를 6시간 마다 측정하였다. 배지내 총당량은 phenol-sulfuric method, 총 단백질량은 BCA protein assay kit(Pierce Co.)을 이용하여 측정하였으며, 또한 glucan 생성 효과도알아보았다. 이때 대조군은 IPK-3 추출물이 첨가되지 않은 배지를 이용하여 측정하였다.
- 황금 유기용매 분획 추출물의 1차 항균활성 검색은 paper disc 방법을 사용하였다. 간략하면 보관된 S.
성능/효과
- 1. 구강 질병인 치아우식증의 대표적 원인균 S. mutans 에 대한 황금 ethyl acetate 추출물 (IPK-3)의 최소억제농도는 125mg/ml 이었다.
- 2. 황금 IPK-3 추출물 50mg/ml의 농도로 S. mutans의배지 내 투여하였을 때 균의 생장 량과 최대 생장시간은 대조군보다 지연되었다.
- 3. 황금 IPK-3 추출물 50mg/ml의 농도로 S. mutans의배지 내 투여하였을 때, pH 변화는 대조군은 18시간에서 pH 5.63으로 급격한 변화를 보였으며 황금 IPK-3 추출물이 50mg/ml의 배지에서는 6.50이상을유지하여 pH가 변화가 없었다.
- 4. 황금 IPK-3 추출물을 첨가한 배지 내 탄수화물, 단백질 및 균체 외 다당류의 변화는 대조군에 비해 매우낮게 생산되었다.
- 5. 균체를 형광염료(DAPI)로 염색하여 S-HA 부착억제을 확인한 결과, 대조군은 시간이 경과함에 따라 S. mutans의 hydroxyapatite(HA)에 부착 정도가 증가되었으나, 황금 IPK-3 추출물이 첨가된 시험군에서는 S-HA에 균의 부착이 매우 적었다.
- 2 와 같다. 대조군이 배양 24시간 후에 흡광도 1.17로 최대의 성장을 보였으며 황금 IPK-3 추출물 50mg/ml를 투여한 배지에서는 생장이 지연되어 30시간에 흡광도가 0.49 로 최대 성장을 나타냈다. 이 결과를 통해 황금 IPK-3 추출물은 치아우식증 원인균인 S.
- 5로 감소하였으나 그후 시간에는 더 이상 저하되지 않았다. 따라서 황금 IPK-3 추출물은 S. mutans균의 생장을 억제하여 pH 변화는 거의 이루어지지 않았다.
- 49 로 최대 성장을 나타냈다. 이 결과를 통해 황금 IPK-3 추출물은 치아우식증 원인균인 S. mutans의 생장을 억제하고 최대 생장 시점을 지연시키는 효과가 있었다.
- 이같이 황금의 IPK-3 (ethyl acetate 추출물)이 치아우식증의 원인균인 S. mutans 에 대한 항균활성효과 뿐만아니라 hydroxyapatite에 부착 억제 효과도 있었다.
- mutans의 균체외 다당류는 glucan성다당류인 것으로 보고된바 있다. 이상의 결과로 황금 추출물은 치면세균막 형성에 중요하게 작용하는 S. mutans의 다당류 생성을 억제할 것으로 여겨지며 이들추출물의 활용은 새로운 항 우식물질의 요구에 적절히대응 할 수 있는 천연물 소재로써 의미가 있는 것으로사료된다.
- mutans에 첨가한 후 배지 내의탄수화물량의 변화를 알아보기 위해 6시간 별로 측정하였다. 초기 배지의 총 탄수화물량은 ml당 0.56 mg의 탄수화물이 정량되었으며 18시간이 지난 후 대조군은 0.24mg/ ml로 떨어졌으나 50mg의 농도가 첨가된 황금 IPK-3 추출물이 투여된 배지는 0.5mg/ml을 유지하였으며 24시간이 지난 후 탄수화물의 양이 점차 감소하는 것을 확인할수 있었다(Fig. 4).
- 39% 순으로 추출물 수율을 얻었다. 추출 최종단계인 물 추출물 (IPK-5)은 가장 높은 수율인 4.45% 로 나타났다.
- mutans균은 1,000mg/ml의 농도에서 항균활성을나타냈으나 butanol (IPK-4)과 물 추출물(IPK-5)에서는항균 활성을 나타내지 않았다. 특히, IPK-3 추출물은 다른 유기용매 추출물과 비교 할 때 항균활성이 가장 크게나타났으며, 그 다음으로 IPK-2 추출물이 모든 균주에 대해 약간의 항균활성을 보였다. 100mg/ml의 농도에서 IPK-3 추출물에서만 생육 억제저지대가 관찰되었다.
- 황금을 hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol 의유기용매로 분획 추출한 결과, Table 1과 같이 butanol 추출물 (IPK-4)은 4.15%, ethyl acetate 추출물 (IPK-3) 1.19%, hexane 추출물 (IPK-1) 0.65%, chloroform 추출물 (IPK-2) 0.39% 순으로 추출물 수율을 얻었다. 추출 최종단계인 물 추출물 (IPK-5)은 가장 높은 수율인 4.
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