[논문]다래(Actinidia arguta) 열매의 열수 추출물, PG102의 4주 반복 경구투여에 대한 안전성 연구

홍은실; 김미정; 권은정; 김리홍; 김동현; 어해관; 박은진; 김선영; 김선희

문제 정의

다래는 한국 식품의약품 안전청에 식품가원료로 등재되어 있으며, 일반 식품뿐 아니라 한의학 처방으로도 오랜 기간 이용되어 왔다. PG102는 식용 다래의 열수추출물로 추출용매의 유해성이 전혀 없는 안전한 식용제품이며, 본 연구를 통하여 이를 증명하고자 하였다.
본 시험은 항 알레르기 효과를 갖는 식용다래추출물 PG102의 안전성 실험의 일환으로서, 랫드에서 4주간의 아급성 경구독성을 조사하기 위해 식품의약품안전청이나 국제적 표준에 맞는 독성시험법에 따라 수행한 안정성 평가시험이다. 다래는 한국 식품의약품 안전청에 식품가원료로 등재되어 있으며, 일반 식품뿐 아니라 한의학 처방으로도 오랜 기간 이용되어 왔다.
본 연구는 PG102의 임상적 사용을 위한 안전성을 과학적으로 명확하게 조사하기 위해 실시되었다. Sprague-Dawley 계 6주령 암수 랫드에 0, 100, 300 및 1,000 mg/ kg 용량으로 4주간 경구 투여하였다.
선행 연구를 통해 PG102를 랫드와 생쥐 아토피성 피부염 모델에 적용한 바 있으며 이 때에 PG102를 10~300 ㎎/㎏의 농도로 1-8 주간 경구투여하여 모든 농도군에서 유효성을 확인하였고, 이후 임상에서의 유효용량을 10-300mg/ kg로 결정하였다. 본 연구에서는 정상 암수 랫드에 일반적인 유효 투여용량보다 3배 이상의 고용량의 PG102를 4주간 투여하여 그 안전성을 확인한 것이다.
이번 연구에서는 PG102가 사람에서 임상적으로 사용되는 데에 필요한 안전성이 있는가를 조사하기 위해 식품의약품안전청과 국제적 표준에 맞는 독성시험법에 따라 설치류에서 4주 반복경구투여 독성시험을 실시하였다 [6, 7]. 독성시험 기준은 식품의약품 안전청 고시 제 2005-60호를 따라 수행하였으며, 비임상 시험에 대한 관리기준은 식품의약품 안전청 고시 제 2005-79호를 따랐다.

제안 방법

이상 소견이 보이는 장기를 파라핀 포매 (Leica EG1160 paraffin embedding station) 하여 microtome으로 5 jim의 두께로 잘라 슬라이드에 고정 하였다. H&E으로 염색한 조직은 광학현미경으로 관찰하였다.
Sprague-Dawley 계 6주령 암수 랫드에 0, 100, 300 및 1,000 mg/ kg 용량으로 4주간 경구 투여하였다. 그리고 체중변화, 일반증상 변화, 장기중량, 혈액학적 검사, 혈액 생화학적 검사 및 조직학적 검사를 실시하여 PG102의 독성을 평가하였다.
투여용량은 선행 연구의 유효용량 10~300 ㎎/㎏에 따라 선정하였다. 각 용량의 PG102를 1 ml 의식용수에 녹이고 이를 매일 오전 1회 존데를 사용하여 PG102 투여군에 4주간 경구 투여하였으며, 나머지 1 그룹에는 용매인 식용수 1 ml을 주었다. 시험 동물은 성별에 따라 수컷은 M으로 암컷은 F로 표기하였고, 각 군은 PG102 투여용량에 따라 0, 100, 300, 1,000으로 구분하였다.
일부는 백혈구 수, 적혈구수, 혈색소량, 적혈구 용적, 평균 적혈구 용적, 평균 적혈구 혈색소량, 평균 적혈구 혈색소농도, 혈소판 그리고 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구 및 단핵구의 백분율수치를 Hemavet 850FS(Oxford Science, USA) 기기를 이용하여 측정하였다. 그리고 일부는 응고시킨 다음 원심분리(3, 000 rpm, 15min)해서 전혈로부터 혈청을 얻은 후 총 단백질, 알부민, 총 빌리루빈, alkaline phosphatase, aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, 크레아틴 인산화효소, 칼슈 인, 크레아틴, 혈중 요소질소, 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 글루코오즈, sodium, potassum, chloride의 수치를 Integra 700 (Roche Diagnostics, USA) 기기를 사용하여 측정하였다 (분석대행: Neodin vetlab, Korea).
Sprague-Dawley 계 6주령 암수 랫드에 0, 100, 300 및 1,000 mg/ kg 용량으로 4주간 경구 투여하였다. 그리고 체중변화, 일반증상 변화, 장기중량, 혈액학적 검사, 혈액 생화학적 검사 및 조직학적 검사를 실시하여 PG102의 독성을 평가하였다.
동물에 zoletil 20 ㎎/㎏ + xylazine 10㎎/㎏을 복강 내에 주사(IP)하여 마취시킨 후 채혈하여 방혈로 안락사를 하였다. 주요 장기에 대한 육안 검사를 통해 병변의 유무를 관찰한 후 장기를 적출하여 각 장기의 절대 중량을 즉정한 다음, 체중에 대한 상대 중량을 계산하였다.
모든 시험 동물의 체중은 시험 개시 전 1회, 시험 개시 후 매주 1회씩 4주 동안 측정하였다.
부검전일 12시간 절식 시킨 상태에서 마취 시킨 후 개복하여 복대정맥으로 혈액을 채취하였다. 일부는 백혈구 수, 적혈구수, 혈색소량, 적혈구 용적, 평균 적혈구 용적, 평균 적혈구 혈색소량, 평균 적혈구 혈색소농도, 혈소판 그리고 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구 및 단핵구의 백분율수치를 Hemavet 850FS(Oxford Science, USA) 기기를 이용하여 측정하였다.
생후 6주령 암수 랫드를 7마리씩 각각 4 그룹으로 나누고 3 그룹에는 PG102를 각각 100, 300, 1,000 ㎎/㎏ 을 투여 하였다. 투여용량은 선행 연구의 유효용량 10~300 ㎎/㎏에 따라 선정하였다.
여러 질환모델에서 증세개선 및 치료 효과를 보인 PG102는 이번의 랫드에서 4주의 경구 투여에서도 섭취로 인한 이상 징후를 전혀 보이지 않았다. 선행 연구를 통해 PG102를 랫드와 생쥐 아토피성 피부염 모델에 적용한 바 있으며 이 때에 PG102를 10~300 ㎎/㎏의 농도로 1-8 주간 경구투여하여 모든 농도군에서 유효성을 확인하였고, 이후 임상에서의 유효용량을 10-300mg/ kg로 결정하였다. 본 연구에서는 정상 암수 랫드에 일반적인 유효 투여용량보다 3배 이상의 고용량의 PG102를 4주간 투여하여 그 안전성을 확인한 것이다.
각 용량의 PG102를 1 ml 의식용수에 녹이고 이를 매일 오전 1회 존데를 사용하여 PG102 투여군에 4주간 경구 투여하였으며, 나머지 1 그룹에는 용매인 식용수 1 ml을 주었다. 시험 동물은 성별에 따라 수컷은 M으로 암컷은 F로 표기하였고, 각 군은 PG102 투여용량에 따라 0, 100, 300, 1,000으로 구분하였다.
시험기간 중 매일 동물의 행동, 보행이상, 폐사나 빈사 상태 등을 살폈으며, 시험 중 폐사하는 동물이 발견되었을 경우 즉시 부검하여 사인을 규명하도록 하였다. 모든 시험 동물의 체중은 시험 개시 전 1회, 시험 개시 후 매주 1회씩 4주 동안 측정하였다.
μ3]. 원료(칠레산 다래) 100 g을 3차 증류수 1,000 ml에 넣고 10(TC에서 1 시간 동안 가열하여 추출하였다. 침전된 PG102에 또다시 3차 증류수 1,000 ml을 넣고 동일한 과정을 3번 반복하여 얻은 추출액을 합하여 total extract를 200 ml까지 70℃에서 농축시켰다.
복대정맥으로 혈액을 채취하였다. 일부는 백혈구 수, 적혈구수, 혈색소량, 적혈구 용적, 평균 적혈구 용적, 평균 적혈구 혈색소량, 평균 적혈구 혈색소농도, 혈소판 그리고 호중구, 호산구, 호염기구, 림프구 및 단핵구의 백분율수치를 Hemavet 850FS(Oxford Science, USA) 기기를 이용하여 측정하였다. 그리고 일부는 응고시킨 다음 원심분리(3, 000 rpm, 15min)해서 전혈로부터 혈청을 얻은 후 총 단백질, 알부민, 총 빌리루빈, alkaline phosphatase, aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, 크레아틴 인산화효소, 칼슈 인, 크레아틴, 혈중 요소질소, 콜레스테롤, 트리글리세라이드, 글루코오즈, sodium, potassum, chloride의 수치를 Integra 700 (Roche Diagnostics, USA) 기기를 사용하여 측정하였다 (분석대행: Neodin vetlab, Korea).
일주일간의 순화기간을 거치면서 일반증상을 관찰하여 임상적으로 건강한 동물만을 군당 7마리씩 암수 각각 4그룹으로 분리하였다. 투여 개시 시점에서 수컷의 체중은 136.
하였다. 주요 장기에 대한 육안 검사를 통해 병변의 유무를 관찰한 후 장기를 적출하여 각 장기의 절대 중량을 즉정한 다음, 체중에 대한 상대 중량을 계산하였다.

대상 데이터

Sprague-Dawley계 5주령 암수 랫드를 서울대학교 실험동물 자원관리원(한국)으로부터 구입하였다. 일주일간의 순화기간을 거치면서 일반증상을 관찰하여 임상적으로 건강한 동물만을 군당 7마리씩 암수 각각 4그룹으로 분리하였다.

데이터처리

대조군과 PG102 투여군 간의 체중 및 장기무게의 변화, 혈액검사, 혈청 생화학검사에 대한 결과는 평균 土 표준편차로 표시 하였고, One-way ANOVA로 분석한 후 Dunnett multiple comparison test로 대조군과 시험물질투여 군과의 통계적인 유의차를 분석하였다. 각 성별의 D.

이론/모형

7]. 독성시험 기준은 식품의약품 안전청 고시 제 2005-60호를 따라 수행하였으며, 비임상 시험에 대한 관리기준은 식품의약품 안전청 고시 제 2005-79호를 따랐다.

성능/효과

PG102를 4주간 투여 후 모든 시험 동물로부터 각 장기를 적출하여 장기중량을 측정한 결과 M-100군에서 간의 절대적 무게가 대조군 M-0군과 비교하여 증가하였다. 그러나 이러한 결과는 용량 의존적이지 않고 간의 병리 조직학적 소견, 임상증상이나 혈액검사와 비교하여 연계성이 없어 개체별 차이에 기인한 변화로 보인다.
PG102의 랫드에 대한 4주간의 아급성 독성 시험에서 일반증상, 체중변화, 장기 중량측정, 혈액학적 검사, 혈액 생화학적 검사, 조직학적 검사를 실시하였으며, 결과에서 서술한 바와 같이 안전성의 문제를 야기할 수 있는 특이적 이상반응은 나타나지 않았다. 즉, PG102의 고용량 반복 경구투여시에 독성반응이 나타나지 않았으며, 임상학적, 생화학적으로 안전한 물질로 판정되었다.
통계적인 유의차를 분석하였다. 각 성별의 D.W. 투여군인 대조군의 평균값에 비교하여 각 농도의 시험물질인 PG102를 투여한 군 간의 평균값의 차이에 대해 비교유의차가 5% 미만 (p<0.05)일 때 통계적 유의성이 있는 것으로 판정하였다.
사망한 동물은 없었다. 또한 모든 동물에서 시험물질 투여 후 대조물질 투여군에 비하여 특이할 만한 임상학적 이상은 관찰되지 않았다.
그러나 PG102를 보다 높은 용량으로 투여받은 M-300군과 M-1000군의 장기 무게에는 대조군 M-0군과 비교하여 유의적인 차이를 보이지 않았다. 암컷군인 F-100군에서 심장의 상대적 무게가 0.333 + 0.01 g으로 대조군인 F-0군의 0.358 + 0.02 g 과 비교하여 유의한 감소0 = 004)를 보였으나, F-300군과 F-1000군의 암컷 고용량군에서는 대조군에 비하여 유의한 수준의 증감이 관찰되지 않았다. F-1000군에서는 침샘의 상대적 무게가 0.
03). 암컷의 고용량군인 F-1000군에서의 혈중 요소질소의 수치는 13.70± 1.72 mg/dl으로서, 대조군 F-0군의 11.43 ±1.50 mg/dl과 비교하여 유의한 증가0 = 0.02) 가관찰되었다. 랫드의 정상적인 혈중 요소질소의 범위는 10-18.
감마선 조사 (2 rad) 실험동물용 고형사료 (LabDiet, USA) 와 살균 수도수를 자유 급식하였다. 이상의 SD rat에 대한 4주 반복 경구투여의 독성실험을 동일한 조건으로 2 회 반복하였다.
장기중량 측정 결과 저용량 수컷군인 M-100군에서 간의 절대적 무게가 1279± 1.32g으로서 대조군인 M-0군의 간의 무게인 11.13±1.08g과 비교하여 유의한 수준의 증가를 보였다0 = 0.02). 그러나 PG102를 보다 높은 용량으로 투여받은 M-300군과 M-1000군의 장기 무게에는 대조군 M-0군과 비교하여 유의적인 차이를 보이지 않았다.
특이적 이상반응은 나타나지 않았다. 즉, PG102의 고용량 반복 경구투여시에 독성반응이 나타나지 않았으며, 임상학적, 생화학적으로 안전한 물질로 판정되었다. 따라서 PG102는 항 알레르기 효과가 있는 안전한 건강기능식품(nutraceutical)이 될 수 있는 것으로 사료된다.
체중 변화에서는 실험 1-2주차에서 M-300군이 30.14 ±3.20% 증가하여 대조군 M-0군의 27.12 ±2.01% 증가와 비교하여 체중의 유의 한증가3 = 0.03)를 나타내었으며, 또한 F-300군도 23.15 ±3.59% 증가하여, 대조군 F-0군의 18.23 + 3.67% 증가와 비교하여 체중의 변화가 유의한 증가(p = 0.02)를 나타내었다. 나머지 시험물질 투여 군들에서는 대조군과 비교하여 차이가 거의 없었으며 매주간 고른 증가율을 보였다.
[5]. 체중 변화의 추이를 조사한 결과, 1-2주차에 랫드의 중간 용량군인 M-300, F-300군의 몸무게 증가율이 대조군 M-0, F-0군에의 비해 유의한 증가를 보였지만 4 주간의 총변화율과 연관지어 유의성을 갖지 않으며, 용량 의존적인 경향도 보이지 않았다. 따라서 M-300, F-300군에서 몸무게 증가율은 일시적인 것으로 PG102에 의한 영향으로 보기 어렵다.
평균 적혈구 용적 및 평균 적혈구 색소량과 평균 적혈구 색소농도를 포함하는 모든 혈액학적 검사항목 항목에서 대조군과 시험물질 투여군 사이에 유의성 있는 변화는 발견되지 않았다.
평균 적혈구 용적 및 평균 적혈구 색소량과 평균적 혈구 색소농도를 포함하는 모든 혈액 학적 검사항목에서 대조군과 시험물질 투여군 사이에 통계학적으로 유의한 차이는 나타나지 않았다.

후속연구

예를 들어 PG102는 오브알부민으로 감작시킨 아토피 마우스 모델 및 NC/Nga 마우스 등의 아토피 피부염 모델에서 IgE는 물론 Th2 사이토카인인 IL4와 IL-5를 선택적으로 억제하는 등, 뚜렷한 면역개선 효능을 나타내었다. 이를 통하여 PG102가 IgE에 의해서 매개되는 아토피 피부염을 비롯한 다양한 알레르기 질환에 대해 예방 및 개선제로 사용될 수 있는 가능성을 발견하였다.

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다래(Actinidia arguta) 열매의 열수 추출물, PG102의 4주 반복 경구투여에 대한 안전성 연구
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