혈청 내 콜레스테롤을 정량분석하기 위한 일차분석법으로 동위원소희석 액체크로마토그래피/질량분석법(isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry)을 사용하였다. 콜레스테롤은 Thermo ODS hypersil $C^{18}$ 칼럼을 사용하여 분리하였고, 이동상은 100% 메탄올, 유속은 0.3 mL/min으로 하였다. 콜레스테롤과 콜레스테롤-$3,4-13C_2$는 $[M-H_2O+H]^+$이온에 해당하는 m/z 369.4와 371.3에서 모니터링하여 정량에 합당한 크로마토그램을 얻을 수 있었다. 방법의 유효성을 증명하기 위해서 NIST SRM 909b를 분석한 결과 인증값과 불확도 범위 내에서 일치하는 것을 확인하였다. 이 방법을 바탕으로 혈청 인증표준 물질 4 종류를 제조하여 인증을 실시하였다. 인증 결과, 반복성의 상대표준오차는 0.1~0.8%, 재현성의 경우 0.24%이하, 확장 불확도는 95% 신뢰도구간에서 약 1.43%로 나타났다.
혈청 내 콜레스테롤을 정량분석하기 위한 일차분석법으로 동위원소희석 액체크로마토그래피/질량분석법(isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry)을 사용하였다. 콜레스테롤은 Thermo ODS hypersil $C^{18}$ 칼럼을 사용하여 분리하였고, 이동상은 100% 메탄올, 유속은 0.3 mL/min으로 하였다. 콜레스테롤과 콜레스테롤-$3,4-13C_2$는 $[M-H_2O+H]^+$이온에 해당하는 m/z 369.4와 371.3에서 모니터링하여 정량에 합당한 크로마토그램을 얻을 수 있었다. 방법의 유효성을 증명하기 위해서 NIST SRM 909b를 분석한 결과 인증값과 불확도 범위 내에서 일치하는 것을 확인하였다. 이 방법을 바탕으로 혈청 인증표준 물질 4 종류를 제조하여 인증을 실시하였다. 인증 결과, 반복성의 상대표준오차는 0.1~0.8%, 재현성의 경우 0.24%이하, 확장 불확도는 95% 신뢰도구간에서 약 1.43%로 나타났다.
An ID LC/MS (isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry) was used as a primary method for the quantitative analysis of cholesterol in human serum. The separation of cholesterol was carried out by Thermo ODS hypersil $C^{18}$ column. The mobile phase was 100% methanol, and fl...
An ID LC/MS (isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry) was used as a primary method for the quantitative analysis of cholesterol in human serum. The separation of cholesterol was carried out by Thermo ODS hypersil $C^{18}$ column. The mobile phase was 100% methanol, and flow rate was $0.3m{\ell}/min$. Cholesterol and cholesterol-$3,4-13C_2$ were monitored at m/z 369.4 and 371.3, which correspond to $[M-H_2O+H]^+$ respectively. In order to verify the measurement method, NIST SRM 909b was analyzed. The results agreed well with certified values within uncertainty. The four kinds of serum certified reference material were prepared and certified. The repeatabilities of measurement were ranged from 0.1 to 0.8% (RSD), which were relatively good. The reproducibility between independent measurement run was below 0.24% (RSD). The expanded uncertainty was about 1.43% within the 95% confidence interval.
An ID LC/MS (isotope dilution liquid chromatography/mass spectrometry) was used as a primary method for the quantitative analysis of cholesterol in human serum. The separation of cholesterol was carried out by Thermo ODS hypersil $C^{18}$ column. The mobile phase was 100% methanol, and flow rate was $0.3m{\ell}/min$. Cholesterol and cholesterol-$3,4-13C_2$ were monitored at m/z 369.4 and 371.3, which correspond to $[M-H_2O+H]^+$ respectively. In order to verify the measurement method, NIST SRM 909b was analyzed. The results agreed well with certified values within uncertainty. The four kinds of serum certified reference material were prepared and certified. The repeatabilities of measurement were ranged from 0.1 to 0.8% (RSD), which were relatively good. The reproducibility between independent measurement run was below 0.24% (RSD). The expanded uncertainty was about 1.43% within the 95% confidence interval.
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문제 정의
본 연구에서는 혈청 내 콜레스테롤을 정 량분석하기위한 최상위 측정방법으로 ID LC/MS 방법을 제안하였다. 이 방법은 ID GC/MS에 비해 유도체화 과정 이필요 없고 시료 전처리 과정이 간단하여 시간과 비용을 감소시킬 수 있는 장점이 있다.
본 연구에서는 혈청 내 콜레스테롤을 정량하기 위한 일차분석 법으로 동위 원소희석 액 체크로마토그래 피 /질량분석법을 개발하였다. 일차분석법은 측정 에 있어서 질적으로 가장 상위인 방법으로 그 조작 방법이 완벽하게 기술되어야하고, 측정하고자하는 양(화학측정의 경우, mol)에 대해 어떤 표준을 참고하지 않고도 그 결과가 받아들여질 수 있어야 한다.
혈청 콜레스테롤 측정에 있어 소급성의 확립은 외국의 경우 국가적인 과제 규모로 진행되고 있지만, 우리나라의 경우는 아직 발판이 미비한 상태라 본 연구에서는 소급성을 확립하고 이 소급성을 임상 진단기관 등에 보급하고자 인증표준물질의 제조 및 인증에 대한 연구를 수행하였다.
제안 방법
3개의 혼합표준용액에 대한 동위원소희석 액체크로마토그래피/질량분석법 실험을 4회 반복측정한 후 콜레스테롤과 콜레스테롤-3,4-13c2의 무게비에 대한 피이크 면적비에 해당하는 감도계수(response factor, R.F.) 를 구하여 상호 비교하였다. 혼합표준용액은 동위원소 희석 질량분석법에서 결과산출을 위한 직접적인 표준이 되므로 이에 대한 검증은 반드시 필요하다.
4 종류의 혈청인증표준물질을 제조하여 이에 대한 인증을 실시하였다. 콜레스테롤의 전처리 과정은 앞의 실험 부분에서 언급한바와 같으며, 비교적 혈 중 농도가 높고 혈청 내에 존재하는 다른 물질에 비해서 추출이 잘되므로 혼합표준용액 제조과정과 spiking만 유의한다면 좋은 결과를 얻을 수 있다.
APCI 양이온 모드에서 콜레스테롤의 질량 스펙트럼을 확인하였다. 먼저 콜레스테롤과 콜레스테롤-3,4-13c2 각각의 용액에 대해 질량 스펙트럼을 얻은 후, 콜레스테롤과 콜레스테롤-3,4-13c2 혼합표준용액의 질량 스펙트럼을 확인하였다.
KRISS (Korea Research Institute of Standards and Science)에서 제조한 4종류의 혈청 인증표준물질 각각을 무작위로 5 개씩 선택하여 전처리 과정을 수행하였다. 최적화 조건에서 혼합표준용액, 시료의 순서로 4회 이상 반복 측정하여 분석하였다.
매번 측정 할 때 마다 혈청 인증표준물질 4 종류에 대해 무작위로 5개 시료를 선택하였고, 미리 예비실험을 통해 측정된 혈청 인증표준물질 내 콜레스테롤의 농도값을 기준으로 콜레스테롤-3, 4-%:2를 이 되도록 첨가하여 전처리를 진행하였다.
먼저 갈색 병의 무게를 측정하였다. 다음 혈청 0.
혈청 시료는 -75℃ 에서 보관되었다. 먼저 냉동혈청은 상온에서 완전히 해동시키고 저울실에서 약 2 시간 정도 두어 온도에 의한 무게 변화가 생기지 않도록 하였다. 냉동건조혈청은 다음의 재구성 과정을 거친 후사용하였다.
확인하였다. 먼저 콜레스테롤과 콜레스테롤-3,4-13c2 각각의 용액에 대해 질량 스펙트럼을 얻은 후, 콜레스테롤과 콜레스테롤-3,4-13c2 혼합표준용액의 질량 스펙트럼을 확인하였다. Fig.
43%로 나타났다. 본 연구를 통하여 혈청 내 콜레스테롤을 절대 정량 분석하는 최상위 비교분석법으로써 ID LC/MS 방법을 확립하였으며, 이 방법은 혈청 인증표준물질을 인증하는 일차기준즉정절차로 사용될 수 있다.
약 2주 간격으로 6회 반복 측정하여 재현성을 살펴보았다. 매번 측정 할 때 마다 혈청 인증표준물질 4 종류에 대해 무작위로 5개 시료를 선택하였고, 미리 예비실험을 통해 측정된 혈청 인증표준물질 내 콜레스테롤의 농도값을 기준으로 콜레스테롤-3, 4-%:2를 이 되도록 첨가하여 전처리를 진행하였다.
3 에서 가장 큰 이온세기를 나타내었다. 이는 물 분자가 떨어진 [M-H20+H]+ 이온에 해당하는 것으로 분자 이온보다 더 큰 이온세기를 나타내었으며 본 연구에서는 이 두 이온을 모니터링하여 정 량하였다.
3 mL를 취하여 미리 무게를 달아둔 갈색 병에 옮기고 다시 무게를 측정하였다. 채취한 시료의 콜레스테롤과 동위원소비가 l:l(w/w)이 되도록 콜레스테롤-3,4-13c2 표준용액을 spiking하고 갈색 병의 무게를 측정하였다. 콜레스테롤-3, -3,4-13c2 표준용액이 첨가된 시료는 잘 흔들어 섞어준 후, 1시간 동안 실온에 보관하였다.
최적화 조건에서 혼합표준용액, 시료의 순서로 4회 이상 반복 측정하여 분석하였다. 분석 결과로 콜레스테롤/콜레스테롤-3, 4*C2 의 면적비를 얻었으며, 콜레스테롤 농도(C)는 아래 식에 각각의 변수를 대입하여 계산하였다.
분석하여 상호 비교하였다. 측정결과 인증값과불확도 범위 내에서 일치하는 것을 확인하였으며, 이를 토대로 4 종류의 혈청 인증표준물질에 대한 제조와 인증을 실시하였다.
콜레스테롤-3, 4-%2 표준용액과 콜레스테롤 일차표준 용액의 농도비가 1:1이 되도록 혼합하여 3개의 혼합표준용액을 제조하였다. 혼합표준용액의 정확한 농도를 계산하여 약 50 jig/g 농도가 되도록 에탄올로 희석 한 후 사용하였다.
혈청 내 콜레스테롤을 분석하기 위해 본 연구에서 확립한 동위원소희석 액체크로마토그래 피/질 량분석 법의 정확성과 유효성을 확인하기 위하여 인증값을 갖고 있는 NIST SRM 909b를 분석하였다. 분석을 위해 1 회 측정 시 SRM 909b로부터 5개의 시료를 취하여 분석하였다.
냉동건조혈청은 다음의 재구성 과정을 거친 후사용하였다. 혈청시료 병은 가볍게 두드려 모든 혈청 분말이 병 바닥에 모이도록한 후 무게를 측정하여 기록하였다. 시료 병을 열고 1어=0.
혈청시료의 질량 크로마토그램에서 신호 대 잡음비 (S/N ratio)에 기초하여 검출한계와 정 량한계를 측정하였다. 시료용액을 묽힌 다음 최적조건에서 시료를 5 uL 취하여 반복 측정하였다.
대상 데이터
1% 아세트산 포함) 100%, 순수 메탄올 100%, 메탄올:아세토니트릴(95:5, v/v), 아세토니트릴:물 (95:5, v/v) 등 여러 종류로 실험해 본 결과, 이온세기는 모두 비슷한 값을 가졌다. APCI는용매의 이온화가 먼저 일어나고 이온화된 용매 분자가 측정 대상물질을 이온화시키므로 이온화가 잘되고, 머무름 시간이 가장 빠른 메탄올 100%를 이 동상으로 선택하였다. 유속은 피이크 모양을 고려하여 0.
동위원소표지 내부표준물질, 콜레스테롤-3, 4-%2(99%)는 Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Andover, MA, USA)에서 구입하여 사용하였다.
일차표준용액 제조에 쓰인 콜레스테롤 고순도 표준물질(NIST SRM 911b)과 분석 방법의 유효성을 확인하기 위해서 사용된 혈청표준물질(NIST SRM 909b) 은 NlST(Gaithersburg, MD, USA)에서 구입하였다. 동위원소표지 내부표준물질, 콜레스테롤-3, 4-%2(99%)는 Cambridge Isotope Laboratories, Inc.
이 온화 장치는 APO (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) 양이온 모드를 사용하였다. 칼럼은 ODS hypersil Cig (Thermo, 100x2.1 mm, 3 jim)을사용하였고, 보호 칼럼 도 ODS hypersil c18 (Thermo, 10x3 mm, 5 |im)을 사용하였다. 액체크로마토그래피에서 이동상은 100% 메탄올, 유속은 0.
혈청시료는 본 연구에서 제조한 4 종류의 혈청 인증표준 물질로 냉동혈청(Frozen human serum, Level 1 and 11) 두 종류와 냉동건조혈 청 (Lyophilized human serum, Level 1 and 11) 두 종류를 포함하고 있다. Level Ie 정상농도, level Ⅱ는 고농도를 의미한다.
71%의 낮은 상대표준 편차를 얻음으로써 혼합표준용액의 제조가 정확하고 측정하는 동안 기기에 대한 drift도 낮았음을 알 수 있었다. 혼합표준용액 중에서 평균값에 근접하고 반복 측정의 상대표준 편차가 작은 혼합표준용액 1개를 선택하여 콜레스테롤 정 량을 위한 표준용액으로 사용하였다.
데이터처리
이러한 필요에 의하여 혈청 내 콜레스테롤을 분석하는 일차분석 법으로 동위 원소희석 액 체 크로마토그래피/질량분석법을 확립하였고, 이 방법의 유효성을 확인 하기 위하여 NIST (National Institute of Standards and Technology) SRM (Standard Reference Material) 909b를 분석하여 상호 비교하였다. 측정결과 인증값과불확도 범위 내에서 일치하는 것을 확인하였으며, 이를 토대로 4 종류의 혈청 인증표준물질에 대한 제조와 인증을 실시하였다.
측정불확도는 불확도 평가 프로그램인 PUMA (Program for Uncertainty Calculation in Measurement and Analysis)를 이용하여 ISO guide끄에 따라 평가하였으며, 냉동혈청 Level 1 시료의 콜레스테롤 측정 결과에 대한 불확도 평가 결과를 Table 4에 나타내었다. 여기에서 또 하나 중요한 요점은 불확도에 영향을 미치는 인자와 기여도의 정도이다.
이론/모형
액체크로마토그래피는 Agillent 1100 series를 사용하였고, 질량분석기는 triple-stage quadrupole mass spectrometer로 ABI회사의 API 2000 모델을 사용하였다. 이 온화 장치는 APO (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) 양이온 모드를 사용하였다.
3 mL/min, 시료주입 량은 5 pL를 최적화 조건으로 하였다. 질량분석 기 에서는 선택 이 온분석 법(Selected Ion Monitoring, SIM)을 통해 콜레스테롤은 m/z 369.4, 콜레스테롤- 3, -3,4-13c2 은 m/z 371.3에서 모니터링하였다. 최적 질량분석기 조건은 양이온 모드에서 curtain gas는 35 psi, nebulizer current는 1.
성능/효과
Table 1은 감도계수를 나타낸 것으로 이로부터 표준용액 제조의 정확성과 측정 도중 기기의 drift에 의한 영향 여부 등을 알 수 있다. 0.71%의 낮은 상대표준 편차를 얻음으로써 혼합표준용액의 제조가 정확하고 측정하는 동안 기기에 대한 drift도 낮았음을 알 수 있었다. 혼합표준용액 중에서 평균값에 근접하고 반복 측정의 상대표준 편차가 작은 혼합표준용액 1개를 선택하여 콜레스테롤 정 량을 위한 표준용액으로 사용하였다.
8%의 범위에 해당하는 좋은 반복성을 보였으며, 각 시료에 대해 6회 독립적으로 반복 측정한 평균값과 상대표준편차를 Table 3에 나타내었다. 4 종류에 대해 모두 0.24%이하의 상대표준 편차를 얻음으로써 좋은 재현성을 보였다. 인증표준 물질에 대한 인증값은 냉동혈청 (Frozen human serum) Level Ie 1259.
시료용액을 묽힌 다음 최적조건에서 시료를 5 uL 취하여 반복 측정하였다. 검출한계는 신호 대 잡음 비가 3인 피이크 세기에서의 농도이며 약 0.05 μg/g임을 확인하였다. 정량한계는 신호 대 잡음 비가 최소 10인 피이크 세기에서의 농도로 약 0.
3에서 방해 이온 없이 정 량에 합당한 크로마토그램을 얻을 수 있었다. 방법의 유효성을 확인하기 위해 NIST SRM 909b 를 분석하여 인증값과 비교한 결과 불확도 범위 내에서 일치함을 보였다. 혈청 인증표준물질 4종류를 분석한 결과, 반복성의 상대표준 편차는 0.
여기에서 또 하나 중요한 요점은 불확도에 영향을 미치는 인자와 기여도의 정도이다. 불확도에 영향을 미치는 인자의 기여도를 살펴보면 시료의 면적비(콜레스테롤/콜레스테롤-3,4-13c2가 가장 큰 영향을 미치고 그 다음으로 혼합표준용액의 면적비가 영향을 미치는 것으로 나타났다. 이는 질량분석기가 얼마나 안정하게 반복 측정하는지의 여부에 따른 것으로 기기의 안정된 운용이 불확도를 줄이는 주요 관건이 될 수 있음을 알 수 있었다.
NIST SRM 909b는 동위원소희석 기체크로마토그래피/질량분석법으로 얻은 인증값으로서 두 방법간의 비교도 가능하게 했다. 이로써 동위원소 희석 기체크로마토그래 피/질량분석 법 대신에 유도 체화 과정이 필요 없는 동위원소희석 액체크로마토그래피/질량분석법으로의 분석법 확립이 가능함을 확인하였다.
24%이하의 상대표준 편차를 얻음으로써 좋은 재현성을 보였다. 인증표준 물질에 대한 인증값은 냉동혈청 (Frozen human serum) Level Ie 1259.67±18.01 jig/g, 냉동혈청 Level Ⅱ는 1554.49±22.23 jig/g, 냉동건조혈청 (Lyophilized human serum) Level Ie 1373.46±19.64 jig/g, 냉동건조혈청 Level Ⅱ는 1512.26±21.63 |ig/g임을 확인하였다.
05 μg/g임을 확인하였다. 정량한계는 신호 대 잡음 비가 최소 10인 피이크 세기에서의 농도로 약 0.17 μg/g이나 측정의 재현성을 고려하여 최소 0.5 |Lig/g 이상의 농도가 적절함을 확인하였다.
실시하였다. 콜레스테롤의 전처리 과정은 앞의 실험 부분에서 언급한바와 같으며, 비교적 혈 중 농도가 높고 혈청 내에 존재하는 다른 물질에 비해서 추출이 잘되므로 혼합표준용액 제조과정과 spiking만 유의한다면 좋은 결과를 얻을 수 있다. 혼합표준용액 제조 시에는 에탄올 용매를 사용하므로 휘발로 인한 농도의 변화가 없도록 주의하고, spiking을 할 때는 용매와 혈청의 매질이 다르므로 정확한 농도의 spiking을 위해 부피에 대한 무게의 보정을 실시해 주는 것이 필요하다.
방법의 유효성을 확인하기 위해 NIST SRM 909b 를 분석하여 인증값과 비교한 결과 불확도 범위 내에서 일치함을 보였다. 혈청 인증표준물질 4종류를 분석한 결과, 반복성의 상대표준 편차는 0.1 ~0.8%, 재현성은 0.24%이하로 좋은 결과를 얻었다. 확장 불확도는 95% 신뢰도에서 약 1.
7분이었고 콜레스테롤-3,4-13c2와 동일한 머무름 시간을 나타내었으며, 매질에 의한 간섭현상 없이 정량하기에 합당한 이온세기와 피이크 모양을 얻을 수 있었다. 혈청시료에 콜레스테롤-3, 4*C2 의 오염 여부를 알기 위해 순수한 혈청에 대한 콜레스테롤과 콜레스테롤-3,4-13c2의 질량 크로마토그램을 얻었을 때 혈청에 콜레스테롤-3,4-13c2는 불순물로 포함되어 있지 않음을 확인하였다.
참고문헌 (22)
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