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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 국립독성과학원에서 추진하고 있는 오남용 가능성이 높은 천연물에 대한 독성물질 관리체계를 확립하기 위한 사업의 일환으로 시험물질 금은화 추출물을 랫드에 90 일간 반복 경구투여 하였을 때 중장기간 내에 나타나는 독성을 질적, 양적으로 검사하여 본 시험물질의 무해용량, 확실중독량 및 표적 장기를 알아보기 위하여 실시하였다.
- 본 시험은 국립독성과학원으로부터 제공받은 시험물질 금은화 추출물의 독성을 조사하기 위해 F344/N 랫드를 이용한 90일간 반복 경구투여 독성시험을 수행하였다.
제안 방법
- 실시하였다. 후대정맥으로부터 채혈된 혈액을 실온에 30분간 방치하여 응고시킨 후 원심분리(3, 000 rpm, 10분간)하여 얻은 혈청에 대하여 aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, y-glutamyl transpeptidase, alkaline phosphatase, blood urea nitrogen, creatinine, glucose, total cholesterol, total protein, creatine phosphokinase, albumin, total bilirubin, albumin/globulin ratio, triglyceride, inorganic phosphorus 및 Ca"의 함량은 자동생화학분석기(AU400; Olympus, Japan)를 이용하여 측정 하였고 Na*, K+, Cl전해 질자동분석 장치 (644 Na/K/Cl Analyzer; Ciba-Coming, USA)를 이용하여 측정하였다.
- 계획부검 시까지 생존한 모든 동물에 대하여 혈액학적 검사를 실시하였다. 동물을 하룻밤 절식시킨 후 에테르 마취하에 개복하여 후대정맥으로부터 채혈한 혈액을 항응고제인 ED1A-2K가 들어있는 CBC 채혈병에 약 0.
- 군 분리 전 순화기간 중에 모든 동물에 대하여 눈의 외관을 육안적으로 관찰하였고, 부검개시 전 주에 전 시험 군에 대하여 눈의 외관을 육안적으로 관찰하였다. 그리고 부형제 투여군 및 최고용량군에 대하여는 안 저 사진기(Genesis; Gowa, Japan)를 이용하여 눈의 안 저 부위를 검사하였다.
- 그리고 대조군으로는 부형제만을 투여하는 부형제 투여군을 설정하였다.
- 그리고 부형제 투여군 및 최고용량군에 대하여는 안 저 사진기(Genesis; Gowa, Japan)를 이용하여 눈의 안 저 부위를 검사하였다.
- 검사를 실시하였다. 동물을 하룻밤 절식시킨 후 에테르 마취하에 개복하여 후대정맥으로부터 채혈한 혈액을 항응고제인 ED1A-2K가 들어있는 CBC 채혈병에 약 0.5 ml 취한 후 혈구자동계측장치(CELL DYN 3700; Abbot, USA)를 이용하여 백혈구수, 적혈구수, 혈색소량, 적혈구백분율, 평균적 혈구용적, 평균적 혈구혈색소량, 평균적 혈구 혈색소 농도, 혈소판수, 백혈구 백분비 [호중구, 호산구, 호염기구, 림프구, 단핵구의 백분율]을 측정하였으며, 망상적혈구 검사는 methylene blue 염색을 한 후 광학현미경으로 1,000개의 적혈구에 포함되어 있는 망상 적혈구 수를 검경하였다. 혈액응고시간 검사는 부검 일에 prothrombin time 및 active partial thromboplastin time 을 혈액응고시간 검사장치(CA-50; Sysmex, Japan)를 이용하여 측정하였다.
- 대하여 부검소견을 관찰하였다. 또한 부검 동물의 뇌, 가슴샘, 폐, 심장, 간장, 비장, 신장, 고환, 난소의 중량을 측정하였다.
- 부검일 전 12 일간 실시하였다. 매일 오전 8-10 시 사이에 각각의 동물에서 2개씩의 질 도말 표본을 준비하여 염색한 후 검경하여 성주기 검사를 실시하였다.
- 모든 계획부검동물에 대해 고환, 부고환, 전립샘, 정낭, 포피선, 난소, 자궁, 질, 음핵샘, 방광, 비장, 췌장, 위, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장, 장간막림프절, 하악림프절, 침샘, 부신, 신장, 간, 흉골, 가슴샘, 심장, 폐(기관지), 대동맥, 기관, 식도, 갑상샘 부갑상샘, 혀, 좌골신경, 골격근, 대퇴골, 흉척수, 안구, 하더씨샘, 비강, 뇌, 뇌하수체, 피부(젖샘)를 적출하여 10% 중성 완충 포르말린 용액에 고정하였다. 다만, 안구는 Davidson's 용액에, 고환과 부고환은 Bouin, s 액에 고정 하였다.
- 부검일 전 12 일간 실시하였다. 매일 오전 8-10 시 사이에 각각의 동물에서 2개씩의 질 도말 표본을 준비하여 염색한 후 검경하여 성주기 검사를 실시하였다.
- 부검일에 각 군당 5 례의 동물들에 대하여 좌측 고환에서 정자두부수 및 우측의 부고환에서 정자의 운동성을 검사하였다.
- 부형제 투여군 및 1,000 및 2,000 ㎎/㎏/day 투여군의 모든 동물의 고정장기를 삭정, 파라핀 포매하고, 4~5 jim 두께로 박절 및 H&E 엮색과정을 거쳐 조직병리학직 검사를 위한 검체를 제작하였으며, 기타 투여군에서는 육안적 부검소견이 인정되는 장기에 대하여 검체를 제작하였다.
- 시험기간 중 모든 동물에 대하여 매일 2회(오전 및 오후, 최소한 6 시간 간격)에 거쳐 사망여부, 증상의 종류, 발현일 및 증상의 정도를 개체 별로 기록하였다.
- 이용하여 위내에 직접 투여하였다. 시험물질 투여 횟수 및 투여기간은 KNTP 가이드라인에 근거하여 1 회/일, 5회/주(월~금), 총 90일간 반복 경구투여하였다. 투여액량은 가장 최근 체중 측정일에 측정한 체중을 기준으로 5 ml/kg 으로 계산하였다.
-
투여방법 및 시험기간
시험물질의 투여경로는 임상 적용 경로인 경구투여를 선택하였고, 투여방법은 경구투여용 존데를 장착한 주사 관을 이용하여 위내에 직접 투여하였다. 시험물질 투여 횟수 및 투여기간은 KNTP 가이드라인에 근거하여 1 회/일, 5회/주(월~금), 총 90일간 반복 경구투여하였다.
- 요침사검사는 적혈구, 백혈구, 상피세포, 원주를 관찰하였다. 채뇨는 대사케이지를 이용하여 실시하였고, 정성분석, 요색조 검사 및 요침사 검사를 위하여 3~4시간 동안 채뇨 한 신선뇨를 사용하였고, 요량은 24시간 동안의 축뇨를 이용하여 즉정하였다.
- 요침사검사는 적혈구, 백혈구, 상피세포, 원주를 관찰하였다. 채뇨는 대사케이지를 이용하여 실시하였고, 정성분석, 요색조 검사 및 요침사 검사를 위하여 3~4시간 동안 채뇨 한 신선뇨를 사용하였고, 요량은 24시간 동안의 축뇨를 이용하여 즉정하였다.
- 체중은 투여개시일 및 시험기간 중 주 1회, 그리고 부검 일에 절식 후의 체중을 측정하였다.
- 투여 량 설정은 본 시험물질을 이용한 2주간의 반복 경구투여 용량설정시험 결과 및 본 시험물질이 천연물인 점 등을 감안하여 2,000 ㎎/㎏/day를 최고용량으로 설정하고 그 다음 용량으로 반복 경구투여시험에서의 한계용량으로 많이 사용되는 1,000 ㎎/㎏/day을 설정하였으며, 아래로 공비를 약 3으로 하여 3개의 용량군을 두었다. 그리고 대조군으로는 부형제만을 투여하는 부형제 투여군을 설정하였다.
- 투여 최종주에 시험군별 각 5마리의 동물에 대하여 요검사용 시험지(Multisatix 10 SG; Bayer, USA)와 요 자동분석 장치 (CliniTek 100; Bayer, USA)를 이용하여 요당, 빌리루빈, 케톤체, 요비중, 잠혈, pH, 단백질, 유로빌리노겐, 아질산염 및 백혈구에 관하여 검사하였다. 요침사검사는 적혈구, 백혈구, 상피세포, 원주를 관찰하였다.
- 혈액검사를 위한 채혈이 끝난 동물은 후대동맥을 절단하여 방혈치사 시킨 후 복강, 흉강 및 두부의 모든 장기에 대하여 부검소견을 관찰하였다. 또한 부검 동물의 뇌, 가슴샘, 폐, 심장, 간장, 비장, 신장, 고환, 난소의 중량을 측정하였다.
- 5 ml 취한 후 혈구자동계측장치(CELL DYN 3700; Abbot, USA)를 이용하여 백혈구수, 적혈구수, 혈색소량, 적혈구백분율, 평균적 혈구용적, 평균적 혈구혈색소량, 평균적 혈구 혈색소 농도, 혈소판수, 백혈구 백분비 [호중구, 호산구, 호염기구, 림프구, 단핵구의 백분율]을 측정하였으며, 망상적혈구 검사는 methylene blue 염색을 한 후 광학현미경으로 1,000개의 적혈구에 포함되어 있는 망상 적혈구 수를 검경하였다. 혈액응고시간 검사는 부검 일에 prothrombin time 및 active partial thromboplastin time 을 혈액응고시간 검사장치(CA-50; Sysmex, Japan)를 이용하여 측정하였다. 혈액응고시간 검사용 항응고제는 3.
- 혈액학적 검사를 실시한 동물에 대하여 혈액 생화학적 검사를 실시하였다. 후대정맥으로부터 채혈된 혈액을 실온에 30분간 방치하여 응고시킨 후 원심분리(3, 000 rpm, 10분간)하여 얻은 혈청에 대하여 aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, y-glutamyl transpeptidase, alkaline phosphatase, blood urea nitrogen, creatinine, glucose, total cholesterol, total protein, creatine phosphokinase, albumin, total bilirubin, albumin/globulin ratio, triglyceride, inorganic phosphorus 및 Ca"의 함량은 자동생화학분석기(AU400; Olympus, Japan)를 이용하여 측정 하였고 Na*, K+, Cl전해 질자동분석 장치 (644 Na/K/Cl Analyzer; Ciba-Coming, USA)를 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
- F344/N 랫드는 inbred 랫드로, K3TP에서 권장하는 시험계이고, 각종 독성시험에 널리 사용되고 있어 풍부한 시험기초자료가 축적되어 있으며, 시험결과의 해석 및 평가에 이러한 자료를 이용할 수 있어 선택하였다.
- 본 시험에 사용한 금은화 추출물은 암갈색의 고체 상태로서 대한약전의 표준탕제법에 따라 열탕 추출 후 동결건조한 것을 국립독성과학원(한국)으로부터 제공받아냉동보관하면서 사용하였다. 시험물질의 조제는 함량에 대한 보정 없이 중량 그대로를 투여직전에 멸균 주사 용수에 필요한 농도로 희석하여 사용하였다.
- 본 시험에서는 일본 SLC에서 생산하고 있는 4.5 주령 의 특정병 원체 부재(specific pathogen-free, SPF) Fischer 344/N(F344/N) 암.수 랫드 각 75마리를 중앙실험동물(한국)로부터 제공받았고, 12 일간의 검역과 순화 과정을 거쳐 건강한 동물 암.
- 사료는 방사선 조사로 멸균된 실험동물용 고형사료 (Labdiet 5002, Rodent diet; PM1 Nutrition International, USA)를 오리엔트바이오(한국)로부터 공급받아 사용하였고, 물은 지하수를 자외선 살균기 및 미세여과장치로소독한 후 물병을 이용하여 자유섭취시켰다. 또한 본시험은 켐온의 동물실험윤리위원회의 승인하에 실시하였다.
- 수 랫드 각 75마리를 중앙실험동물(한국)로부터 제공받았고, 12 일간의 검역과 순화 과정을 거쳐 건강한 동물 암.수 각각 60마리를 선발하여 시험에 사용하였다.
- 5 주령 의 특정병 원체 부재(specific pathogen-free, SPF) Fischer 344/N(F344/N) 암.수 랫드 각 75마리를 중앙실험동물(한국)로부터 제공받았고, 12 일간의 검역과 순화 과정을 거쳐 건강한 동물 암.수 각각 60마리를 선발하여 시험에 사용하였다.
- 시험 전 기간 동안 동물은 온도 23 ±3℃, 상대습도 55 士 15%, 환기횟수 10~20 히/h, 조명 12 h cycle, 조도 150300 Lux로 설정되어 있는 켐온 전임상연구소(한국) 실험동물 실에 수용하였으며, 동물은 적량의 깔짚을 담은 폴리카보네이트 사육상자(235 W X 380 L X 175 H mm) 에사육하였고, 사육상자는 시험번호 및 동물번호를 기입한 라벨지를 부착하여 식별하였다.
- 시험군은 선발된 암수 각 60마리를 각 군당 암수 각 10마리씩 총 6개 군으로 군간 체중이 고르게 분배하였다. 투여개시시의 평균체중은 수컷은 132.
- 혈액응고시간 검사는 부검 일에 prothrombin time 및 active partial thromboplastin time 을 혈액응고시간 검사장치(CA-50; Sysmex, Japan)를 이용하여 측정하였다. 혈액응고시간 검사용 항응고제는 3.2% sodium citrate 용액을 사용하였다.
데이터처리
- 체중, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 장기중량에 대하여 oneway ANOVA test로 유의성을 확인한 다음,유의성이 있으면 Levene test로 등분산성을 검정하였다. 사후검정으로 등분산일 경우에는 Duncan multiple range test를, 이 분산일 경우에는 Dunnett, s /-test를 이용하여 부형제 투여군과의 유의성을 검정하였다. 요검사 결과에 대해서는 칙도변환을 실시하여 Kruskal-Wallis nonparametric analysis 후, 유의성이 인정뇌면 Wilcoxson-Mann-Whitney rank-sum test를 직용하여 부형제 투여군과의 유의성을 확인하였다.
- 사후검정으로 등분산일 경우에는 Duncan multiple range test를, 이 분산일 경우에는 Dunnett, s /-test를 이용하여 부형제 투여군과의 유의성을 검정하였다. 요검사 결과에 대해서는 칙도변환을 실시하여 Kruskal-Wallis nonparametric analysis 후, 유의성이 인정뇌면 Wilcoxson-Mann-Whitney rank-sum test를 직용하여 부형제 투여군과의 유의성을 확인하였다. 요색조는 Fischer's exact test를 직용하였다.
- 1 을 이용하였다. 체중, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 장기중량에 대하여 oneway ANOVA test로 유의성을 확인한 다음,유의성이 있으면 Levene test로 등분산성을 검정하였다. 사후검정으로 등분산일 경우에는 Duncan multiple range test를, 이 분산일 경우에는 Dunnett, s /-test를 이용하여 부형제 투여군과의 유의성을 검정하였다.
- 투여군 간의 비교에는 모수직인 다중비교(parametric multiple comparison procedures) 흑은 비모수직인 다중비 j2.(nonparametric multiple comparison procedures)를 사용하였으며, 통계학적 분석은 상용으로 널리 사용되고 있는 통계 패키지인 SPSS 10.1 을 이용하였다. 체중, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 장기중량에 대하여 oneway ANOVA test로 유의성을 확인한 다음,유의성이 있으면 Levene test로 등분산성을 검정하였다.
이론/모형
- 본 연구는 국립독성연구원 KNTP 독성시험 프로토콜 [1] 및 식품의약품안전청 의약품등의독성시험기준 [2] 에따라 수행하였으며 , 식품의약품안전청 비 임상시험관리기준 [3]을 준수하였다.
- 요검사 결과에 대해서는 칙도변환을 실시하여 Kruskal-Wallis nonparametric analysis 후, 유의성이 인정뇌면 Wilcoxson-Mann-Whitney rank-sum test를 직용하여 부형제 투여군과의 유의성을 확인하였다. 요색조는 Fischer's exact test를 직용하였다.
성능/효과
- 01), ALT는 유의한 감소0.05) 를 나타내었으며, 암컷의 경우, triglyceride?} 2,000 mg/ kg/day 투여군에서 유의한 감소(p< 0.05), BUB이 333 ㎎/㎏/day 투여군에서 유의한 증가0 < 0.05)를 나타내었다(Table 3).
- 금은화 추출물의 F344/N 랫드에서의 90일간 반복 경구투여는 암수 모두에서 경미한 체중증가억제경향이 있었으나 독성학적으로 유해한 변화는 아닌 것으로 판단되었고, 기타 사망률, 일반증상, 안검사, 요검사, 혈액학 및 혈액생화학적 검사, 부검소견, 조직병리학적 검사, 성주기 및 정자 검사 등 모든 검사항목에서 독성학적으로 유해한 변화는 관찰되지 않았다.
- 따라서 금은화 추출물의 90일간 반복 경구투여 독성 시 험에서의 무관찰부작용량은 암수 모두 2,000 ㎎/㎏/day 이상으로 판단하였으며, 표적장기는 확인되지 않았다.
- 망상직혈구가 111, 333 및 1,000 ㎎/㎏/day 투여군 수컷에서 유의한 증가3 < 0.05)를 나타내었을 뿐 기타 모든 검사항목에서 시험물질 투여와 관련된 일관성 있는 변화는 없었으며(Table 2), 혈액응고시간 검사 결과에서도 시험물질의 투여와 관련된 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
- 조직병리학적 검사 소견은 Table 6에 나타내었다. 부형제 투여군 및 시험물질 투여군에서 폐의 혈관주위염증세포침윤(perivascular inflammatory cell infiltration) 및 간질 성 폐렴 (interstitial pneumonia), 심 장의 심근염 (myocarditis), 가슴샘의 충혈 (congestion), 음경 꺼풀 샘의 만성 염증(chronic inflammation), 신장의 호염기성세뇨관 (basophilic tubules), 대동맥의 동맥주위 염 (periarteritis), 고환의 위축(atrophy), 신장, 의 무* 기질침착 (mineralization), 난소의 편측성 황체낭포(lutcal cyst), 자궁의 자궁유수증 (hydrometra), 림프절의 동 및 피질안 적혈구(erythrocytes in the sinuses and within the cortex), 황체의 공포변성(vacuolar degeneration), 뇌하수체의 낭포형성 (cyst formation) 등이 용량상관성이 없이 낮은 빈도로 산발적으로 관찰되었다.
- 수컷의 경우, pH가 1,000 및 2,000 ㎎/㎏/day 투여군에서(P<0.01), 백혈구(p<0.05), 케톤체(p<0.이)는2, 000 ㎎/㎏/day 투여군에서 유의한 증가를 나타내었고, 암컷은 단백질이 2,000 ㎎/㎏/day 투여군에서 유의한 증가 (p<0.이)를 나타내었다{Table 1).
- 수컷의 좌측 고환에서 정자두부수 검사 및 우측의 부고환에서 정자의 운동성 검사 결과, 시험물질 투여에 의한 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
- 시험결과 모든 시험군에서 사망동물은 관찰되지 않았고, 안검사, 혈액응고시간 검사, 정자검사 및 성주기검사에서의 이상소견은 관찰되지 않았다. 일반증상에서 실험 기간 동안 일부 동물에서 관찰된 연변, 설사 및 하복부 오염은 발생빈도가 낮고 증상의 정도가 경미하였으며, 용량상관성이 없이 산발적으로 관찰된 변화로서 시험물질의 투여와 무관한 우발적인 변화로 판단하였다.
- 암컷 동물의 부검 전 12일간의 성주기 검사 결과, 시험물질 투여에 의한 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
- 또한 수컷에서 관찰된 신장의 호염기성세뇨관, 심장에서의 심근염, 음경꺼풀샘의 만성 염증세포침윤, 암컷 동물의 신장에서 세뇨관내 무기질침착, 음핵샘의 만성염증, 소견은 나이든 랫드에서 자연발생하는 병변 [4, 10, 20]으로서 발생빈도가 낮고, 병변의 정도가 경미하며, 대조군과의 비교에 근거하여 유의한 차이를 느낄 수 없어 시험물질과는 무관한 것으로 판단하였다. 암컷 시험물질 투여군에서 나타난 자궁수유증은 성주기단계에 의한 변화 (발정전기 또는 발정기)로 추측되어 시험물질과 무관한 것으로 판단하였다. 기타 갑상선, 가슴샘, 림프절, 뇌하수체, 하더씨샘, 간장 및 황체 등에서의 변화는 병변의 정도가 경미하고, 발생빈도도 낮아 우발적인 변화로 판단하였다.
- 요검사 결과, 1,000 및 2,000 ㎎/㎏/day 투여군 수 컷에서의 요 pH 및 백혈구수의 유의한 증가와 2,000 mg/ kg/day 투여군 수컷에서의 케톤체의 유의한 증가 및 2, 000 ㎎/㎏/day 투여군 암컷에서의 PRO의 유의한 증가는 고용량 군에서만 관찰되어 시험물질의 투여와 관련된 변화로 생각되었지만 신장의 조직병리학적 변화, 혈액학 및 혈액 생화학적 검사 등 관련 검사항목에서 특기할만한 이상소견이 관찰되지 않았던 바 독성학적으로 의미 있는 변화로 판단할 수 없었다.
- 이상소견은 관찰되지 않았다. 일반증상에서 실험 기간 동안 일부 동물에서 관찰된 연변, 설사 및 하복부 오염은 발생빈도가 낮고 증상의 정도가 경미하였으며, 용량상관성이 없이 산발적으로 관찰된 변화로서 시험물질의 투여와 무관한 우발적인 변화로 판단하였다.
- 장기중량 측정에서 111 ㎎/㎏/day 투여군 암컷의 가슴샘의 절대 및 상대중량과 폐의 절대중량의 유의한 증가는 용량상관성이 없는 변화로서 시험물질에 의한 변화는 아닌 것으로 판단하였다.
- 있는 체중증가억제경향이 관찰되었다. 즉 수컷은 관찰 최종주의 체중이 시험물질 투여군 모두에서 부형제 투여군에 비하여 약 5-10 g의 체중감소를 보였으나 통계학 직인 유의성은 없었으며, 암컷은 2,000 ㎎/㎏/day 투여군에서 투여 8, 11, 12 주째의 체중이 부형제 투여군에 비하여 유의한 감소(P < 0.05)를 나타내었으나 모두 12 g 이내로 큰 차이는 보이지 않있다(Fig. 1).
- 체중변화에서 시험기간 동안 시험물질 투여군 암수 모두 용량상관성 있는 체중증가억제경향을 나타내어 시험물질의 투여가 시험계의 체중변화에 영향을 미치는 것으로 사료되었다. 그러나 체중감소의 폭이 부형제 투여군에 비하여 암수 모두 약 6% 이내로 큰 차이를 보이지 않았고, 일반증상이나 기타 측정항목에서 시험물질의 독성과 관련될만한 특이한 변화가 관찰되지 않아 독성학적으로 의미 있는 변화로 보기 어려웠다.
- 혈액 학적 검사에서 111, 333 및 1,000 ㎎/㎏/day 투여군 수컷에서의 망상적혈구의 유의한 증가 및 혈액 생화학적 검사에서 1,000 ㎎/㎏/day 투여군 수컷에서의 creatinine의 유의한 증가와ALT의 유의한 감소, 2,000 mg/ kg/day 투여군 암컷에서의 TG의 유의한 감소, 333 mg/ kg/day 투여군 암컷에서의 BUN의 유의한 증가 등은 모두 그 변화의 폭이 크지 않고, 용량상관성이 없어 우발적인 변화로 판단하였다.
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