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문제 정의
- plantarum AF1을 가지고 천연항균제로서 사용 적합성 및 안정성을 평가하고자 Lb. plantarum AF1을 SD 계통의 흰쥐에게 4주간 반복 경구투여를 통하여 장기투여에 의한 안전성을 확인하고자 식품의약품안전청의 의약품 등의 독성시험기준에 따라 실시하였다. SD 계열의 암수 흰쥐에 시험물질을 0, 500, 1,000 및 2,000 mg/kg/day의 용량으로 4주간 반복 경구투여한 후 사망률, 일반증상, 체중변화, 사료 섭취량, 수분섭취량, 혈액학적 및 혈액생화학적 변화, 부검 소견 및 장기무게의 변화를 관찰하였다.
제안 방법
- plantarum AF1을 SD 계통의 흰쥐에게 4주간 반복 경구투여를 통하여 장기투여에 의한 안전성을 확인하고자 식품의약품안전청의 의약품 등의 독성시험기준에 따라 실시하였다. SD 계열의 암수 흰쥐에 시험물질을 0, 500, 1,000 및 2,000 mg/kg/day의 용량으로 4주간 반복 경구투여한 후 사망률, 일반증상, 체중변화, 사료 섭취량, 수분섭취량, 혈액학적 및 혈액생화학적 변화, 부검 소견 및 장기무게의 변화를 관찰하였다. 모든 시험군에서 시험기간 시험물질로 인한 일반증상 및 사망동뮬이 관찰되지 않았다.
- Sprague-Dawley(SD) 계통의 특정병원균 부재 암수 흰쥐 각각 5주령 40마리를 중앙실험동물(주)(Seoul, Korea)로부터 구입하여 공급처에서 제공한 시험계의 병원체 검사 성적서를 참고로 하여 입수동물의 검수검역을 실시하였다. SD 계통 흰쥐는 전 세계적으로 반복 투여독성 등의 시험에 널리 사용하고 있어 비교할 만한 시험 기초자료(22-24)가 축적되어 선택하였다.
- 배양한 Lb. plantarum AF1을 4,000rpm에서 15분간 원심분리한 후 배양액중의 균체를 회수하여 시료로 사용하였다.
- 그 다음 파라핀 포매를 실시하고 3～4 μm의 절편을 준비하여 Hematoxylin & Eosin 염색을 실시하였다.
- 모든 동물에 대하여 시료물질 투여 직전 및 투여 후 4주 동안에 매 주마다 일정한 시간에 1회 측정하였다. 사료섭취량 및 수분섭취량은 매주 3회 측정하여 산출하였다.
- 모든 실험동물의 최종 부검일에 시료물질을 투여한 모든 실험동물의 육안적 병변을 관찰한 후, 심장, 폐장, 간장, 비장, 신장, 뇌, 뇌하수체, 고환, 부고환, 난소, 자궁, 전립선, 부 신, 가슴샘, 위, 췌장, 십이지장, 공장, 회장, 맹장, 결장, 직장, 타액선, 임파절, 대퇴근, 좌골신경, 피부, 전립샘 등을 적출하 여 고환, 부고환 및 소화기 각 부위는 Boulin액에 고정하였 고, 나머지는 10% 중성완충포르말린 용액으로 고정하였다. 또한 안구는 Davidson액에 고정하였다.
- 부검 당일 채혈한 혈액을 3,000 rpm에서 20분간 원심분리해서 얻은 혈청에 대하여 혈액생화학적 검사를 자동분석기 (Hitachi-747, Hitachi Medical., Tokyo, Japan)를 사용하여 알라닌 아미노기전이효소(alanine transaminase, ALT), 아 스파라진산 아미노기전이효소(asparate transaminase, AST), 아스파라진산 아미노기전이효소(alkaline phosphatase, ALP), 포도당(glucose, GLU), 요소(blood urea nitrogen, BUN), 총 콜레스테롤(total cholesterol, TC), 중성지질(triglyceride, TG), 총 단백질(total protein, TP), 알부민(albumin) 및 크레아티닌(creatinine, CRE)을 측정하였다.
- 부검 전 12시간 절식시킨 동물을 CO2로 가볍게 마취시킨후 복대정맥으로부터 전 채혈하여 얻은 혈액의 일부를 EDTA 로 항응고 처리한 tube에 넣어 보관한 다음 1시간 이내에 자동혈액측정기(MEK-6318J/K, Nihon Kohden, Tokyo, Japan)를 이용하여 총 적혈구수(red blood cells, RBC), 혈중적혈구 비율(hematocrit, HCT), 헤모글로빈 함량(hemoglobin, Hb), 평균 적혈구 용적(mean corpuscular volume, MCV), 평균 적혈구 혈색소량(mean corpuscular hemoglobin, MCH), 평균 적혈구 혈색소 농도(mean corpuscular hemoglobin concentration, MCHC), 혈소판(platelets), 망상적혈구수(reticulocytes), 총 백혈구수(white blood cells, WBC), 호중구(neutrophils), 호산구(eosinophils), 호염기구(basophils), 림프구(lymphocytes) 및 단핵구(monocytes)의 백분율을 측정하였다.
- 모든 동물에 대하여 시료물질 투여 직전 및 투여 후 4주 동안에 매 주마다 일정한 시간에 1회 측정하였다. 사료섭취량 및 수분섭취량은 매주 3회 측정하여 산출하였다.
- 시료물질 투여 후 28일째까지 생존한 동물은 CO2로 마취시킨 후 방혈 치사시킨 다음 부검하여 육안적 외부소견, 피하, 내부 장기 및 뇌의 이상 유무를 관찰한 후, 장기를 적출한 다음 무게를 측정하였다.
- 시험동물은 온도 23±1 ℃, 상대습도 55±5%, 환기 회수는 시간당 10～18회, 조명은 12시간 명암주기(08:00～20:00), 조도는 300～50 Lux의 사육환경에서 스테인리스 스틸케이지에 1마리씩 암수 각각 넣어 4주간 사육하였다.
- 시험물질 투여 당일은 경구투여 후 6시간까지 계속적으로 관찰하였고, 투여 다음 날부터 모든 실험동물에 대하여 매일 1회 이상씩 일반상태의 변화, 중독 증상발현, 사망동물의 유무 및 시험물질 투여 후 시험물질에 의하여 나타날 가능성이 있는 증상에 대하여 주의하여 관찰하였으며(25), 이상이 있었던 경우는 증상의 종류, 발견 및 증상의 정도를 개별적으로 기록하였다. 모든 동물에 대하여 매일 폐사나 빈사상태를 살폈다.
- plantarum AF1는 투여 용량을 고려하여 주사용 멸균증류수에 각 농도 별로 용해하여 사용하였다. 시험물질의 투여는 투여 개시 전에잘 현탁 시킨 다음 매일 1회 4주간 경구투여용 존데를 사용 하여 위 내에 직접 주입하였으며, 대조물질로는 주사용 멸균 증류수를 사용하였다.
- 실험동물은 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물에 대하여 체중을 측정하고 평균체중에 가까운 개체를 선택하여 무작위법을 이용, 군 분리를 실시하였다. 투여 용량은 미국 환경보호청(US Environmental Protection Agency)에서 무해 물질 분류 기준에 근거하여 설정하였다.
- 투여 용량은 미국 환경보호청(US Environmental Protection Agency)에서 무해 물질 분류 기준에 근거하여 설정하였다. 투여용량 설정은 예비 독성시험 결과를 바탕으로 하였으며, 반복투여 독성시험에서 시험물질의 독성이 매우 적고 중독량을 정하기가 어려운 경우 투여량의 상한선은 기술적으로 투여할 수 있는 최대량으로 하는 것이 기본이어서, 암수 모두 최고 용량을 2,000 mg/kg/day로 하고, 등비를 1/2로 하여 체중 kg당 500, 1,000 및 2,000 mg올 설정하여 저 용량군, 중간 용량군 및고 용량군으로 설정하였다. 각 군의 동물 수는 암수 각각 10마리씩으로 하였다.
대상 데이터
- Sprague-Dawley(SD) 계통의 특정병원균 부재 암수 흰쥐 각각 5주령 40마리를 중앙실험동물(주)(Seoul, Korea)로부터 구입하여 공급처에서 제공한 시험계의 병원체 검사 성적서를 참고로 하여 입수동물의 검수검역을 실시하였다. SD 계통 흰쥐는 전 세계적으로 반복 투여독성 등의 시험에 널리 사용하고 있어 비교할 만한 시험 기초자료(22-24)가 축적되어 선택하였다. 실험 전 7일간의 순화사육 기간 동안에 임상관찰 등을 시행하여 체중감소가 없는 건강하고 정상적인 동물만 시험에 사용하였다.
- 시험 유산균주는 광주광역시와 전라남도 등지에서 수집한 잘 익은 배추김치에서 분리한 것으로 조선대학교 식품영양학과 식품미생물실험실에서 항진균 및 항세균 활성이 우수하다고 알려진 유산균주인 Lb. plantarum AF1을 선별하여 실험에 사용하였다(12,13). 유산균 성장배지는 MRS(Difco laboratories, Detroit, MI, USA)의 액체를 사용하였으며, 배양조건은 30℃ incubator(Vision Co.
- 투여용량 설정은 예비 독성시험 결과를 바탕으로 하였으며, 반복투여 독성시험에서 시험물질의 독성이 매우 적고 중독량을 정하기가 어려운 경우 투여량의 상한선은 기술적으로 투여할 수 있는 최대량으로 하는 것이 기본이어서, 암수 모두 최고 용량을 2,000 mg/kg/day로 하고, 등비를 1/2로 하여 체중 kg당 500, 1,000 및 2,000 mg올 설정하여 저 용량군, 중간 용량군 및고 용량군으로 설정하였다. 각 군의 동물 수는 암수 각각 10마리씩으로 하였다. 투여 용량은 경구투여 시 10 g당 0.
- 시험동물은 온도 23±1 ℃, 상대습도 55±5%, 환기 회수는 시간당 10～18회, 조명은 12시간 명암주기(08:00～20:00), 조도는 300～50 Lux의 사육환경에서 스테인리스 스틸케이지에 1마리씩 암수 각각 넣어 4주간 사육하였다. 사료는 실험동물용 고형사료(Jeilfeed Co., Daejeon, Korea)를 자유 급여하였으며, 음수는 여과된 정제수를 자유 섭취시켰다.
- SD 계통 흰쥐는 전 세계적으로 반복 투여독성 등의 시험에 널리 사용하고 있어 비교할 만한 시험 기초자료(22-24)가 축적되어 선택하였다. 실험 전 7일간의 순화사육 기간 동안에 임상관찰 등을 시행하여 체중감소가 없는 건강하고 정상적인 동물만 시험에 사용하였다. 시험동물은 온도 23±1 ℃, 상대습도 55±5%, 환기 회수는 시간당 10～18회, 조명은 12시간 명암주기(08:00～20:00), 조도는 300～50 Lux의 사육환경에서 스테인리스 스틸케이지에 1마리씩 암수 각각 넣어 4주간 사육하였다.
데이터처리
- 본 실험에서 얻은 결과는 SPSS 12.0 P/C package(Statistical Package for Social Science, SPSS Inc., New York, NY, USA)를 이용하여 실험군당 평균과 표준오차를 계산하였고, 일원배치분산분석(one way, ANOVA)을 실시하였으며, 사후검정은 Tukey's test에 의하여 실행하였다.
이론/모형
- plantarum AF1을 천연항균제로의 개발을 위한 기초자료를 제공하고자 먼저 안정성 평가의 일환으로 반복 투여 시 나타날 수 있는 독성평가를 위해 Sprague-Dawley 계열 흰쥐를 이용하여 4주간 반복독성시험을“의약품 등의 독성시험 기준(식품의약품안정청고시 제 1999-61호)”에 준하여 실시하였다.
- 실험동물은 순화기간 중 건강하다고 판정된 동물에 대하여 체중을 측정하고 평균체중에 가까운 개체를 선택하여 무작위법을 이용, 군 분리를 실시하였다. 투여 용량은 미국 환경보호청(US Environmental Protection Agency)에서 무해 물질 분류 기준에 근거하여 설정하였다. 투여용량 설정은 예비 독성시험 결과를 바탕으로 하였으며, 반복투여 독성시험에서 시험물질의 독성이 매우 적고 중독량을 정하기가 어려운 경우 투여량의 상한선은 기술적으로 투여할 수 있는 최대량으로 하는 것이 기본이어서, 암수 모두 최고 용량을 2,000 mg/kg/day로 하고, 등비를 1/2로 하여 체중 kg당 500, 1,000 및 2,000 mg올 설정하여 저 용량군, 중간 용량군 및고 용량군으로 설정하였다.
성능/효과
- 전 시험기간 동안 체중의 변화는 암수 흰쥐 모두대조군과 항세균 및 항진균 활성 기능을 지니고 있는 유산균인 Lb. plantarum AF1 저(500 mg/kg/day), 중(1,000 mg/kg/day) 및 고(2,000 mg/kg/day) 용량 투여군 모두에서 유의할 만한 체중 변화는 관찰되지 않았다. 또한 시험물질 투여일로부터 시험 종료 시까지 대조군과 시료 투여군 모두 매주 간 체중의 고른 증가율을 보였으며, 대조군을 포함한 모든 시험군에서 4주간 암컷은 75 g, 수컷은 150 g 정도 내외의 정상적인 체중이 증가되는 현상을 보였다.
- 다만 수컷의 경우 Lb. plantarum AF1 투여용량이 증가할수록 혈장 중 총 콜레스테롤과 중성지방 함량은 용량 의존적으로 감소하는 경향이었으나 유의차는 없었다. 유산균의 생리활성 기능 중 담즙산 탈포합 활성을 갖는 균주를 분리하여 혈중 콜레스테롤 함량을 저하시킬 수 있는 기능성식품으로의 개발을 시도하고자 다양한 선행연구가 진행되어 이중 Lb.
- plantarum AF1을 저(500 mg/kg/ day), 중(1,000 mg/kg/day) 및 고(2,000 mg/kg/day) 용량으로 암수 각각의 흰쥐에게 4주간 반복 투여 후 장기무게를 측정한 결과는 Table 7과 같다. 뇌(brain), 폐(lung), 고환(testis), 난소(ovary), 좌우 신장(kidney), 심장(heart), 췌장(spleen) 및 간(liver)의 무게는 암수 모두 시료물질 투여에 의한 차이가 발견되지 않았으며, 투여 용량 의존적인 이상 변화도 관찰되지 않았다. 독성이 있는 물질이 섭취가 되면 가장 먼저 간에서 해독작용이 일어나 간이 가장 큰 영향을줄 수 있는데(28), 간의 무게를 살펴보면 각 군 간에 유의할 만한 차이점이 보이지 않았다.
- plantarum AF1 저(500 mg/kg/day), 중(1,000 mg/kg/day) 및 고(2,000 mg/kg/day) 용량 투여군 모두에서 유의할 만한 체중 변화는 관찰되지 않았다. 또한 시험물질 투여일로부터 시험 종료 시까지 대조군과 시료 투여군 모두 매주 간 체중의 고른 증가율을 보였으며, 대조군을 포함한 모든 시험군에서 4주간 암컷은 75 g, 수컷은 150 g 정도 내외의 정상적인 체중이 증가되는 현상을 보였다. 최근 유산균중 Lb.
- plantarum AF1의 4주간의 경구투여 결과 체중이 지속적으로 증가되었지만 대조군과 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았다. 또한 혈액학적, 혈액 생화학적 검사, 장기의 육안적 관찰, 장기 중량변화 및 조직 병리학적 소견에서도 모든 시험물질 투여군이 대조군과 유의성이 있는 차이를 보이지 않았으며, 모두 정상 범위를 벗어나지 않아 시험물질에 기인하는 이상 소견을 발견할 수없었다. 이상의 결과로 보아 4주 반복투여 독성시험 결과 항진균 및 항세균 활성을 지닌 유산균인 Lb.
- SD 계열의 암수 흰쥐에 시험물질을 0, 500, 1,000 및 2,000 mg/kg/day의 용량으로 4주간 반복 경구투여한 후 사망률, 일반증상, 체중변화, 사료 섭취량, 수분섭취량, 혈액학적 및 혈액생화학적 변화, 부검 소견 및 장기무게의 변화를 관찰하였다. 모든 시험군에서 시험기간 시험물질로 인한 일반증상 및 사망동뮬이 관찰되지 않았다. 전 시험기간 동안 Lb.
- 부검 후 혈구 측정기를 이용하여 백혈구수(WBC), 적혈구수(RBC), 혈색소량(Hb), 헤마토크리트치(HCT), 총 적혈구수(red blood cells, RBC), 평균 적혈구 용적(MCV), 평균 적혈구 혈색소량(MCH), 평균 적혈구 혈색소 농도(MCHC), 혈소판(platelets), 망상적혈구수(reticulocytes), 호중구(neutrophils), 호산구(eosinophils), 호염기구(basophils), 림프구(lymphocytes) 및 단핵구(monocytes)의 백분율을 측정한결과, Table 8에서와 같이 암수 모두 시험물질 투여군과 대조군 간에는 유의성 있는 변화가 관찰되지 않았다. 혈액학적 검사 결과 대조군과 시료투여군 모두 정상 범위에 속하였으며, 용량 의존성도 보이지 않았다.
- plantarum AF1을 암수 흰쥐에게 4주간 경구투여한후 사망률과 일반증상을 관찰한 결과는 Table 1과 2와 같다. 식품의약품안전청의 독성시험기준을 참고하여 전 시험시간 동안 실험동물을 매일 일정한 시간에 관찰한 결과 사망동물은 관찰되지 않았다(Table 1). 또한 Table 2에서와 같이 시험기간 동안 암수 흰쥐 모두 대조군을 포함한 실험물질 저 (500 mg/kg/day), 중(1,000 mg/kg/day) 및 고(2,000 mg/kg/ day) 용량 투여군 모두에서 유의할 만한 이상증상이 관찰되지 않았다.
- 실험동물을 부검 후 주요 장기의 육안적 소견을 관찰한 결과 Table 6에서와 같이 암수 흰쥐 모두 대조군과 시험물질 투여군에서 장기의 유의성 있는 변화나 시험물질의 투여로 인한 용량 의존적인 특이할 만한 부검소견은 관찰되지 않았다.
- 또한 혈액학적, 혈액 생화학적 검사, 장기의 육안적 관찰, 장기 중량변화 및 조직 병리학적 소견에서도 모든 시험물질 투여군이 대조군과 유의성이 있는 차이를 보이지 않았으며, 모두 정상 범위를 벗어나지 않아 시험물질에 기인하는 이상 소견을 발견할 수없었다. 이상의 결과로 보아 4주 반복투여 독성시험 결과 항진균 및 항세균 활성을 지닌 유산균인 Lb. plantarum AF1은 저독성 물질로 판정되었으며, 안전성 확인을 통하여 천연항균제로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
- 또한 Table 2에서와 같이 시험기간 동안 암수 흰쥐 모두 대조군을 포함한 실험물질 저 (500 mg/kg/day), 중(1,000 mg/kg/day) 및 고(2,000 mg/kg/ day) 용량 투여군 모두에서 유의할 만한 이상증상이 관찰되지 않았다. 이와 같이 경구투여 독성 한계 용량인 2,000 mg/kg/day에서 시험물질에 의한 이상 증상이 관찰되지 않았음은 SD계통의 흰쥐에서 본 시험물질의 최소치사량이 암수 모두 2,000 mg/kg/day 이상을 상회할 것으로 보인다.
후속연구
- 이상의 결과로 보아 4주 반복투여 독성시험 결과 항진균 및 항세균 활성을 지닌 유산균인 Lb. plantarum AF1은 저독성 물질로 판정되었으며, 안전성 확인을 통하여 천연항균제로의 개발이 가능할 것으로 사료된다.
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