LC-MS/MS를 이용하여 신속하고 정확한 혈장 중 레르카니디핀의 분석법을 개발하고 이 분석법에 대한 검증을 수행하였다. 혈장에 내부표준물질로 사용한 암로디핀을 첨가한 후 아세토니트릴로 단백질을 침전시키고, 그 상층액을 취하여 건조시킨 후 50 % 아세토니트릴로 재용해하여 LC-MS/MS로 분석하였다. MS/MS의 MRM (multiple reaction monitoring) 방법을 이용하여 혈장 중 레르카니디핀을 어떠한 분석의 방해물 없이 선택적으로 검출할 수 있었다. 레르카니디핀의 표준 검량선은 0.05-20 ng/mL의 농도 범위에서 우수한 직선성(r = 0.9994)을 보였으며, 일내, 일간 재현성은 변동계수 11.7% 이하, 정확성은 94.4-114.8%로 레르카니디핀의 약물동력학적 연구에 적용되기에 충분한 감도와 특이성, 직선성, 정밀성 및 정확성을 가지고 있음을 확인하였다.
LC-MS/MS를 이용하여 신속하고 정확한 혈장 중 레르카니디핀의 분석법을 개발하고 이 분석법에 대한 검증을 수행하였다. 혈장에 내부표준물질로 사용한 암로디핀을 첨가한 후 아세토니트릴로 단백질을 침전시키고, 그 상층액을 취하여 건조시킨 후 50 % 아세토니트릴로 재용해하여 LC-MS/MS로 분석하였다. MS/MS의 MRM (multiple reaction monitoring) 방법을 이용하여 혈장 중 레르카니디핀을 어떠한 분석의 방해물 없이 선택적으로 검출할 수 있었다. 레르카니디핀의 표준 검량선은 0.05-20 ng/mL의 농도 범위에서 우수한 직선성(r = 0.9994)을 보였으며, 일내, 일간 재현성은 변동계수 11.7% 이하, 정확성은 94.4-114.8%로 레르카니디핀의 약물동력학적 연구에 적용되기에 충분한 감도와 특이성, 직선성, 정밀성 및 정확성을 가지고 있음을 확인하였다.
Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method has been developed and validated for the quantitative determination of lercanidipine in human plasma. After addition of internal standard (amlodipine), plasma was precipitated with acetonitrile and the supernatant was evaporated. The r...
Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method has been developed and validated for the quantitative determination of lercanidipine in human plasma. After addition of internal standard (amlodipine), plasma was precipitated with acetonitrile and the supernatant was evaporated. The residues were dissolved in 50 % acetonitrile and analyzed by LC-MS/MS. Using MS/MS with multiple reaction monitoring(MRM) mode, lercanindipine were selectively detected without severe interference from human plasma. The standard calibration curve for lercanidipine was linear (r = 0.9994) over the concentration range 0.05-20.0 ng/mL in human plasma. The intra- and inter-day precision over the concentration range of lercanidipine was lower than 11.7 % (correlation of variance, CV), and accuracy was between 94.4-114.8 %. This method has been successfully applied to the pharmacokinetic study of lercanidipine in human plasma.
Liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method has been developed and validated for the quantitative determination of lercanidipine in human plasma. After addition of internal standard (amlodipine), plasma was precipitated with acetonitrile and the supernatant was evaporated. The residues were dissolved in 50 % acetonitrile and analyzed by LC-MS/MS. Using MS/MS with multiple reaction monitoring(MRM) mode, lercanindipine were selectively detected without severe interference from human plasma. The standard calibration curve for lercanidipine was linear (r = 0.9994) over the concentration range 0.05-20.0 ng/mL in human plasma. The intra- and inter-day precision over the concentration range of lercanidipine was lower than 11.7 % (correlation of variance, CV), and accuracy was between 94.4-114.8 %. This method has been successfully applied to the pharmacokinetic study of lercanidipine in human plasma.
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문제 정의
따라서, 본 연구에서는 기존 분석법의 단점을 개선하고, 많은 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 레르카니디핀의 생체시료 분석법을 개발하였다. 이 분석법은 이미 보고된 분석법에 비교하여 시료 전 처리가 간단하고, 낮은 정량한계를 가지며, 생체시료 분석법으로서의 양호한 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 나타내었다.
본 연구에서는 LC-MS/MS를 이용하여 보다 시료 전처리가 간편하고, 높은 감도와 짧은 분석시간을 갖는 레르카니디핀의 생체시료 분석법을 확립하였으며, 이 분석법에 대한 검증 (validation) 을 실시하였다. 본 분석법을 혈장 중의 레르카니디핀 정량 및 한국인을 대상으로 한 약물동력학 연구에 성공적으로 적용하여 약물 동력학적 파라미터를 제시하였으며, 향후 임상시험 등의 관련분야에도 적용될 수 있으리라 사료된다.
제안 방법
19-30세 사이의 건강한 남자 지원자 36 명에게 20 mg 의 염산레르카니디핀을 240 mL 의 물과 함께 경구 투약하였다. 채혈시간은 반감기의 3 배 이상인 36 시간 동안으로 하였고, 채혈 횟수는 약물투약 직전과 투약 후 0.
MRM 방법을 이용한 레르카니디핀과 내부표준물질인 암로디핀의 precursor ione 각각 m/z 612와 409의 수소화된 분자이온 ([M+H]+) 을 사용하였으며, 생성된 product ion으로 m/z 280과 238을 각각 모니터링 하였다.
각 피험자의 혈장 중 레르카니디핀의 정량을 위하여 , 시간별로 채취 하여 영 하 70 ℃에 보관했던 혈장 시료를 실온에 방치하여 녹인 후, 3 초간 진탕한 다음이 혈장 300 μL 를 취하고, 위 검량선 작성시와 동일한 방법으로 처리하였다. 얻어진 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 레르카니디핀의피크 면적비를 구하여 미리 작성한 검량 선으로부터 혈장 중 레르카니디핀의 농도를 구하였다.
건강한 성인 혈장 중 레르카니디핀의 분석은 이미 보고된 LC-MS/MS 분석법들을 참고하여 최적의 조건을 확립한 후 수행하였다. 전처리된 혈장 시료는 다음의 조건에서 정량하였다.
건강한 성인의 공혈장과 공혈장에 레르카니디핀과내부표준물질을 함께 가한 것 및 레르카니디핀 제제 20 mg 을 투여한 후 1.5 시간 후에 채혈한 혈장을 본시험 방법에 따라 전처리한 후, LC-MS/MS 로 분석하여 얻은 크로마토그램을 Fig. 2에 나타내었다. 레르카니디핀 피크의 유지시간은 약 2.
약물동력 학적 파리미터는 LC-MS/MS 분석 방법에 의하여 얻은 혈장 중 약물농도-시간 곡선으로부터 구하였다. 최고혈장중농도 (Cmx) 와 최고혈장중농도 도달 시간 (Tmax)은 실측치로부터 직접 구하였고, 투약 후 마지막 채혈시간인 36 시간까지의 혈장중농도-시간곡선하 면적(AUCt)은 사다리꼴 공식에 의하여 BA Calc 2002 (Ver.
방법으로 처리하였다. 얻어진 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 레르카니디핀의피크 면적비를 구하여 미리 작성한 검량 선으로부터 혈장 중 레르카니디핀의 농도를 구하였다.
여기에 50% 아세토니트릴 200 μL를 가하여 재용해 시키고, 이 중 20 μL를취하여 LC-MS/MS에 주입하였다. 여기에서 얻은 내부표준물질의 피크 면적에 대한 레르카니디핀의 피크 면적 비를 가지고 검량선을 작성하였다. 하루에 실험을 5 번 시행하여 일내 재현성과 정확성을 구하였고, 5 일간 실험을 반복 수행하여 일간 재현성과 정확성을 구하였다.
염산레르카니디핀 표준품을 메탄올에 녹여 농도를레르카니디핀으로서 1,000 μ g/mL로 만들어 냉장 보관시키고, 이 용액을 냉동 보관하였던 공혈장으로 희석하여 레르카니디핀의 혈장 중 농도가 각각 0.05, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 및 20 ng/mL 농도가 되도록 표준혈장을 만들었다. 또한 내부표준물질인 암로디핀은 메탄올에 녹여 1,000 μ g/mL 가 되도록 한 후 50% 아세토니트릴로 희석하여 2 μg/mL가 되도록 제조하여 4oC에서보관하였다.
이 분석법은 이미 보고된 분석법에 비교하여 시료 전 처리가 간단하고, 낮은 정량한계를 가지며, 생체시료 분석법으로서의 양호한 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 나타내었다. 이 분석법을 이용하여 36 명의 건강한 한국인 남성에게 염산레르카니디핀 20 mg을 투여하고, 혈장 중 레르카니디핀의 농도를 구하여 약물 동력 학연 구에 응용하였다.
검 출하였다. 이 온화는 electrospray ionization (ESI) 을 이용하여 positive ion mode로 분석하였으며, nebulizing gas 는 질소를, collision gas 는 아르곤 가스를 사용하였다. 기타 최적화된 MS/MS 분석 파라미터는 Table 1에 요약하였다.
전처리된 혈장 시료는 다음의 조건에서 정량하였다. 이동상으로는 1 mM 아세트산 암모늄 완충액과 아세토니트릴의 혼합용액(40/60, v/v)을 사용하였으며, formic acid를 전체 용액에 0.1 % 가 되도록 첨가하였다. 칼럼은 Thermo BetaBasic C18 (2.
채혈시간은 반감기의 3 배 이상인 36 시간 동안으로 하였고, 채혈 횟수는 약물투약 직전과 투약 후 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 24 및 36 시간에서 채혈하여 영하 70oC 에서 보관하였다.
최고혈장중농도 (Cmx) 와 최고혈장중농도 도달 시간 (Tmax)은 실측치로부터 직접 구하였고, 투약 후 마지막 채혈시간인 36 시간까지의 혈장중농도-시간곡선하 면적(AUCt)은 사다리꼴 공식에 의하여 BA Calc 2002 (Ver. 1.1.1, KFDA, Seoul, Korea) 프로그램을 이용하여 산출하였다.
여기에서 얻은 내부표준물질의 피크 면적에 대한 레르카니디핀의 피크 면적 비를 가지고 검량선을 작성하였다. 하루에 실험을 5 번 시행하여 일내 재현성과 정확성을 구하였고, 5 일간 실험을 반복 수행하여 일간 재현성과 정확성을 구하였다.
대상 데이터
사용하였다. HPLC 칼럼은 Thermo BetaBasic C18 (2.1x150 mm, 5 μ m, San Jose, CA, USA)을 사용하였으며, 데이터 처리장치로는 MassLynx(Vr. 4.1)를 사용하였다. 기타 장비로는 원심분리기(Micro-12, Hanil Science Industrial Co.
m/z 238과 294의 생성에 대해서 Gibbons 등19-20은 수소화된 암로디핀 ion의 molecular rearrangement mechanism 이나 retro-Diels-Alder 반응에 의하여 형성된다고 제안하였다. 각각의 product ion scan을 통해, MRM mode에서의 정량을 위한 레르카니디핀과 암로디핀의 product ion 으로 가장 감도가 큰 m/z 280과 238을 각각 선정하였다.
본 연구에 사용한 HPLC 시스템으로 Waters 2795 Alliance HT (Milfold, MA, USA) 를, 탠덤 질량분석기 (MS/MS)는 Waters Quattro Micro (Milfold, MA, USA) 를 사용하였다. HPLC 칼럼은 Thermo BetaBasic C18 (2.
Louis, MO, USA) 의 시판품을 구입하였다. 아세토니트릴과 메탄올, 물은 Fisher Scientific사 (Springfield, NJ, USA)의 HPLC급을 사용하였고, 아세트산 암모늄, formic acid 등의 기타 시약들은 특급 및 1급 시약들을 사용하였다.
염 산레르카니 디 핀 표준품은 대 원제 약(Seoul, Korea) 으로부터 제공받았으며, 내부표준물질로 사용한 암로디핀은 Sigam사(St. Louis, MO, USA) 의 시판품을 구입하였다. 아세토니트릴과 메탄올, 물은 Fisher Scientific사 (Springfield, NJ, USA)의 HPLC급을 사용하였고, 아세트산 암모늄, formic acid 등의 기타 시약들은 특급 및 1급 시약들을 사용하였다.
1 % 가 되도록 첨가하였다. 칼럼은 Thermo BetaBasic C18 (2.1x150 mm, 5 |im)을 사용하였으며 유속은 220 μL/min, 분석칼럼의 오븐 온도는 45oC 로 일정하게 하였다.
이론/모형
피크 검출은 triple-quadrupole mass spectrometer를 이용하여 MRM(multiple reaction monitoring) 방법으로 검 출하였다. 이 온화는 electrospray ionization (ESI) 을 이용하여 positive ion mode로 분석하였으며, nebulizing gas 는 질소를, collision gas 는 아르곤 가스를 사용하였다.
성능/효과
57 ng . hr/mL, Tmax는 1.0-3.0 hr, 그리고 t1/2 은 2.0-5.0 hr 인 것으로 되어 있어, 본 연구에서 산출한 약물동력학적 파라미터와 크게 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
공혈장 시료, 내부표준물질만 가한 혈장시료 및 0.05, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 및 20 ng/mL의 검량선용 표준혈장 시료를 각각 전처리한 후 LC-MS/MS 로 분석하였을 때, 혈장시료로부터 구한 레르카니디핀 검량선의 계산식은 Y (레르카니디핀/내부표준물질 피크 면적의 비율) = 0*( .220425 레르카니디핀 농도, ng/mL) + 0.00186629 (r = 0.9994) 로 0.05-20 ng/mL 범위에서 양호한 직선성을 나타내었다
이러한 고전적인 방법은 간섭물질과 피크가 겹치면 정량이 불가능하였으므로, 복잡한 시료 매트릭스에서 정량할 경우에는 이동상의 조성을 조절하여 최대한의 분리도가 유지되도록 하였다. 그 결과 1개의 시료 당 분석시간이 10-20 분 이상이 되어야 분석의 정확성과 정밀성을 확보할 수 있었다. 전임상 또는 임상시험에서 의약품의 생체이용률 연구와 약물동력학 연구를 수행하기 위해서는 수백-수천 개의 생체시료 분석 이 이루어져야 하는데, 고전적인 HPLC-UV, TLC 방법으로 분석을 하기에는 낮은 선택성과 긴 분석 시간으로 인하여 적용하기가 매우 어려웠다.
05 ng/mL이었다. 따라서, 본 분석법은 전처리 방법의 효율성 측면과 시료량에 대한 분석감도면에서 기존에 보고된 방법에 비하여 매우 향상된 결과를 나타내었다.
2에 나타내었다. 레르카니디핀 피크의 유지시간은 약 2.3 분, 내부표준물질 암로디핀의 피크의 유지시간은 약 1.8 분이었으며, MS/MS 의 높은 선택성 때문에 분석물질에 방해되는 물질은 나타나지 않았다.
3 에 나타내었다. 본 분석조건에 의해서 레르카니디핀 20 mg을 경구투여한 후 반감기의 3배 이상인 36 시간까지 레르카니디핀의 혈장 중 농도를 측정할 수 있었다. 레르카니디핀의 혈장중농도-시간곡선하 면적 (AUC)는 24.
생체시료 분석법을 개발하였다. 이 분석법은 이미 보고된 분석법에 비교하여 시료 전 처리가 간단하고, 낮은 정량한계를 가지며, 생체시료 분석법으로서의 양호한 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 나타내었다. 이 분석법을 이용하여 36 명의 건강한 한국인 남성에게 염산레르카니디핀 20 mg을 투여하고, 혈장 중 레르카니디핀의 농도를 구하여 약물 동력 학연 구에 응용하였다.
8 %이 었다(Table 2). 이로부터 혈장 중 레르카니디핀에 대한 본 LC-MS/MS 분석법은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 충분한 감도와 특이성, 직선성, 정밀성 및 정확성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
05 ng/mL로 하였다. 최저 정량한계를 포함한 검량선 농도 범위에서 레르카니디핀의일내 및 일간 변동계수 (CV) 는 11.7% 이하로 나타났고, 정 확성은 94.4-114.8 %이 었다(Table 2). 이로부터 혈장 중 레르카니디핀에 대한 본 LC-MS/MS 분석법은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 충분한 감도와 특이성, 직선성, 정밀성 및 정확성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
025 ng/mL 를 보고하였다. 하지만 본 연구에서 human plasma 시료 0.3 mL를 취하였고, 전처리로는 제단백(protein precipitation, PPT) 방식을 선택하여 LC-MS/MS로 분석한 결과, 정량한계가 0.05 ng/mL이었다. 따라서, 본 분석법은 전처리 방법의 효율성 측면과 시료량에 대한 분석감도면에서 기존에 보고된 방법에 비하여 매우 향상된 결과를 나타내었다.
후속연구
본 분석법을 혈장 중의 레르카니디핀 정량 및 한국인을 대상으로 한 약물동력학 연구에 성공적으로 적용하여 약물 동력학적 파라미터를 제시하였으며, 향후 임상시험 등의 관련분야에도 적용될 수 있으리라 사료된다.
참고문헌 (22)
C. Venkata and S. Ram, Am. J. Cardiol., 89(2), 214- 215 (2002)
A. Corsini, M. Bonfatti, P. Quarato, M. R. Accomazzo, M. Raiteri, A. Sartani, R. Testa, S. Nicosia, R. Paoletti and R. Fumagalli, J. Cardiovasc. Pharmacol., 28(5), 687-694(1996)
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