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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 기존 분석법의 단점을 개선하고, 많은 실험실에서 일반적으로 사용할 수 있는 레르카니디핀의 생체시료 분석법을 개발하였다. 이 분석법은 이미 보고된 분석법에 비교하여 시료 전 처리가 간단하고, 낮은 정량한계를 가지며, 생체시료 분석법으로서의 양호한 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 나타내었다.
- 본 연구에서는 LC-MS/MS를 이용하여 보다 시료 전처리가 간편하고, 높은 감도와 짧은 분석시간을 갖는 레르카니디핀의 생체시료 분석법을 확립하였으며, 이 분석법에 대한 검증 (validation) 을 실시하였다. 본 분석법을 혈장 중의 레르카니디핀 정량 및 한국인을 대상으로 한 약물동력학 연구에 성공적으로 적용하여 약물 동력학적 파라미터를 제시하였으며, 향후 임상시험 등의 관련분야에도 적용될 수 있으리라 사료된다.
제안 방법
- 19-30세 사이의 건강한 남자 지원자 36 명에게 20 mg 의 염산레르카니디핀을 240 mL 의 물과 함께 경구 투약하였다. 채혈시간은 반감기의 3 배 이상인 36 시간 동안으로 하였고, 채혈 횟수는 약물투약 직전과 투약 후 0.
- MRM 방법을 이용한 레르카니디핀과 내부표준물질인 암로디핀의 precursor ione 각각 m/z 612와 409의 수소화된 분자이온 ([M+H]+) 을 사용하였으며, 생성된 product ion으로 m/z 280과 238을 각각 모니터링 하였다.
- 각 피험자의 혈장 중 레르카니디핀의 정량을 위하여 , 시간별로 채취 하여 영 하 70 ℃에 보관했던 혈장 시료를 실온에 방치하여 녹인 후, 3 초간 진탕한 다음이 혈장 300 μL 를 취하고, 위 검량선 작성시와 동일한 방법으로 처리하였다. 얻어진 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 레르카니디핀의피크 면적비를 구하여 미리 작성한 검량 선으로부터 혈장 중 레르카니디핀의 농도를 구하였다.
- 건강한 성인 혈장 중 레르카니디핀의 분석은 이미 보고된 LC-MS/MS 분석법들을 참고하여 최적의 조건을 확립한 후 수행하였다. 전처리된 혈장 시료는 다음의 조건에서 정량하였다.
- 건강한 성인의 공혈장과 공혈장에 레르카니디핀과내부표준물질을 함께 가한 것 및 레르카니디핀 제제 20 mg 을 투여한 후 1.5 시간 후에 채혈한 혈장을 본시험 방법에 따라 전처리한 후, LC-MS/MS 로 분석하여 얻은 크로마토그램을 Fig. 2에 나타내었다. 레르카니디핀 피크의 유지시간은 약 2.
- 약물동력 학적 파리미터는 LC-MS/MS 분석 방법에 의하여 얻은 혈장 중 약물농도-시간 곡선으로부터 구하였다. 최고혈장중농도 (Cmx) 와 최고혈장중농도 도달 시간 (Tmax)은 실측치로부터 직접 구하였고, 투약 후 마지막 채혈시간인 36 시간까지의 혈장중농도-시간곡선하 면적(AUCt)은 사다리꼴 공식에 의하여 BA Calc 2002 (Ver.
- 방법으로 처리하였다. 얻어진 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 레르카니디핀의피크 면적비를 구하여 미리 작성한 검량 선으로부터 혈장 중 레르카니디핀의 농도를 구하였다.
- 여기에 50% 아세토니트릴 200 μL를 가하여 재용해 시키고, 이 중 20 μL를취하여 LC-MS/MS에 주입하였다. 여기에서 얻은 내부표준물질의 피크 면적에 대한 레르카니디핀의 피크 면적 비를 가지고 검량선을 작성하였다. 하루에 실험을 5 번 시행하여 일내 재현성과 정확성을 구하였고, 5 일간 실험을 반복 수행하여 일간 재현성과 정확성을 구하였다.
- 염산레르카니디핀 표준품을 메탄올에 녹여 농도를레르카니디핀으로서 1,000 μ g/mL로 만들어 냉장 보관시키고, 이 용액을 냉동 보관하였던 공혈장으로 희석하여 레르카니디핀의 혈장 중 농도가 각각 0.05, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 및 20 ng/mL 농도가 되도록 표준혈장을 만들었다. 또한 내부표준물질인 암로디핀은 메탄올에 녹여 1,000 μ g/mL 가 되도록 한 후 50% 아세토니트릴로 희석하여 2 μg/mL가 되도록 제조하여 4oC에서보관하였다.
- 이 분석법은 이미 보고된 분석법에 비교하여 시료 전 처리가 간단하고, 낮은 정량한계를 가지며, 생체시료 분석법으로서의 양호한 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 나타내었다. 이 분석법을 이용하여 36 명의 건강한 한국인 남성에게 염산레르카니디핀 20 mg을 투여하고, 혈장 중 레르카니디핀의 농도를 구하여 약물 동력 학연 구에 응용하였다.
- 검 출하였다. 이 온화는 electrospray ionization (ESI) 을 이용하여 positive ion mode로 분석하였으며, nebulizing gas 는 질소를, collision gas 는 아르곤 가스를 사용하였다. 기타 최적화된 MS/MS 분석 파라미터는 Table 1에 요약하였다.
- 전처리된 혈장 시료는 다음의 조건에서 정량하였다. 이동상으로는 1 mM 아세트산 암모늄 완충액과 아세토니트릴의 혼합용액(40/60, v/v)을 사용하였으며, formic acid를 전체 용액에 0.1 % 가 되도록 첨가하였다. 칼럼은 Thermo BetaBasic C18 (2.
- 채혈시간은 반감기의 3 배 이상인 36 시간 동안으로 하였고, 채혈 횟수는 약물투약 직전과 투약 후 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 10, 12, 24 및 36 시간에서 채혈하여 영하 70oC 에서 보관하였다.
- 최고혈장중농도 (Cmx) 와 최고혈장중농도 도달 시간 (Tmax)은 실측치로부터 직접 구하였고, 투약 후 마지막 채혈시간인 36 시간까지의 혈장중농도-시간곡선하 면적(AUCt)은 사다리꼴 공식에 의하여 BA Calc 2002 (Ver. 1.1.1, KFDA, Seoul, Korea) 프로그램을 이용하여 산출하였다.
- 여기에서 얻은 내부표준물질의 피크 면적에 대한 레르카니디핀의 피크 면적 비를 가지고 검량선을 작성하였다. 하루에 실험을 5 번 시행하여 일내 재현성과 정확성을 구하였고, 5 일간 실험을 반복 수행하여 일간 재현성과 정확성을 구하였다.
대상 데이터
- 사용하였다. HPLC 칼럼은 Thermo BetaBasic C18 (2.1x150 mm, 5 μ m, San Jose, CA, USA)을 사용하였으며, 데이터 처리장치로는 MassLynx(Vr. 4.1)를 사용하였다. 기타 장비로는 원심분리기(Micro-12, Hanil Science Industrial Co.
- m/z 238과 294의 생성에 대해서 Gibbons 등19-20은 수소화된 암로디핀 ion의 molecular rearrangement mechanism 이나 retro-Diels-Alder 반응에 의하여 형성된다고 제안하였다. 각각의 product ion scan을 통해, MRM mode에서의 정량을 위한 레르카니디핀과 암로디핀의 product ion 으로 가장 감도가 큰 m/z 280과 238을 각각 선정하였다.
- 본 연구에 사용한 HPLC 시스템으로 Waters 2795 Alliance HT (Milfold, MA, USA) 를, 탠덤 질량분석기 (MS/MS)는 Waters Quattro Micro (Milfold, MA, USA) 를 사용하였다. HPLC 칼럼은 Thermo BetaBasic C18 (2.
- Louis, MO, USA) 의 시판품을 구입하였다. 아세토니트릴과 메탄올, 물은 Fisher Scientific사 (Springfield, NJ, USA)의 HPLC급을 사용하였고, 아세트산 암모늄, formic acid 등의 기타 시약들은 특급 및 1급 시약들을 사용하였다.
- 염 산레르카니 디 핀 표준품은 대 원제 약(Seoul, Korea) 으로부터 제공받았으며, 내부표준물질로 사용한 암로디핀은 Sigam사(St. Louis, MO, USA) 의 시판품을 구입하였다. 아세토니트릴과 메탄올, 물은 Fisher Scientific사 (Springfield, NJ, USA)의 HPLC급을 사용하였고, 아세트산 암모늄, formic acid 등의 기타 시약들은 특급 및 1급 시약들을 사용하였다.
- 1 % 가 되도록 첨가하였다. 칼럼은 Thermo BetaBasic C18 (2.1x150 mm, 5 |im)을 사용하였으며 유속은 220 μL/min, 분석칼럼의 오븐 온도는 45oC 로 일정하게 하였다.
이론/모형
- 피크 검출은 triple-quadrupole mass spectrometer를 이용하여 MRM(multiple reaction monitoring) 방법으로 검 출하였다. 이 온화는 electrospray ionization (ESI) 을 이용하여 positive ion mode로 분석하였으며, nebulizing gas 는 질소를, collision gas 는 아르곤 가스를 사용하였다.
성능/효과
- 57 ng . hr/mL, Tmax는 1.0-3.0 hr, 그리고 t1/2 은 2.0-5.0 hr 인 것으로 되어 있어, 본 연구에서 산출한 약물동력학적 파라미터와 크게 차이가 없음을 확인할 수 있었다.
- 공혈장 시료, 내부표준물질만 가한 혈장시료 및 0.05, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 및 20 ng/mL의 검량선용 표준혈장 시료를 각각 전처리한 후 LC-MS/MS 로 분석하였을 때, 혈장시료로부터 구한 레르카니디핀 검량선의 계산식은 Y (레르카니디핀/내부표준물질 피크 면적의 비율) = 0*( .220425 레르카니디핀 농도, ng/mL) + 0.00186629 (r = 0.9994) 로 0.05-20 ng/mL 범위에서 양호한 직선성을 나타내었다
- 이러한 고전적인 방법은 간섭물질과 피크가 겹치면 정량이 불가능하였으므로, 복잡한 시료 매트릭스에서 정량할 경우에는 이동상의 조성을 조절하여 최대한의 분리도가 유지되도록 하였다. 그 결과 1개의 시료 당 분석시간이 10-20 분 이상이 되어야 분석의 정확성과 정밀성을 확보할 수 있었다. 전임상 또는 임상시험에서 의약품의 생체이용률 연구와 약물동력학 연구를 수행하기 위해서는 수백-수천 개의 생체시료 분석 이 이루어져야 하는데, 고전적인 HPLC-UV, TLC 방법으로 분석을 하기에는 낮은 선택성과 긴 분석 시간으로 인하여 적용하기가 매우 어려웠다.
- 05 ng/mL이었다. 따라서, 본 분석법은 전처리 방법의 효율성 측면과 시료량에 대한 분석감도면에서 기존에 보고된 방법에 비하여 매우 향상된 결과를 나타내었다.
- 2에 나타내었다. 레르카니디핀 피크의 유지시간은 약 2.3 분, 내부표준물질 암로디핀의 피크의 유지시간은 약 1.8 분이었으며, MS/MS 의 높은 선택성 때문에 분석물질에 방해되는 물질은 나타나지 않았다.
- 3 에 나타내었다. 본 분석조건에 의해서 레르카니디핀 20 mg을 경구투여한 후 반감기의 3배 이상인 36 시간까지 레르카니디핀의 혈장 중 농도를 측정할 수 있었다. 레르카니디핀의 혈장중농도-시간곡선하 면적 (AUC)는 24.
- 생체시료 분석법을 개발하였다. 이 분석법은 이미 보고된 분석법에 비교하여 시료 전 처리가 간단하고, 낮은 정량한계를 가지며, 생체시료 분석법으로서의 양호한 특이성, 직선성, 정확성 및 정밀성을 나타내었다. 이 분석법을 이용하여 36 명의 건강한 한국인 남성에게 염산레르카니디핀 20 mg을 투여하고, 혈장 중 레르카니디핀의 농도를 구하여 약물 동력 학연 구에 응용하였다.
- 8 %이 었다(Table 2). 이로부터 혈장 중 레르카니디핀에 대한 본 LC-MS/MS 분석법은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 충분한 감도와 특이성, 직선성, 정밀성 및 정확성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
- 05 ng/mL로 하였다. 최저 정량한계를 포함한 검량선 농도 범위에서 레르카니디핀의일내 및 일간 변동계수 (CV) 는 11.7% 이하로 나타났고, 정 확성은 94.4-114.8 %이 었다(Table 2). 이로부터 혈장 중 레르카니디핀에 대한 본 LC-MS/MS 분석법은 인체에 대한 생체이용률 시험에 이용될 수 있는 충분한 감도와 특이성, 직선성, 정밀성 및 정확성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
- 025 ng/mL 를 보고하였다. 하지만 본 연구에서 human plasma 시료 0.3 mL를 취하였고, 전처리로는 제단백(protein precipitation, PPT) 방식을 선택하여 LC-MS/MS로 분석한 결과, 정량한계가 0.05 ng/mL이었다. 따라서, 본 분석법은 전처리 방법의 효율성 측면과 시료량에 대한 분석감도면에서 기존에 보고된 방법에 비하여 매우 향상된 결과를 나타내었다.
후속연구
- 본 분석법을 혈장 중의 레르카니디핀 정량 및 한국인을 대상으로 한 약물동력학 연구에 성공적으로 적용하여 약물 동력학적 파라미터를 제시하였으며, 향후 임상시험 등의 관련분야에도 적용될 수 있으리라 사료된다.
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