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문제 정의
- 그러나 BHA와 BHT등의 합성 항산화제는 항산화력이 뛰어나 상업용 식품 및 의약품 등에 가장 많이 이용되고 있는 페놀계 항산화제이나 이들은 변이원성 및 독성의 유해성이 지적되고 있어 (32) 사용이 점차 감소하고 있는 추세이다. 따라서 본 연구에서는 기 연구 개발되어진 천연항산화제와 달리 천연 대나무 수액을 이용하여 보다 안전하고 독성이 없는 항산화성 효능분석을 통하여 천연 항산화 식품소재 활용을 위한 기초자료로 제공코자 하였다.
제안 방법
- 반응성 유해산소종의 양은 형광인지물질 (pK)be)인 2, , 7, - dichlorofluorecein diacetate (DCFH-DA) 를 well 당 25 pM로 처리하여 15분간 배양한 후 대나무수액과 세포내 생성된 산소라디 칼 (ROS)에 의 해 산화되 어 deacetylation되 면서 생성되는 "가 형광을 내는 물질로 전환되는 반응 즉, 지용성의 DCFH-DA가 esterase 또는 산화적 가수분해를 받아비형광성 인 DCFH로 탈아세틸화되며, DCFH는 활성산소에 의흐H 산화되어 강한 형광을 나타내는 2, , 7, - dichlorofluoiEcein (DCF)이 되는 것을 이용하여 excitation 파장 482 nm, emission 파장 530 nm에서 fluorescence를 측정하였다(33).
- 대나무수액의 항산화효과를 알아보기 위해 DPPH를 이용한 자유 라디칼 소거능 실험을 수행하였다. DPPH는안정 한 유리 기 로 cysteine, glutathione과 같은 함유황 아미노산과 ascorbic acid, aromatic amine 등에 의해 환원되어 탈색되므로 항산화물질의 항산화능 측정에 편리한 방법이며(34) DPPH 전자공여 작용은 활성 라디칼에 전자를 공여하여 식품중의 지 방질 산화를 억제하는 목적으로 사용하고 있을 뿐만 아니 라, 인체내에서 활성 라디칼에 의 한 노화를 억제하는 작용으로 이용되고 있는 연구 방법 이다(35).
- 대식세포의 일차 배양을 통해 산화적 자극물질인 H2O2 를 이용한 세포독성에 실험을 수행하였다. 산화적 자극에 의해 유발된 세포독성에 대한 대나무수액의 보호 효과를 확인한 결과 DPPH와 ROS측정 에 의해 유의한 효과를 나타내는 농도에서 산화적 자극에 의해 유발된 세포 독성이농도 의존적으로 감소하는 것을 확인 할 수 있었으며 (Fig.
- 또한 살아있는 세포에서의 항산화 능을 측정하기 위하여 DCFH-DA# 이용한 ROS를 측정하였다(Fig. 3). -O2, H2Q2를 포함하는 ROS는 생체내에서 지속적으로 생성되지만 적절하게 제어되지 않으면 축적되어서 단백질, 지질, 핵산 등에 손상을 야기하고(38, 39), 또한 노화과정에 중요한 역 할을 한다.
- 1 mM을 넣은 다음 시료를 농도별로 넣은 후 37 ℃ water bath에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 후동량의 TCA를 처 리하여 반응을 멈추고, 이물질을 침전시킨 후 2-thiobarbituric acid (TBA) 를 500 pL 넣어 과산화지 질의 분해 생성 물인 malondialdehyde와 TBA가 반응하도록 100 ℃에서 20 분간 가열 반응시 켜 생긴 TBA 반응산물 (TBA reactive substance)을 532 im에 서 흡광도를 측정 하였다.
- 실험에 이용되는 세포를 배양한 후 MTT labeling reagent 에 electron coupling reagent를 첨가하여 준비한 MTT labeling mixture를 각 well당 10 pL씩 (최 종농도 0.5 mg/mL) 4시간 처리한 후 550 nm 파장에서 흡광도를 이용하여 대나무 수액 자체의 세포독성을 조사하였다.
대상 데이터
- 대나무 (맹종죽, Phyllostachys pubescens) 수액 채취는 경남 사천시 곤양면 소재지에서 5월에 3〜4년생 대나무를 지면에서 2〜3번째 마디 부분을 자른 뒤 수액이 흘러나올 부분에 비닐 튜브를 씌워 12시간 정도 채취하였다. 채취한 수액은 동결 건조를 통해 분말화한 후 -20 ℃에 사용 전까지 보관하였다.
- 본 실험에 사용한 주요 시약으로 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM)과 fetal bovine serum (FBS)은 Gibco/BRL(Burlington, Ontario, Canada)사 제품을 이용하였고, Dimethyl sulfoxide (DMSO), isopropanol, triton, sodium bicarbonate, 3-[4, 5-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (MIT), Thiobarbituric acid (TBA), L-ascorbic acid, Ferrous sulfate, Hydrogen peroxide, 그리 고 기 타 시 약은 Sigma (St. Louis, MO)사 제품을 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험 결과들은 3반복을 수행하였으며, mean ± SD 로 나타냈고, 통계처리는 Duimetfs test를 실시하여 p < 0.05 를 기준으로 유의성 여부를 판정하였다.
성능/효과
- DPPH는안정 한 유리 기 로 cysteine, glutathione과 같은 함유황 아미노산과 ascorbic acid, aromatic amine 등에 의해 환원되어 탈색되므로 항산화물질의 항산화능 측정에 편리한 방법이며(34) DPPH 전자공여 작용은 활성 라디칼에 전자를 공여하여 식품중의 지 방질 산화를 억제하는 목적으로 사용하고 있을 뿐만 아니 라, 인체내에서 활성 라디칼에 의 한 노화를 억제하는 작용으로 이용되고 있는 연구 방법 이다(35). Fig. 1에 나타낸 것처럼 아무런 처리도 하지 않은 대조군에 비해 항산화제 인 ascorbic acid는 99.48 %의 강한 자유기 소거 효과를 보였고, 대나무수액 동결건조물 10 mg/mL에서는 21.67 %, 50 mg/tnL에서는 42.50 %, 그리고 100 ng/mL에서는 50.00 %의 활성을 보였지만 대나무수액 200 mg/mL에서는 70.83 %로 농도별 의 존적으로 free radical 소거 작용을 나타냈고, 대나무 수액 동결 건조물의 자유라디칼 소거능 DPPH 활성이 뛰어남을 알 수 있었다. Kim등(36)의 연구에서 맹종죽추출물이 in 와 in vivo에서 높은 항산화 효과를 나타낸다고 보고하였고, Kweon등(37)이 보고한 맹종죽 추출물에서도 강력한 항산화력이 있다는 연구와 일치하는 결과를 보였다.
- 이용한 세포독성에 실험을 수행하였다. 산화적 자극에 의해 유발된 세포독성에 대한 대나무수액의 보호 효과를 확인한 결과 DPPH와 ROS측정 에 의해 유의한 효과를 나타내는 농도에서 산화적 자극에 의해 유발된 세포 독성이농도 의존적으로 감소하는 것을 확인 할 수 있었으며 (Fig. 4) 과산화수소에 의해 야기되는 세포독성을 억제해주는 효과가 매우 뛰어난 것으로 나타났특히 고농도 (200 pg/mL) 에서 세포 손상 방지 효과가 크게 나타남을 확인하였다.
- 이상의 결과로부터 대나무수액이 안전하고 독성이 전혀 없는 천연 항산화제로서 이용 가능성이 높다는 것을 알 수 있었다. 결론적으로 본 연구결과 대나무수액이 DPPH radical scavenging activity, 세포독성, ROS 생성 및 지질 과산화 생성억제에 의해 측정된 결과를 보면 강한 항산화 효과를 가지므로 천연식품소재 및 화장품소재에도 적용될 수 있다고 사료된다.
- 쥐의 뇌를 이용한 항산화 효과를 지질과산화 방법을 통해 측정 한 결과 FeCh등에 의해 유발되어진 지질의 과산화 정도가 대나무수액 동결건조물을 10, 50, 100 및 200 ng/tnL 로 처 리하였을 때 대나무수액 농도에 따라 22.22 %, 26.67 %, 33.33 % 및 38.10 %의 지질과산화 생성억제를 나타내었다(Fig. 3). 이러한 결과로 대나무수액의 항산화효과를 다시 확인 할 수 있었다.
- 이들 활성 산소에 의 한 지 질과산화 결과 생성되는 지질과산화물을 비롯하여 여러 체내 과산화물도세포에 대한 산화적 파괴로 인한 각종 기능장애를 야기하며 (40) , 활성 산소종이 정상적으로 소거되지 않았을 때 잔존하는 자유 라디칼에 의해 산화적 스트레스를 받게 됨으로써 다른 질병의 원인이 되기도 하고, 식품에서도 부패와 독성물질 생성 등으로 유해한 작용을 하는 것으로 알려져 있다 (41) . 측정 결과 대나무수액 자체가 항산화 효과를 나타내어 활성에 영향을 미치는 것으로 간주되며, 이러한 결과로 미루어 대나무 수액은 노화 방지 및 피부노화 방지 화장품 소재로서의 가능성도 보여진다고 사료된다.
후속연구
- 있었다. 결론적으로 본 연구결과 대나무수액이 DPPH radical scavenging activity, 세포독성, ROS 생성 및 지질 과산화 생성억제에 의해 측정된 결과를 보면 강한 항산화 효과를 가지므로 천연식품소재 및 화장품소재에도 적용될 수 있다고 사료된다.
- 국내에서 수액으로 채취 가능한 수종은 고로쇠나무, 당단풍나무, 자작나무, 거제수나무, 박달나무, 물박달나무, 사스래나무와 대나무 (맹종죽, 왕대, 솜대) 등이며, 그 중 한국식품의약품안전청 으로부터 식 품원료 인증을 획 득한 수액은 3종으로 고로쇠수액, 자작나무수액, 대나무수액이다 (식품공전, 1998). 대나무수액은 생죽력이라고도 불리어 몸속의 노폐물을 씻어내고 혈압을 조절하는 등의 효력이 있다고 알려져 왔지만(9), 약리작용을 갖는 특수성분에 대한 추정만 이루어지고 있을 뿐 근거가 매우 부족하므로 대나무수액의 생리활성에 관한 과학적 규명 뿐만 아니라 가공방법의 부재와 그 효능이 과학적으로 증명되지 않아 높은 효용 가치에도 불구하고 농업적 소득에는 거의 도움이 되지 않고 있으므로앞으로도 많은 연구가 필요할 것으로 보인다. 현재까지 이루어진 대나무관련 연구로는 대나무의 성분분석(10) 및 항바이러스와 항암작용<11, 12), 대나무 열수추출물의 화학적 특성 및 항산화효과(13, 14), 대나무 잎의 생리활성 및 항균효과(15-20), 등이 보고된 바 있고, 대나무수액에 대한 연구는 수액의 채취량과 채취 방법 및 약수로의 이용 가능성 (21-23)에 대한 연구 정도만 행해지고 있는 실정이다.
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